Name: MeCP2タンパク質変異体に対するエレクトロケミセンスベースアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 学ぼう、エレクトロケミルミネッセンスイムノアッセイ（ECLIA）を用いてMeCP2タンパク質変異体を定量する方法。ウェスタンブロットやELISAよりも高速で高感度な神経科学研究の新たな手法です。

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ブリジット・シュトゥルム博士がECLIAの楽器を支えてくれたことにとても感謝しています。

研究目的での皮膚生検調達の承認は、オーストラリアのウェストミードにある小児病院の人間研究倫理委員会から得られました。動物実験の同意は、オーストリア連邦科学研究経済省から取得され、地元の動物福祉規制に従って実施されました(GZ:66.009/0218-II/3b/2015)。
注: ECLIA システムの原理は図1に示されています。
1. 抗体の選択
<ol><li>様々なMeCP2抗体の範囲のシグナル対雑音比を評価し、一次マウスモノクローナルMeCP2抗体(クローンMec-168)とウサギポリクローナルMeCP2検出抗体(カスタムメイド)の組み合わせ内で最良のシグナル強度と最高特異性を同定します。二次抗体については、実験的に検証されたシステム特異的抗体(材料表)を用いた。 注:表 1は、MeCP2-ECLIA の開発中に検証されたすべての抗体とその試験希釈範囲の概要を示しています。</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>関数</td>
			<td>名前</td>
			<td>クローン</td>
			<td>希釈</td>
		</tr>
<tr>
<td>プライマリ</td>
			<td>マウス、抗MeCP2</td>
			<td>メック-168</td>
			<td>1:500-1:10,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>プライマリ</td>
			<td>マウス、抗MeCP2</td>
			<td>4B6</td>
			<td>1:250-1:4,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>プライマリ</td>
			<td>マウス、抗MeCP2</td>
			<td>男性-8</td>
			<td>1:500-1:4,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>プライマリ</td>
			<td>マウス、抗MeCP2</td>
			<td>1B11</td>
			<td>1:500-1:4,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>プライマリ</td>
			<td>ウサギ、抗MeCP2</td>
			<td>D4F3</td>
			<td>1:500-1:4,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>セカンダリ</td>
			<td>ウサギ、抗MeCP2</td>
			<td>ポリクローナル</td>
			<td>1:2,000-1:20,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>セカンダリ</td>
			<td>ウサギ、抗MeCP2</td>
			<td>ポリクローナル</td>
			<td>1:2,000-1:20,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>検出</td>
			<td>スルフォタグラベル付抗ウサギ</td>
			<td>ポリクローナル</td>
			<td>1:500-1:1,000</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:抗体および使用される働き希釈剤のリスト。
<ol start="2"><li>あるいは、従来のELISAとうまく機能するMeCP2抗体の各ペアを使用してください。</li>
</ol>2. TAT-MeCP2融合タンパク質によるHDFの治療
注:TAT-MeCP2は、エシェリヒア・コリで組換え発現し、前に説明した8の標準的なクロマトグラフィー技術を用いて精製し、-80°Cで保存しました。
<ol><li>プレート 1 x 106ヒト皮膚線維芽細胞 (HDF) 細胞を 100 mm 皿に入れ、5% CO2で一晩 37 °C で細胞を成長させ、約 90% の合流度に達します。</li>
	<li>TAT-MeCP2融合タンパク質のバイアルを1個取り出します。氷の上で解凍し、穏やかに混ぜます。</li>
	<li>TAT-MeCP2をHDF培養培地の50mLで500 nMの最終濃度に希釈します。</li>
	<li>100 mmの皿から培地を取り出し、37°Cで500 nM TAT-MeCP2で細胞を24時間まで様々なインキュベーション期間にインキュベートします。</li>
	<li>TAT-MeCP2 溶液をセルから削除します。あらかじめ温められたダルベッコのリン酸緩衝生理食塩(DPBS)で細胞2倍を洗浄します。</li>
	<li>37 °C10で5分間0.05%トリプシン-EDTA溶液の2 mLで細胞を治療します。</li>
	<li>6 mLのHDF培養培地を添加してトリプシンを不活性化し、15 mLチューブ内の細胞を収集します。</li>
	<li>ペレット細胞は、室温で5分間500xgで遠g心分離して細胞をペレット化した。</li>
	<li>上清を取り除き、氷冷DPBSで細胞2倍を洗います。ペレットを氷の上に保管し、サンプル調製に進みます。</li>
</ol>3. サンプル準備
<ol><li>HDFライセート<ol>
<li>スズキら11によれば細胞質および核下膜内への細胞内分画のためのREAP法を用いてMeCP2の最高タンパク質レベルを決定する。分数を実験ごとに 6 個以下のサンプルに制限します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マウスの脳のライセート<ol>
<li>各低張性リシス試薬および抽出バッファーの 100 mL を調製します。<ol>
<li>低張性のリシス試薬の場合は、10 mM HEPES、1.5 mM塩化マグネシウム、10 mMの塩化カリウムをよく混ぜます。</li>
			<li>抽出バッファーの場合は、20 mM HEPES、1.5 mM 塩化マグネシウム、0.42 M 塩化ナトリウム、0.2 mM EDTA、および 25% (v/v) グリセロールをよく混ぜます。</li>
			<li>両方のバッファーの pH を 7.9 に調整します。</li>
			<li>1 mMジチオスレイトール(DTT)と1xプロテアーゼ阻害剤カクテルを両方のバッファーに新たに加えます。使用前に氷の上で冷やします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>全マウス脳(株:C57BL/6J、野生型男性と女性、B6.129P2(C)-Mecp2tm1.1Bird/J、ヘミジグウス男性およびヘテロ接合雌;年齢:4〜8週齢)の全マウス脳(株:C57BL/6J)を1mLの氷冷低血圧リシス試薬で中断する。</li>
		<li>ホモジナイザーA(緩い、大きなクリアランスのために)とB(狭い、小さなクリアランスのために)の15ストロークによって、事前に冷却されたDounceオールガラス組織ホモジナイザーで脳を均質化する。</li>
		<li>均質化した細胞をクリーンチューブに移し、4°Cで20分間10,000 x gで遠心分離機を送ります。上清を捨てる(または、さらなる使用のためにサイトプラズマ分画として保管する)。</li>
		<li>出発原料の100mgあたり140μLの抽出バッファーでペレットを再懸濁します。チューブをあらかじめ冷却したサーモブロックに入れ、4°Cで30分間軽く混ぜます。</li>
		<li>チューブを16,000gで4°Cで10分間遠心分離します。上清(すなわち、核分率)を新しい前冷蔵チューブに移し、使用するまで-80°Cで保管します。 注:マウス脳およびHDFに由来するライゼートのタンパク質濃度は、BCAタンパク質アッセイによって評価することができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. MeCP2-ECLIA プロトコル
<ol><li>洗浄液の調製、ブロッキング緩衝液およびアッセイ希釈液(1日目)<ol>
<li>500 μLの Tween 20 ~ 1 L の PBS を加えて、PBS 溶液に 0.05% Tween 20 を準備し、激しく混ぜ合わせて「洗浄液」とラベルを付けます。 メモ:準備したての洗浄バッファのみを使用するようにしてください。</li>
		<li>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3%ブロッカーA(材料表)のブロッキング溶液を調製します。穏やかな攪拌で混ぜ、殺菌し、最大2週間使用するまで冷蔵庫に保管します。</li>
		<li>PBSの10 mLに5mLのブロッキング溶液を加え、アッセイ希釈液(PBS中の1%ブロッカーA)を調製する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>高結合プレートのコーティング<ol>
<li>96ウェルマルチアレイシングルスポット高バインドプレートを取り出します。 注:高結合プレートは、結合能力が高く、疎水性表面を持つ標準プレートよりもダイナミックレンジが大きくなります。</li>
		<li>モノクローナルマウス抗MeCP2抗体を氷上で解凍し、抗体の0.67 μLを4 mLのPBS(PBSで1:6,000抗体希釈)と混合します。ボルテックス抗体溶液を良好に混合し、チューブを「コーティング溶液」としてラベル付けする。</li>
		<li>マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルの下隅に25 μLのコーティング溶液を慎重に分配します。これを溶液コーティング法と呼んでいます。コーティング液が各ウェルの底部を覆っていることを確認するために、両側の96ウェルプレートを軽くタップします。</li>
		<li>粘着ホイルでプレートを密封し、一晩(12-16時間)4°Cで冷蔵庫にプレートをインキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ブロック(2日目)<ol>
<li>冷蔵庫から皿を取り出し、ホイルを取り出します。</li>
		<li>抗体コーティング液をゴミ箱にフリックして取り出し、ペーパータオルのプレートをタップしてウェルからすべてのコーティング溶液を取り除きます。</li>
		<li>1ウェルあたり125μLのブロッキングソリューションを追加します。プレートをもう一度シールし、軌道マイクロプレートシェーカーに置きます。</li>
		<li>800 rpmで一定の揺れを保ち、室温で90分間プレートをインキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>標準およびサンプルの準備<ol>
<li>インキュベーションの時間中に、MeCP2および/またはTAT-MeCP2タンパク質標準および様々なサンプルを準備してください。 注: 標準希釈に使用する Lysis バッファーは、分析されたサンプルで使用されるリシス バッファーと同じである必要があります。</li>
		<li>MePC2および/またはTAT-MeCP2タンパク質ストック溶液(250 μg/mL)、マウス脳溶解物、HDF溶解液を-80°Cから取り出します。氷の上でそれらを解凍します。</li>
		<li>表2に従って、標準ストック溶液(MeCP2および/またはTAT-MeCP2)をクリーンチューブで希釈します。</li>
		<li>サンプルをリシスバッファーで希釈する:25μLのリシスバッファーあたり1-20 μgのマウス脳リゼート、および25μLのリシスバッファーあたり0.25-1 μgのHDFリセートを、リシスバッファーの25 μLあたりにします。各サンプルの十分な量を準備して、三重で分析を行います。</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>標準</td>
			<td>濃度</td>
			<td>希釈</td>
		</tr>
<tr>
<td>標準 1</td>
			<td>1,800 ng/mL</td>
			<td>1.08 μL 標準ストックソリューション + 148.92 μL 溶解バッファー</td>
		</tr>
<tr>
<td>スタンダード2</td>
			<td>600 ng/mL</td>
			<td>50 μL 標準 1 + 100 μL リシスバッファー</td>
		</tr>
<tr>
<td>スタンダード3</td>
			<td>200 ng/mL</td>
			<td>50 μL 標準 2 + 100 μL リシスバッファー</td>
		</tr>
<tr>
<td>スタンダード4</td>
			<td>66.67 ng/mL</td>
			<td>50 μL 標準 3 + 100 μL リシスバッファー</td>
		</tr>
<tr>
<td>スタンダード5</td>
			<td>22.22 ng/mL</td>
			<td>50 μL 標準 4 + 100 μL リシスバッファー</td>
		</tr>
<tr>
<td>スタンダード6</td>
			<td>7.41 ng/mL</td>
			<td>50 μL 標準 5 + 100 μL リシスバッファー</td>
		</tr>
<tr>
<td>スタンダード7</td>
			<td>2.47 ng/mL</td>
			<td>50 μL 標準 6 + 100 μL リシスバッファー</td>
		</tr>
<tr>
<td>スタンダード8</td>
			<td>0.82 ng/mL</td>
			<td>50 μL 標準 7 + 100 μL リシスバッファー</td>
		</tr>
<tr>
<td>スタンダード9</td>
			<td>0.27 ng/mL</td>
			<td>50 μL 標準 8 + 100 μL リシスバッファー</td>
		</tr>
<tr>
<td>標準 10</td>
			<td>0 ng/mL</td>
			<td>150 μL のリシスバッファー</td>
		</tr>
</tbody></table>表2:0から1,800 ng/mLまでの標準シリーズ。
<ol start="5"><li>サンプルと標準ソリューションの追加<ol>
<li>ブロック溶液をゴミ箱にフリックして取り出し、ペーパータオルのプレートをタップして、すべてのブロッキング溶液を井戸から取り除きます。</li>
		<li>洗浄液を加えてすぐに取り除いて、150μLの洗浄液でプレート3xを洗浄します。</li>
		<li>単一のチャネルピペットを使用して、ウェルの下隅に25 ulの標準とサンプルを追加します。</li>
		<li>プレートを密封し、800rpmで一定の揺れを保って室温で4時間プレートをインキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>標識されていない検出抗体<ol>
<li>ポリクローナルウサギ抗MeCP2抗体を氷上で解凍します。抗体を1:6,000のアッセイ希釈液で希釈します。</li>
		<li>ゴミ箱にフリックして標準とサンプルを取り除き、ペーパータオルのプレートをタップします。</li>
		<li>洗浄液を加えてすぐに取り除いて、150μLの洗浄液でプレート3xを洗浄します。</li>
		<li>マルチチャネルピペットを用いて、25 μLの非標識検出抗体を各ウェルに添加します。プレートを密封し、室温で800rpmで一定の揺れをして1時間インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>特異的共役抗体<ol>
<li>特定の二次抗体(材料表)を冷蔵庫から取り出し、氷の上に置きます。抗体1:666.67をアッセイ希釈液で希釈し、軽く混ぜます。</li>
		<li>廃棄バスケットにフリックして、ラベル付けされていない無料の二次抗体を取り出し、ペーパータオルのプレートをタップします。</li>
		<li>洗浄液を加えてすぐに取り除いて、150μLの洗浄液でプレート3xを洗浄します。</li>
		<li>マルチチャネルピペットを用いて、各ウェルに25μLの特異的共役抗体(材料表)を加えます。プレートを密封し、室温で800rpmで一定の揺れをして1時間インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プレートを読む<ol>
<li>廃棄バスケットにフリックしてフリーコンジュゲート抗体(材料表)を取り出し、ペーパータオルのプレートをタップします。</li>
		<li>150 μLの洗浄液でプレート3xを洗います。</li>
		<li>1x Trisベースのゴールド読み取りバッファー(材料表)の150 μLを加え、トリプロピルアミンを含む界面活性剤をプレートへの光生成のための共反応剤として追加します。逆ピペット技術を使用して、気泡を避けてください。</li>
		<li>プレートをマイクロプレート検出プラットフォーム(材料表)に置き、すぐに測定を開始します。96 ウェルプレート取得の設定を使用します。</li>
		<li>電気化学発光検出システム(表)で内蔵CCDカメラで電気化学発光信号をキャプチャし、相対光ユニット(RLU)に対応し、光の強度に直接比例する信号数を記録します。 注:電気化学的刺激の際、炭素電極に結合したルテニウムラベルは、620nmで発光光を発します。計測器付属のソフトウェア(資料一覧)を使用してデータを分析します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

内因性MeCP2、組換えMeCP2およびTAT-MeCP2レベルを測定するために、96ウェルプレートECLIAが開発されました。MeCP2タンパク質機能の喪失は、現在、治療が症状管理および理学療法に限定されているRTT症候群6につながることが示されている。1つの有望な治療手段は、MeCP2レベルが必要な,濃度12、13、14、15,13まで滴定することができる、いわゆるタンパク質補充療法,14です。TAT融合タンパク質が血液脳関門を越える可能性は、過去20年間で成功することが証明されています12,,13,,14,,<sup cla...

エレクトロケミフルミネッセンスイムノアッセイ(ECLIA)は、電気化学的に刺激された際に発光を放出するように設計されたラベルを利用するプロセスに基づいています。これは、基礎産業および学術研究、食品産業、ならびに臨床診断における生物学的分析物の定量的検出のための広く適用可能な技術である1.一般的に、カーボンインク電極を備えた使い捨て可能な96ウェルプレートが使用されます。これらの電極は、免疫測定のための固相担体として機能する。二次抗体は電気化学発光ラベルに結合され、電気がシステムに適用されると、化学ラベルの発光がトリガされます。超低雑音電荷結合装置(CCD)は、捕捉抗体に結合した抗原に直接比例する光強度を記録し、その結果、試料2の標的検体の定量化を行う。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)と比較して、ECLIAは高感度、再現性、ならびにより優れた自動化および一貫性を提供するので有利であると考えられる3。
ここでは、新開発のECLIAシステムを用いて、ヒトおよびマウス由来のサンプルおよび組換えタンパク質の異なる変異体におけるメチルCpG結合タンパク質2(MeCP2)レベルを分析した。MecP2は、メチル化DNA配列と相互作用することが知られているX結合型核酸結合タンパク質である。このタンパク質は、遺伝子発現44,55の調節に関与している。このタンパク質をコードする遺伝子の機能喪失変異は、Tett症候群(RTT)を引き起こす主な原因である、重度の神経発達障害6である。別のMeCP2関連障害、MECP2重複症候群は、RTT 7のものと重なり合う神経学的症状にもつながりる。特に、女性は主にRTTの影響を受け、男性は主にMECP2複製症候群66、77に苦しんでいます。
これらの障害は、中枢神経系(CNS)においてそれぞれ不十分または過剰なMeCP2レベルに関連している。したがって、CNSでMeCP2レベルを増加させるRTTの治療オプションは、MeCP27の過剰に関連する有害な影響を避ける必要があります。この事実により、ECLIAシステムによって提供されるMeCP2タンパク質レベルの高感度かつ正確な定量化は、RTTの進歩とMECP2重複症候群の研究にとって非常に重要です。ヒト細胞株およびマウス組織サンプルからの内因性および外因性MeCP2レベルの正確な測定と、ヒトMeCP2アイソフォームB(アイソフォームe1とも呼ばれる)からなる組換えタンパク質、および血液脳関門8を横断する可能性を有する最小N末端HIV-TAT伝達ドメイン(TAT-MeCP2)が提示される。

<table><tbody><tr><td>1,4-ジチオスレイトール (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td>低張溶解試薬、抽出バッファー</td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Dye 試薬濃縮</td>物 <td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td><td>500-0006</td><td>サンプル調製</td></tr><tr><td>検出 AB SULFO-TAG標識抗ウサギ</td><td>メソスケール診断</td><td>R32AB-1</td><td>抗体</td></tr><tr><td>検出ワークベンチ 4.0</td><td>メソスケール検出</td><td></td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>DMEM (1X)</td><td>gibco by Life Technologies</td><td>41966-029</td><td>サンプル調製</td></tr><tr><td>ダルベッコs PBS (滅菌)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>サンプル調製、洗浄液、コーティング液</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>抽出バッファー</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td>サンプル調製</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td>抽出バッファー</td></tr><tr><td>ゴールドリードバッファー T (1x) 界面活性剤配合</td><td>メソスケール診断</td><td>R92TG</td><td>MeCP2 ECLIA プロトコル</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>低張溶解試薬、抽出バッファー</td></tr><tr><td>KIMBLE Dounce ティッシュグラインダーセット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8938</td><td>サンプル調製</td></tr><tr><td>ラボラトリーシェーカー、ロッキングモーション (低速)</td> <td>GFL</td><td>3014</td><td>MeCP2 ECLIA プロトコル</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物 (MgCl*6H20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>低張溶解試薬、抽出バッファー</td></tr><tr><td>MeCP2 (ヒト) 組換えタンパク質 (P01)</td><td>アブノバコーポレーション</td><td>H00004204-P01</td><td>細胞治療</td></tr><tr><td>Microseal B seal</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td><td></td><td>プレートシーリング用</td></tr><tr><td>MSB1001モノクローナル抗MeCP2、マウス、クローンMec-168、精製免疫グロブリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6818-100ULで産生。RRID:AB_262075</td>抗体<td>、コーティング溶液</td></tr><tr><td>MSDブロッカーA</td><td>メソスケール診断</td><td>R93BA-4</td>ブ<td>ロッカー</td></tr><tr><td>MSD SECTOR イメージャー 2400</td><td>メソスケール診断</td><td>I30AA-0</td><td>MeCP2 ECLIAプロトコル</td></tr><tr><td>マルチアレイ96ウェルプレート</td><td>メソスケール診断</td><td>L15XB-3/L11BX-3</td><td>MeCP2 ECLIAプロトコル</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>ライフサイエンス社</td><td>15140122</td><td>サンプル調製</td></tr><tr><td>ポリクローナル抗MeCP2、ウサギ</td><td>Eurogentec S.A.</td>で生産<td>カスタムデザイン</td><td>抗体</td></tr><tr><td>塩化カリウム(KCl)</td><td>Merck KGaA</td><td>1049361000</td><td>Hypotonic lysis reagent</td></tr><tr><td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB1404063;RRID:AB_10737296</td><td>抗体</td></tr><tr><td>初代ABマウス、抗MeCP2(4B6)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WH0004204M1;RRID:AB_1842411</td><td>抗体</td></tr><tr><td>一次ABマウス、抗MeCP2(Mec-168)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6818;RRID:AB_262075</td><td>抗体</td></tr><tr><td>初代ABマウス、抗MeCP2(Men-8)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7443;RRID:AB_477235</td><td>抗体</td></tr><tr><td>一次ABウサギ、抗MeCP2(D4F3)</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>3456S;RRID:AB_2143849</td><td></td></tr>抗体<tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル(100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8340</td><td>Hypotonic lysis reagent, Extraction</td></tr><tr><td>Buffer Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2</td><td>Eurogentec S.A.</td><td>カスタム</td><td>抗体</td></tr><tr><td>二次 AB, ウサギ, 抗 MeCP2</td><td>メルク</td><td>07-013</td><td>抗体</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>抽出バッファー</td></tr><tr><td>SULFO-TAG 標識抗ウサギ抗体 (ヤギ)</td> <td>メソスケール</td><td>診断 W0015528S</td><td>抗体</td></tr><tr><td>TAT-MeCP2 融合タンパク質</td><td>社内生産</td><td></td><td>細胞治療</td></tr><tr><td>トリプシン EDTA 0.25% (1X)</td><td>gibco by Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>細胞治療</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td>洗浄液</td></tr></tbody></table>

mecp2タンパク質変異体に対するエレクトロケミセンスベースアッセイ

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

ECLIAは、96ウェル形式で内因性および組換えタンパク質量を定量化することができる汎用性の高い方法です。ECLIAの効率を実証するために、このアッセイは、マウス脳組織におけるMeCP2の本質的なレベルとヒト真皮線維芽細胞におけるTAT-MeCP2の取り込みの分析に使用された。MeCP2-ECLIAは、低いイントラおよびインターアッセイ誤差で、高精度で再現性の高い測定を行います。要約すると、高スループットスクリーンで利用できるMeCP2タンパク質変異体の定量的手法を開発しました。

ECLIA システムの原理は図 1に説明されています。図2に、2 つの MeCP2 バリアントの標準曲線を示します。幅広い濃度(1-1,800 ng/mL)で正確な定量が可能でした。図3では、マウス脳およびHDFに由来するライセートのMeCP2レベルを分析した。図3Aでは、ヘテロ接合、野生型およびノックアウトマウス由来の脳核ライゼートにおけるMeCP2発現を比較したが、図3BではECLIAを用いたMECP2欠損ヒト線維芽細胞(c.806delG)ではMeCP2タンパク質が検出されなかった。MECP2欠損セルライン(c.806delG)によるTAT-MeCP2の取り込みも経時に調査された(図4)。最後に、表3に示すように、相互アッセイとイントラアッセイ...

エレクトロケミ発光免疫測定法(ECLIA)は、内因性および外因的に適用されたMeCP2タンパク質変異体の定量的検出のための新しいアプローチであり、幅広い作業範囲での低いイントラおよびインターアッセイ誤差で定量的、正確、再現性の高い測定を行います。ここでは、96 ウェル形式での MeCP2-ECLIA のプロトコルについて説明します。

MeCP2タンパク質変異体に対するエレクトロケミセンスベースアッセイ

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

ECLIAは、MeCP2の細胞レベルを定量化するシンプルで効率的な方法です。ECLIAは、ウェスタンブロットやELISAなどの他の定量方法と比較して、高速で、より敏感で、扱いやすくなります。PBSで0.5%Tween 20である洗浄液を調製するには、500マイクロリットルのTween 20をPBSの1リットルに加え、激しく混合する。3%ブロッカーAとPBSのブロッキング溶液を調製し、穏やかにかき混ぜます。ろ過によりブロッキング溶液を殺菌する。アッセイ希釈液を調製するために、1%ブロッカーA、およびPBS、10ミリリットルのPBSに5ミリリットルのブロッキング溶液を加える。次に、モノクローナルマウスの抗MeCP2抗体を氷上で解凍する。0.67マイクロリットルの抗体を4ミリリットルのPBSと混合し、溶液をボルテックスします。96ウェル高結合プレートを溶解するには、マルチチャネルピペッタを使用して、各ウェルの下隅に25マイクロリットルのコーティング溶液を慎重に分配します。コーティング溶液が各ウェルの底部を覆うことを確認するために、両側に穏やかに96ウェルプレートをダブ。粘着ホイルでプレートを密封し、摂氏4度で一晩インキュベートします。冷蔵庫から96ウェルプレートを取り出し、ホイルを取り外します。廃容器にフリックして、ウェル内の抗体コーティング溶液を除去します。その後、ペーパータオルのプレートをタップして、残りの溶液を取り除きます。次に、各ウェルに125マイクロリットルのブロッキング溶液を加えます。その後、粘着ホイルでプレートを再び密封します。プレートを軌道マイクロプレートシェーカーに置き、800 RPMに設定し、室温で90分間インキュベートします。MeCP2またはTat-MeCP2タンパク質ストック溶液、マウス脳溶解物、およびHDF溶解物の氷上の1バイアルで解凍する。原稿の表2に記載されているように、きれいなチューブでタンパク質ストック溶液を希釈します。次に、ライセートサンプルを希釈します。マウスの脳のライゼの場合は、25マイクロリットルのライシスバッファーあたり1〜20マイクログラムを使用してください。HDFライセートの場合、25マイクロリットルのライシスバッファーあたり1マイクログラムに0.25を加えます。96ウェルプレートを90分間インキュベートした後、廃棄物容器にフリックして、ブロッキング溶液をウェルから取り除きます。その後、ペーパータオルのプレートをタップして、残りの溶液を取り除きます。次いで、150マイクロリットルの洗浄液でプレートを3回洗浄し、洗浄液を添加し、直ちに除去する。96ウェルプレートの井戸に25マイクロリットルの標準とサンプルを加えます。プレートを密封し、一定の800 RPMの揺れで室温でさらに4時間インキュベートします。非標識検出抗体、ポリクローナルウサギ抗MeCP2を氷上で解凍します。アッセイ希釈液を用いて、抗体を1~6,000の割合で希釈する。96ウェルプレートがシェーカーでのインキュベートを終了したら、プレートを廃棄物容器にフリックして標準とサンプルを取り除きます。その後、ペーパータオルのプレートをタップして、残りの溶液を取り除きます。洗浄液を加えてすぐに取り除いて、150マイクロリットルの洗浄液でプレートを3回洗います。マルチチャネル・ピペッタを用いて、25マイクロリットルの未標識検出抗体溶液を各ウェルに加えます。プレートを密封し、800 RPMで一定の揺れで室温で1時間インキュベートします。冷蔵庫から特異的な二次抗体を入手し、1つの氷を置きます。二次体をアッセイ希釈液で希釈し、軽く混ぜます。96ウェルプレートから無ラベル検出抗体を除去するには、廃棄物容器にフリックし、ペーパータオルのプレートをタップします。プレートを浸透して3回洗浄した後、マルチチャネルピペッタを用いて各ウェルに25マイクロリットルの二次抗体を加える。プレートを密封し、800 RPMで一定の揺れで室温で1時間インキュベートします。廃容器にフリックしてペーパータオルのプレートをタップし、前述のようにプレートを3回洗浄して、無料の二次抗体を取り除きます。プレートの各ウェルに、1X Trisベースゴールドリードバッファーの150マイクロリットルを界面活性剤付き、光発生用のコアラクタントとして含みます。気泡を発生させないために、逆ピペット法を使用してください。96ウェルプレートを電気化学発光検出システムを備えたマイクロプレートプラットフォームに配置します。内蔵のCCDカメラを使用して、すぐにデータのキャプチャを開始します。相対光単位に対応し、光の強度に直接比例する記録信号数。MeCP2標準曲線は、ヒトMeCP2から複数の測定で生成された。ECLIAは、1ミリリットル当たり1ナノグラムから1ミリリットル当たり1800ナノグラムまでの範囲で、組み換えヒトMeCP2を正確に定量することができます。ECLIAを用いて、MeCP2タンパク質レベルをヘテロ接合マウスおよび雌野生型マウスおよび1つのMeCP2ノックアウトマウスから脳核ライセートで測定した。ECLIAは、健康なコントロールから、およびレット症候群のモデルとして使用されるc.806delG細胞株から細胞ライセートに行われた。ECLIAまたは免疫蛍光によって変異細胞株中でMeCP2タンパク質が検出されなかった。ECLIAは、MeCP2欠損セルライン残業によるTat-MeCP2の取り込み調査にも使用されました。ECLIAインターアッセイとイントラアッセイ精度は3日間連続して決定した。将来のタンパク質置換療法のために、MeCP2の送達はECLIAによるタンパク質レベル評価に続いて繰り返し最適化することができる。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

43分子標的までの同時検出のための安価な、高スループットの方法が記載されている。 mPCR /...

マルチプレックスPCRおよび逆ラインブロットハイブリダイゼーションアッセイ（mPCR / RLB）

このビデオでは、さまざまなサンプルの標的タンパク質レベルを定量するための電気化学発光イムノアッセイを実演します。このアッセイは、電気化学反応で生成される発光に基づいています。放出される光の強度は、サンプル中の標的タンパク質の量に比例します。...

脳溶解物中の標的タンパク質レベルの定量のための電気化学発光アッセイ

このビデオでは、免疫沈降したライセートの化学発光に基づくウェスタンブロッティングについて説明しています。この技術は、タンパク質のプロセシングと活性化を決定するのに役立ちます。検出される化学発光シグナルは、その活性化中のタンパク質プロセシングのレベルに比例します。...

タンパク質プロセッシングのための化学発光ウェスタンブロットアッセイ

複雑な生体試料中のバイオマーカーの測定はますます意思決定臨床指導されています。私たちは、同時に心臓ミオシン結合タンパク質C、クレアチンキナーゼMB、および心筋梗塞と健常者の被験者からの血清サンプル中の心筋トロポニンIを測定する高感度な方法を説明します。...

電気化学発光免疫測定法により血清心臓ミオシン結合タンパク質-Cの定量のための高感度で特異的な定量法

我々は、高スループット、多重化を説明、およびプロテオミクス脳脊髄液（CSF）の臨床翻訳のための潜在的に開発されたアッセイをターゲットに。テストでは、このようなアポリポタンパク質Eバリアント（E2、E3およびE4）などの神経変性のための潜在的なマーカーおよびリスク要因を、定量、およびそれらの対立遺伝子の発現を測定することができます。...

神経変性のバイオマーカーおよびアポリポタンパク質Eアイソフォームの状態を定量化するために高スループット、多重化およびターゲットプロテオームCSFアッセイ

小さいヘアピン RNA (shRNA) とホタルのルシフェラーゼとマウス細胞における x 染色体不活性化のレギュレータを識別するの次世代シーケンス ベースのプロトコルについて報告して、メチル CpG 結合蛋白質 2 (hygromycin 抵抗性遺伝子融合MeCP2)不活性 X...

プールされた shRNA MeCP2 再アクティブ化非アクティブ X 染色体上の画面

ここで、紹介タグの付いていない人間の活動の効率的な単一ステップ浄化のためのプロトコル 10 11 転流 2 (TET2) イオン交換クロマトグラフィーと液体クロマトグラフィー-タンデム質量を使用しての試金を使用して 5-メチルシトシン ジオキシゲナーゼ分析...

10-11 転流 2 5-メチルシトシン ジオキシゲナーゼの LC MS/MS による分析法の開発や効率的に精製

ここでは、非ランダム X 染色体の不活化を伴う生存可能な雌マウスモデルを生成するためのプロトコルについて述べる、すなわち、母親-継承された X 染色体は、細胞の 100% で不活性である。我々はまた、インビボにおける不活性 X...

不活性 X 染色体上の Mecp2 の薬理学的再活性化のための非ランダムマウスモデル

CENP-Aのユビキタスは、細胞分裂間の二量体化によって受け継がれ、細胞の生存率に不可欠なセントロメレでのCENP-A沈着にとって重要な要件です。ここでは、EYFP タグ付き CENP-A (EYFP-CENP-A)...

EYFP タグ付き CENP-A (EYFP-CENP-A) のユビキタス性を同定するための質量分析分析

DNAメチルトランスフェラーゼは、潜在的な抗がん剤標的です。ここでは、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害について低分子を評価するためのプロトコルが提示されています。このアッセイでは、エンドヌクレアーゼを利用してDNAメチル化と蛍光生成を結合させ、酵素活性をリアルタイムでモニタリングすることができます。...

DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤をスクリーニングするための連続蛍光ベースのエンドヌクレアーゼ共役DNAメチル化アッセイ(英語)

学ぼう、エレクトロケミルミネッセンスイムノアッセイ（ECLIA）を用いてMeCP2タンパク質変異体を定量する方法。ウェスタンブロットやELISAよりも高速で高感度な神経科学研究の新たな手法です。

MeCP2タンパク質変異体に対するエレクトロケミセンスベースアッセイ

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