実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系におけるリンパ球浸潤のフロー細胞量分析

私たちがここに提示するプロトコルは、リンパ球が中枢神経系自己免疫疾患の発症にどのように関与しているかを理解するのに役立ちます。この方法により、脳内のリンパ球を細胞ごとに研究することが可能である。このプロトコルは、免疫細胞の特性と機能を分析するために必要な他のモデルや中枢神経系疾患にも適用できます。

このビデオでは、プロトコルは簡単にモデルを誘導し、脳内の単一細胞を分離する方法を実証することができます。ペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、1ミリリットルの注射器を使用して、完全なフロイントアジュバントの100マイクロリットルで100マイクログラムの乳化MOG 35-55を麻酔下で麻酔C57BL/6マウスを首の近くの2つの異なる場所に注入します。同じ日と2日目の2回の後免疫で、腹腔内は、1マイクロリットル百日百日毒素働く溶液あたり1ナノグラムの200マイクロリットルをマウスに注入する。

2回目の注射の後、マウスを温かいパッドで自宅のケージに戻し、完全な再発まで監視します。翌日と病気の経過を通じて、表に概説されている神経学的徴候と体重の変化について、すべてのマウスを盲目的に調べ、評価する。適切な実験エンドポイントで、鼻から首に慎重に頭蓋骨を切断し、RPMI培地の10ミリリットルを含む個々の50ミリリットルのチューブに頭蓋箱から各動物の脳を移す。

接着性の赤血球を除去し、吸引によって培地を除去するためによくチューブを混ぜます.各チューブに新鮮な媒体の10ミリリットルを追加し、個々の100ミリメートルの皿に脳を転送します。最後に、カミソリで各脳を切り刻み、プラスチックピペットを使用して、一度に1皿から同じくらい多くの組織を、6ミリリットルの媒体を氷冷7ミリリットル中心ガラスホモジナイザーに移します。

密閉器を使用して、懸濁液が均一になるまで組織を持って来る前に、害虫の緩いプランジャーを使用して脳を粉砕します。その後、得られた組織スラリーを氷の上の冷蔵15ミリリットル円錐管に注ぎます。すべてのサンプルが均質化されたら、各チューブの体積を新鮮な媒体で7ミリリットルに調整してから、各組織懸濁液をチューブあたり100%基底膜マトリックスの3ミリリットルを含む新しい冷やされた15ミリリットルチューブに追加します。

数回反転によって混合し、慎重かつゆっくりと各組織溶液サンプルの下に70%の密度の勾配溶液の1ミリリットルを追加するために3ミリリットルのピペットを使用しています。密度勾配遠心分離によって細胞を分離し、上層のほぼすべてを除去し、ミエリンのすべてを完全に除去するように注意してください。新しい15ミリリットルのチューブにインターフェイスを転送し、新鮮な媒体で10ミリリットルに音量を調整します。

その後、サンプルを再び遠心分離し、上清を取り除き、チューブあたり約100マイクロリットルの培地でペレットを再懸濁します。採取した脳細胞のフローサイトメトリック解析では、培地の100マイクロリットルの6細胞に約2倍の10を割り当てて、96ウェルプレートの個々のウェルに割り当てます。すべての細胞がメッキされたら、500X細胞刺激カクテルとタンパク質輸送阻害剤の100マイクロリットルをウェルに加え、細胞培養インキュベーターにプレートを4時間置きます。

インキュベーションの終わりに遠心分離によってウェルの底部の細胞をプールし、ウェルあたり100マイクロリットルのフローサイトメトリーバッファーでペレットを再懸濁する。3マイクロリットルの抗マウスCD16/CD32 Fcブロックを3マイクロリットルの4°Cで10分間培養してから染色します。非特定の Fc 媒介相互作用をブロックする。

インキュベーションの終わりに、目的の抗体カクテルを各ウェルに加え、プレートを光から保護された摂氏4度に置きます。30分後、ウェルあたり100マイクロリットルのフローサイトメトリーバッファーでウェルを洗浄し、遠心分離によって細胞を沈下します。上清を捨て、各ウェルに細胞内固定バッファーの200マイクロリットルを加えます。

室温で30〜60分のインキュベーション後、遠心分離によってサンプルを収集し、ウェルあたり1X透過性バッファーの200マイクロリットルでペレットを再懸濁します。再度サンプルを遠心分離し、上清を捨て、ペレットを新鮮な透過バッファーで100マイクロリットルに再懸濁する。次に、対象となる細胞内抗原を検出するための適切な抗体を加えて、光から保護された摂氏4度で30分間インキュベーションを行います。

インキュベーションの終了時に、1X透過バッファーの100マイクロリットルを各ウェルに加え、遠心分離によってサンプルをスピンダウンします。次いで、200マイクロリットルのフローサイトメトリー染色バッファーで染色細胞を再懸濁し、標準的なプロトコルに従ってフローサイトメトリーによって細胞を分析する。EAEの典型的な臨床コースは、図示のように疾患曲線および体重の変化をもたらすべきである。

MOG 35-55で免疫されたC57BL/6マウスは、通常、10〜12日目頃に疾患症状を発症し始め、15日目から21日目頃に疾患のピークを達成する。病気が発症する前に、予防接種されたマウスの体重は、増加する疾患症状との相関関係が低下する前に徐々に増加し、マウスはEAEのピーク時に最も低い体重を示し、臨床症状が減少するにつれて体重はわずかに回復する。しかし、マウスは通常完全には回復せず、通常は単橋性慢性疾患病理を発症する。

この代表的な流れ解析が示すように、インターフェロンγ産生Th1およびIL17産生Th17細胞はEAEマウスにおいて有意に増加している。最も重要なステップは3.10です。オペレータは中間層と光を転送する必要があります, 慎重に、できるだけ少ない他の層を取ります.

これらのプロトコルに従って、我々はさらにTリンパ球を研究するためにさらなる転写分析を行うことができる