Name: 大精子細胞の3D共焦点解析のための全山 ショウジョウバエ 精巣の免疫染色 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学ぶ Drosophila melanogasterの精巣全マウント免疫染色法。NP40とヘプタンを用いた固定プロトコルにより抗体浸透性を向上させ、共焦点顕微鏡による3D再構成と共局在解析を可能にする。

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P.ベリザー、J.ヨハンセンH.、オクラの抗体、A.デベック、ブルーミントン、ウィーンのハエストックセンターに感謝します。提案と刺激的な議論のためのC.ジャクソンに感謝します。

1. ショウジョウバエ精巣コレクション
注:若い男性(0-15時間後-分浸)は、ジロイド生殖細胞(すなわち、精子および精子細胞)を調べるのに必要である。
<ol><li>精子の開発による干渉を最小限に抑えるために、可能な限り若いハエを選択してください。</li>
	<li>二酸化炭素への短時間の暴露によってハエを麻酔し、フライパッド14、15に移す。</li>
	<li>解剖顕微鏡(10倍の倍率)の下で、鉗子を使用して頭部を取り除く。</li>
	<li>5~10個の切断されたハエを、黒いバックグラウンドサポート上のシリコーンコーティングされたガラススライド上のリンゲルのバッファー(183 mM KCI、47 mM NaCl、10 mM Tris-HCI、1 mM EDTA、完全タンパク質阻害剤、pH 6.8)の100 μLに移します。</li>
	<li>40倍の倍率で顕微鏡を解剖すると、5個の鉗子を1組使って胸部と腹部の間にハエを保持し、他の鉗子で腹部を胸郭から引き離します。精巣と隣接組織をハエ・カーカス15から迅速に分離し、同じスライド上のリンガーの緩衝液の新しい滴に入れる。</li>
	<li>すべての精巣の準備ができたら、残りの組織(補助腺と外部生殖器)から精巣をきれいにします。</li>
	<li>解剖された精巣を含むドロップから余分なバッファを取り除きます。通常、200 μL チップの上に 10 μL チップを取り付けた p200 ピペットを使用します。これは小さい絞りを通して液体過剰の除去を可能にする。解剖精巣を含むドロップの上に4%パラホルムアルデヒド固定液の滴を置き、次いで迅速に新しい固定溶液を含むチューブに精巣を移します。</li>
</ol>2. パラホルムアルデヒド固定
<ol><li>使用直前に2 mLの固定液を調製:リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈した4%パラホルムアルデヒド600 μL、NP40 20%の30 μL+2 mLシリコン化マイクロ遠心チューブ内のヘプタン1200 μLを使用します。600 μL アリコートで調製し、-20°Cで保存した PBS で 4% パラホルムアルデヒドを使用してください。 注意: ヘプタンとパラホルムアルデヒドは有毒であり、ヒュームフードで扱う必要があります。ホスト協会の規則に従って処分する。</li>
	<li>広い開口チップを備えたp200マイクロピペットを使用して、PFA/NP40/ヘプタン溶液に精巣を移します。チューブを上下に振って30s手で動かします。室温で30分間、回転ミキサーで精巣を固定し続けます。</li>
	<li>回転ミキサーを停止し、チューブラックにチューブを置いて、相分離を可能にし、精巣がチューブの底部に落ち着くようにします。</li>
	<li>すべてのヘプタンと固定溶液を取り除き、1x PBSで3回素早く精巣をすすぐ。</li>
	<li>きれいな200 μLの個々の管に移す。これらの小さなチューブ内のすべてのインキュベーションを行い、抗体の使用量を最小限に抑えます。</li>
	<li>P200とP10チップの両方を取り付けた200 μLマイクロピペットを使用して余分なバッファーを除去します。精巣を吸引しないように注意してください。</li>
	<li>すべてのサンプルが準備ができるまで氷の上に1x PBSで精巣を保ちます。</li>
</ol>3. 溶液中の抗体染色
<ol><li>PBSを廃棄し、細胞膜を透過させるために室温で30分間0.3%PBS-Tに精巣を残します。</li>
	<li>同じバッファーに 5% 通常のヤギ血清 (NGS) を加えた 1 時間の前培養します。</li>
	<li>0.3%PBS-Tプラス5%NGS(材料表)に希釈された一次抗体の200 μLを加える。</li>
	<li>ロッカーに緩やかな攪拌を伴い、一次抗体を4°C(または室温)で一晩インキュベートします。</li>
	<li>室温でロッカーに15分間0.3%PBS-Tで3回洗浄します。重力によって精巣がチューブの底に落ち着くようにします。</li>
	<li>DyLightコンジュゲートシリーズから1:500希釈した二次抗体200μLを加えます。</li>
	<li>二次抗体を暗室で室温で4時間インキュベートする。</li>
	<li>室温でロッカーに15分間0.3%PBS-Tで洗います。その後、0.2%PBS-Tと0.1%PBS-Tで繰り返し、室温でロッカーで30分間繰り返します。洗剤を取り除くために30分間、PBS1xで最後の洗浄を行います。</li>
	<li>1μg/mLのDAPI溶液を1μg/mLで1x PBSで15分間追加します。ストック溶液はH2Oで10mg/mLであり、PBSでストック溶液を作ることを避け、より大きな精子での拡散クロマチンのDAPI染色信号を減少させることができます。</li>
	<li>3倍の洗剤を5分間洗います。</li>
	<li>疎水性バリアペンを使用して、きれいなスライドに円を描きます。</li>
	<li>試験を吸引し、スライドの上に置きます。広い開口チップを0.1%PBS-Tでプレリンスすると、精巣が先端に付着するのを防ぎます。余分なPBSを除去します。</li>
	<li>シティフルオールAF1のドロップ(約100 μL)を加えます。</li>
	<li>ガラスのカバースリップを組織の上にそっと置き、気泡をトラップしないように注意してください。</li>
	<li>クリアマニキュアを使用して、カバースリップをスライドに密封します。</li>
	<li>顕微鏡でスライドを観察します。</li>
</ol>4. 共局化分析
<ol><li>共焦点画像を取得します。Zeiss LSM 710共焦点顕微鏡(63xプランアポクロマティックオイル)を使用し、Z解像度は0.5または1μmでした。</li>
	<li>独立した精巣から異なるセルを選択します。</li>
	<li>処理ソフトウェア(例えば、イマリス)に画像をインポートします。</li>
	<li>隣接する核を除外するために、手動セグメンテーションで核を定義します。Coloc ソフトウェアを使用する。2つのフルオロフォア間の全容内でピアソンの相関係数(PCC)を収集します。</li>
</ol>

<ol><li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic%2C+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+assembly+in+Drosophila+neuroblasts+and+ganglion+mother+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).</li>
<li>Fabbretti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+Analysis+of+Nuclear+Lamina+Behavior+during+Male+Meiosis+and+Spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 11 (3), 0151231(2016).</li>
<li>Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFuller%2C+MT+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinas-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-148 (1993).</li>
<li>Hiller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testis-specific+TAF+homologs+collaborate+to+control+a+tissue-specific+transcription+program%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program.</a> Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).</li>
<li>Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+TAFs+counteract+Polycomb+to+turn+on+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation.</a> Science. 310 (5749), 869-872 (2005).</li>
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<li>Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAD1%3A+Kinetochore+Receptors+and+Catalytic+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51(2018).</li>
<li>Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+checkpoint+protein+Xmad1+recruits+Xmad2+to+unattached+kinetochores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).</li>
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<li>Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smurf-mediated+differential+proteolysis+generates+dynamic+BMP+signaling+in+germline+stem+cells+during+Drosophila+testis+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development.</a> Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).</li>
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<li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue%2C+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBonaccorsi%2C+S+%22Immunostaining+of+Drosophila+testes%22">Immunostaining of Drosophila testes</a>. 2011 (10), Cold Spring Harbor Protocols. 1273-1275 (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBonaccorsi%2C+S+%22Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes%22">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes</a>. 2012 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 102-104 (2012).</li>
<li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis%3A+analysis+of+meiosis+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).</li>
<li>Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescence+imaging+of+whole-mount+Drosophila+testes+for+studying+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis.</a> Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).</li>
<li>Theofel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tBRD-1+and+tBRD-2+regulate+expression+of+genes+necessary+for+spermatid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation.</a> Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).</li>
<li>Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+dany+is+essential+for+transcriptional+control+and+nuclear+architecture+in+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes.</a> Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルは、成体成群ショウジョウバエ精巣の免疫標識を成功させるための方法を提供する。他の手順で報告されているように、若い男性は精子を妨害する危険性のある精子の発症の存在を最小限に抑えるために使用する必要があります(我々も、発疹後20時間以内に年齢を短縮しました)。解剖は迅速で、抗体希釈はシグナル対ノイズ比21、22、23を最適化するように調整する必要があります。他のプロトコルを用いるため、精巣の深さ全体に染色を観察せず、NP40やヘプタンとPFAを組み合わせた固定法を開発しました。現在では、20%NP40の30 μLと2巻のヘプタンを用いたPBSで、4%パラホルムアルデヒド600 μLを日常的に使用しています。これは、十分な透過性を可能にするために重要です。NP40の量を10 μLに減らすことによって、目に見えてラベル付けを減らすことができます。その後のステップはすべて懸濁液で行い、精巣が重力によって管の底に穏やかに降下できるようにすることで余分...

ショウジョウバエの精巣は、核建築の研究にとって貴重なモデルです。有糸精子細胞では、核体積は主にクロマチンによって占められます。これらの細胞は4ラウンドの分裂を受け、16の原発性精子細胞の嚢胞を産生する。次の数日間にわたって、精子細胞は6つの発達段階(S1-S6)を通過し、体積が大幅に増加し、およそ20倍1、2。彼らはまた、核形態を変えます。ラミンDm0によって明らかにされた核の輪郭は不規則になり、深い内層1、3を示す。これは、クロマチン組織1、4、5、6、7における広範な遺伝子発現変化および修飾を伴う。この相間染色体は、ステージS4-S5で明確に定義されており、2つの主要な二価オートソームと核子とドッキングされたX-Y対に対応する3つの異なる質量を形成する。
Mad1 はもともと、有糸分裂性チェックポイントの重要な構成要素として分離されました(8でレビュー)。相間では、核エンベロープに位置するが、核内に位置する9、10、11と記載されている。ショウジョウバエ精巣では、Mad1が核内で顕著であり、2つの主要な常染色体塊と密接に関連しており、XYクロマチンとのより少ない程度に関連していると報告した。我々は、このクロマチン関連構造をMINT(Mad1含有核内領域)12と定義した。他の4つのタンパク質は、精子細胞におけるMINTと関連していた:ヌクレオポリンMtor/Tpr、SUMOペプチダーゼウルプ1、有糸性チェックポイントタンパク質Mad2およびポリコーム様複合体Raf212のサブユニット。
MINTの説明を完了するために、我々は抗体を使用する必要があり、精巣における免疫染色に一般的に遭遇する技術的な問題に直面していた:透過性が悪く、特に大きな精子で精巣の深部に有意な不均一性の染色をもたらした。Squashed製剤は抗体アクセスを増加させたが、圧縮画像、3D分析を制限し、共局在化を含む定量的蛍光の測定を妨げる。抗体の浸透の問題は、0.3%Naデオキシコール酸13などの透過性剤によっても対処することができたが、この手順は我々の手の中に再現可能な結果を生み出さなかった。多くの共標識実験を行ったため、パーメバライゼーションプロトコルの改善を検討しました。1%NP40とヘプタンの組み合わせは、特に大きな精子細胞を研究する上で、より再現性をもたらした。
このプロトコルは、懸濁液中の精巣の固定および免疫染色を行い、サンプルの品質を向上させ、再現性を高め、共焦点顕微鏡に適したレンダリングを行います。我々は、このプロトコルを用いて、特定の核エンベロープタンパク質と大きな精子細胞の核内構造の空間的関係をより良く定義した。この方法は、例えばクロマチン、核細胞および核の毛穴を含む核の動的構造変化など、精子細胞の発達に伴う変化のより良い調査を可能にする。

<table><tbody><tr><td>Drosophila srains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO</td><td></td><td></td><td>Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)</td></tr><tr><td>Mad1-GFP</td><td></td><td></td><td>J Cell Sci. 2011年5月15日;124(Pt 10):1664-71。</td></tr><tr><td>Mtor RNAi&nbsp;</td><td>VDRC</td><td>ID 110218</td><td>ウィーン ショウジョウバエ RNAi Center</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>D1306</td><td>ストック溶液は、H2O</td></tr><tr><td>Dumont#5 Fine Forseps&nbspで</td>調製する必要があります。<td>ファインサイエンスツール</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MBP ワイドボアピペットチップ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>11917744</td><td>ワイドアパーチャチップ</td></tr><tr><td>サーモサイエンティフィック&nbsp;0.2 mL Individual Tube</td><td>Thermo</td><td>AB-0620</td><td></td></tr><tr><td>2 ml マイクロ遠心チューブ&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>T3531-200EA&nbsp;</td><td>シリコン処理された2mlチューブ</td></tr><tr><td>Citifluor AF1</td><td>Citifluor</td><td>AF1</td><td></td></tr><tr><td>Dakopen&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>Z377821-1EA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>正常なヤギの血清(NGS)</td><td>Σ</td><td>NS02L-1ML</td><td></td></tr><tr><td>のパラホルムアルデヒド4%</td><td>Σ</td><td>P6148-500G&nbsp;</td><td>パラホルムアルデヒド(4%)をPBSに溶解 1X&nbsp;;アリコート600ml&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Thermo</td><td>14190094</td><td>DPBS、カルシウム、マグネシウム不使用</td></tr><tr><td>0.1% (0.2 or 0.3%) PBS-T&nbsp;</td><td></td><td></td><td>0.1%(0.2%または0.3%)を含むPBS 1X&nbsp Triton X-100</td></tr><tr><td>Triton X-100、分子生物学用、&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP booster</td><td>Chromotek</td><td>gba488</td><td>1/200</td></tr><tr><td>マウス抗Mtor</td><td></td><td></td>抗体 <td>1/40 J. Johansen, Iowa State Universityからの</td></tr><tr><td>贈り物 ラット抗Nup62</td><td></td><td></td><td>1/200 H. Ohkura (University of Edinburgh, UK</td></tr><tr><td>Guinea-pig anti-Ulp1</td><td></td><td></td><td>1/200 C. P. Verrijzer, エラスムス大学, ロッテルダム</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Raf2</td><td></td><td></td> 1<td>/200 C. P. Verrijzer, エラスムス大学, ロッテルダム</td></tr><tr><td>DyLight コンジュゲート シリーズからのギフト&nbsp;</td><td>Thermo</td><td></td><td>1/500 Donkey anti-(モルモット、マウス、ウサギまたはラット)</td></tr></tbody></table>

大精子細胞の3d共焦点解析のための全山 ショウジョウバエ 精巣の免疫染色

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

ショウジョウバエ 精巣は、幹細胞生物学、核アーキテクチャ、微膜および精子の発生を含む生物学的プロセスを研究するための強力なモデルシステムです。しかしながら、 ショウジョウバエ 精巣全体の免疫標識は、抗体の浸透による染色の有意な不均一性と関連していることが多い。押しつぶされた準備は、解析の3D品質を低下させるので、部分的に問題を克服するだけです。本明細書において、我々は、液体媒体中の免疫標識と共に固定中にNP40およびヘプタンを用いた全実装プロトコルについて述べている。それは再生可能で信頼できるラベル付けと共に共焦点顕微鏡に適した容積を維持する。我々は、共焦点部からの精子細胞核の3D再構成の異なる例を示す。検査中および間の試験の再現性により、異なる遺伝子型の単一細胞間の 蛍光 を3D定量および比較することができます。我々は、核内MINT構造(Mad1含有核内領域)の異なる成分と、核孔複合体に関連する2つの成分を使用して、このプロトコルとその精巣の最大細胞S4-S5精子細胞への応用を説明した。

ショウジョウバエ精巣の適切な染色を得るための主な障害は、部分的に押しつぶされた製剤を使用して解決されたが、3D分析の制限(例えば3D表現または共局在化の尺度)を犠牲にして解決された抗体の限られた浸透性である。この手順では、均一なラベルを作成でき、精巣のすべての細胞の体積を保持します。ここでは、S4-S5精子細胞の3D表現に関する方法のイラストを、それらが最大の細胞であり、したがって、スカッシュからの変形に敏感であるように焦点を当てました。我々は、有糸タンパク質Mad112によって記述される核内MINTドメイン(Mad1含有核内領域)の核内MINTドメインのラベリングと核内の標識を含む異なる核マーカーを用いた。MINTは複数の異なる抗体によって明らかにすることができるので、我々はそれらを使用して、定量的3D共局在化のためのプロトコルの堅牢性をテストし、正しい空間分解能を必要とする方法である。
上述のプロトコルは、3D再構成のために処理される十分な品質の共焦点画像の取得を可能にする。S5段の隣接する4つの連続セクションが <strong ...

我々は、同焦点顕微鏡に適し、また再現可能で信頼性の高い標識を可能にする 、ショウジョウバエ 精巣の全実装および免疫染色のための改善されたプロトコルをここに提示する。我々は、大規模なS4-S5精子細胞に対する共局在化実験の3D表現および定量化によるこのプロトコルを示す。

大精子細胞の3D共焦点解析のための全山 ショウジョウバエ 精巣の免疫染色

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

精巣サンプルなどのショウジョウバエ組織のホールマウント染色は、抗体の浸透が限られているため、しばしば問題となります。NP40とヘプタンを使用した当社の固定プロトコルにより、均一で再現性のある標識が可能になります。この手順では、抗体の深い浸透を可能にしながら組織の形状を維持することにより、単独および共局在研究の両方で、3次元での免疫染色の再現性と定量化が容易になります。二倍体生殖細胞の評価では、排泄後0〜15時間で、二酸化炭素に短時間さらしてハエに麻酔をかけ、ハエをハエパッドに移します。パッドを10倍の倍率で解剖顕微鏡の下に置き、鉗子を使用して5〜10匹のオスのハエから頭部を取り除きます。斬首されたハエの体を、黒い背景の支持体にシリコンコーティングされたスライドガラスの上の100マイクロリットルのリンガーバッファーに移し、40倍の倍率と5番の鉗子のペアを使用して、胸部と腹部の間のハエをつかみます。次に、腹部を胸部から引き離し、ハエの死骸から精巣と隣接する組織を迅速に分離します。すべての精巣を採取したら、残っている組織のサンプルを洗浄し、200マイクロリットルのピペットチップを使用して、解剖された精巣の周りから余分なバッファーを取り除きます。次に、4%パラホルムアルデヒドを精巣に一滴垂らし、20%NP40とヘプタンを補給した2ミリリットルの新たに調製した4%パラホルムアルデヒド溶液を含むチューブに組織をすばやく移します。精巣サンプルを完全に固定するには、チューブを垂直に30秒間振とうしてから、室温でロータリーミキサーで精巣を30分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、チューブをチューブラックに移し、精巣がチューブの底に落ち着くのを待ちます。ヘプタンと固定液をすべて取り除き、PBSで精巣をすばやく3回すすぎます。最後の洗浄後、精巣を新しい200マイクロリットルチューブに移し、10マイクロリットルのピペットチップを備えた200マイクロリットルのピペットを使用して、余分なバッファーを取り除きます。次に、200マイクロリットルの新鮮なPBSをチューブに追加し、精巣を氷の上に置きます。精巣サンプルの抗体標識には、PBSを200マイクロリットルの0.3%PBS-Tと交換し、室温で30分間インキュベートします。透過処理後、0.3%PBS-Tと5%正常ヤギ血清で非特異的結合を室温で1時間ブロックした後、0.3%PBS-Tと5%正常ヤギ血清で希釈した目的の一次抗体200マイクロリットルを添加し、摂氏4度または室温でロッキングしながら一晩インキュベートします。翌朝、新鮮な0.3%PBS-Tで15分間の洗浄を3回行い、洗浄ごとに室温で揺さぶってサンプルを洗浄し、精巣が重力によってチューブの底に沈殿するのを待ちます。200マイクロリットルの適切な二次抗体をチューブに加え、室温で光から保護した状態で4時間インキュベーションした後、1回の洗浄でサンプルを新鮮な0.3%PBS-Tで洗浄します(例)。0.3%PBS-T洗浄後、サンプルを0.2%PBS-Tで1回、0.1%PBS-Tで1回、ロッカーで30分間洗浄し、その後、PBSのみで最後の30分間洗浄します。PBS洗浄後、1ミリリットルあたり1マイクログラムのDAPI溶液180マイクロリットルをPBS溶液で15分間、室温で光から保護してサンプルを標識し、その後、洗浄ごとに新鮮なPBSで5分間を3回洗浄します。最後の洗浄後、疎水性バリアペンを使用してきれいなスライドに円を描き、0.1%PBS-Tプライミングされたピペットチップを使用して精巣をスライドに移します。余分なPBSを吸引し、100マイクロリットルのCitifluorAF1を追加します。.気泡が引っかからないように注意しながら、ガラスカバースリップをティッシュにそっと置き、透明なマニキュアを使用してカバースリップをスライドに密封してから、共焦点蛍光顕微鏡でスライドを観察します。サンプルの共焦点画像を取得した後、適切な画像解析ソフトウェアプログラムに画像をインポートします。次に、手動セグメンテーションを使用して各細胞内の核を定義し、2つの蛍光色素間の全ボリューム内のピアソンの相関係数を決定します。このプロトコルにより、3D再構成のために処理するのに十分な品質の共焦点画像を取得することができます。例えば、S5期の精母細胞のこれら4つの隣接する連続切片では、核膜で低レベルのMad1が観察され、核内のDAPI染色と併せてMad1の高レベルの蓄積を可視化することができます。この3次元再構成画像では、DNAとともに、核表面にMad1が低レベルに存在することと、原子核内にMad1が高レベルで蓄積していることが観察できます。これらの3D再構成では、ヌクレオポリン62とMad1、またはインポーチンβとDAPIで染色された大きなS5精母細胞を観察することができます。どちらの再構成でも、核の細孔に関連する成分は、不規則なサイズのドットとして核縁上に不均一に分布しているように見えます。このプロトコルは、細胞の3Dボリュームを維持しながら、目的の抗体を各細胞の深さまで均一に浸透させることも可能にし、共局在化などの定量分析を可能にします。このプロトコルでは、独立した精巣からの共局在を確実に測定できるため、異なるハエの遺伝子型の染色を比較するためにも使用できます。NP40の使用量は、十分な透過処理のために重要です。手順を綿密に守れば、再現性のある標識と3D核構造保存を達成することができます。ショウジョウバエ内の組織のホールマウント染色は難しい場合がありますが、このプロトコールは他のサンプルにも簡単に適応できます。

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