Name: ポテトウイルスXベースマイクロRNAサイレンシング(VbMS)ポテト中。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: 学ぶポテトウイルスXベースのマイクロRNAサイレンシング法。安定形質転換を必要とせず、ポテトの内因性マイクロRNAを迅速かつ効率的に機能解析できる革新的な手法です。

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PVX-LICベクターを提供してくれた清華大学のユレ・リュウ博士に感謝します。この研究は、テキサスA&MアグリライフリサーチとハッチプロジェクトTEX0-1-9675からUSDA国立食糧農業研究所からJSへのスタートアップファンドによって支援されました。

1.ジャガイモの植物を育てます。
<ol><li>培養管(25 x 150 mm)に、ムラシゲとスクーグ(MS)培地にガンボルグのビタミン(MS基底塩混合物、ガンボルグのビタミン、30 g/Lスクロース、3.5 g/L寒天、pH = 5.7)を加えた培養管内のインビトロポテト植物を伝播します。成長室にチューブを20~22°C、16時間光/8時間暗光周期、光強度120μmol/m2∙s1の下に置きます。 注:新しい芽や根は通常、植物から1〜2週間で発生します。新鮮なMS/ガンボルグのビタミン培地を毎月植物に伝播する。</li>
	<li>4週間後、体外植物を土壌に移植し、20~22°Cの温室、16時間光/8時間の暗光周期、光強度120μmol/m2∙s1の下で成長させます。 注:新たに開発された根や葉を持つ植物は移植に適しています。最初の3~4日間は、移植したての植物の水分を維持します。</li>
</ol>2. VbMS ベクトルを構築します。
<ol><li>目的のmiRNAに対して短タンデムTM分子(STTM、図1)22,53を設計およびクローン化する。 注:実験データに基づいて、またはmiRbaseデータベースからmiRNA配列を取得する54、55、56、57、58、59。この研究で使用されたmiR166配列は、前60に記載されている。<ol>
<li>miRNAの10番目から11番目 のヌクレオチドに対応する部位のmiRNAの逆補数配列にミスマッチ配列(通常5'-CTA-3')を挿入してTMモジュールを設計します。 注: 例えば、Stu-miR160配列は5'-UGCCUGGCUCUCUGUAUGCC-3'61で、10番目から11番目のヌクレオチドは太字です。逆補体配列(デオキシヌクレオチド)は5'-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3'であり、不一致の膨らみ挿入部位は太字で示されている。TM分子配列(デオキシヌクレオチド)は5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3'でなければなりません。</li>
		<li>STTMフラグメントをクローニングするためのプライマーを設計する(図1)。PCR クローニングのテンプレートとして、48-nt スペーサ配列を持つ DNA オリゴヌクレオチドを使用します。フォワードプライマーは、LIC1リンカー(5'-CgACgACAAgACCgT-3')、TM分子用に設計された上記の前方配列、および48-ntスペーサーの部分的な5'配列(5'-GTTGTGtTGTTATGGT-3')で構成されています。リバースプライマーは、LIC2リンカー(5'-gAgCCgT-3')、TM分子の逆補数配列、および48-ntスペーサーの3'配列に対する部分的な逆補体(5'-ATTCTCTCtTTAGACCAT-3')で構成されています。 注:48-ntスペーサーシーケンスは5'-GTGtGtTGTTTATTTTTCTAATAATAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAAT-3'です。例えば、STTM-miR160の場合、フォワードプライマーは5'-CgACgACAAgACCgT-GGCATACAGG-CTA-GAGAGGCA-GTTGTGtTGTTTTATGGT-3'でなければなりません。リバースプライマーは、5'gAGAgAagAgAgCCgT-TGCCTGGCTC-タグ-CCTGTATCC-ATTCTCTCTTTAGACCATAT-3' でなければなりません(図1)。</li>
		<li>合成されたユニバーサル48-ntスペーサーをテンプレートとして、かつ高忠実度DNAポリメラーゼを用いて、PCRにより50μLの体積でSTTM断片を増幅します。<ol>
<li>各プライマー(40 μM)の0.5 μL、48-ntスペーサーオリゴ(40 μM)の0.5 μL、10x PCRバッファの5 μLを混合してPCR反応を設定し、 dNTP混合物1 μL(各10 mM)、0.1μLの高忠実度DNAポリメラーゼ(10 U/μL)、ddH2Oの43 μLを合計容量50 μLに、標準PCR増幅を次のように実行します。 94°C(3分)、94°Cの32サイクル(45s)、60°C(45s)、60°C(60°C)</li>
		</ol>
</li>
		<li>エタノール沈殿によりSTTM断片を精製する。PCR製品に2.5量のエタノールと3M酢酸ナトリウム(pH = 4.0)の1/10容量を加えます。14,000 x g で 10 分間、激しく遠心分離機を混ぜます。上清を取り除き、70%エタノールの1 mLでペレットをすすます。ペレットを乾燥させ、20 μLのddH2Oに溶解します。 注:DNA電気泳動を使用して、STTM PCR製品の増幅を確認してください。</li>
		<li>T4 DNAポリメラーゼ反応を、精製されたSTTM PCR産物の2.5 μL、10x T4 DNAポリメラーゼバッファーの0.5 μLを混合して氷上にセットアップし、 0.05 μLの 1 M ジチオスレイトール (DTT), 0.25 μL 100 mM dATP, 0.1 μL T4 DNA ポリメラーゼ (3 U/μL), ddH2O の 1.6 μL 合計体積 5 μL で 37 °C の混合物をインキュベート 5 μL, 15 min, 75°CでT4DNAポリメラーゼを不活性化するために20分間製品を処理します。</li>
	</ol></li>
	<li>PVX ベースの VbMS コンストラクトを準備します。<ol>
<li>PVX-LICプラスミド38 の5 μgを、100 μLの体積で2.5 μLの SmaI(20 U/μL)を消化します。</li>
		<li>消化したPVX-LIC製品に等量のフェノール:クロロホルム:イソプロパノール(25:24:1、pH = 6.7/8.0)を加え、激しく混ぜます。14,000 x g で10分間遠心分離機を使用し、上清を新しい遠心管に移します。等量のクロロホルム:イソプロパノール(24:1)と渦を激しく加えます。14,000 x g で10分間遠心分離機。 注: PVX-LIC ベクターは、クローン作成用の LIC カセットを収容します。PVX-LICベクターのLICカセットは 、ccdB 遺伝子とクロラムフェニコール耐性遺伝子を含んでおり、カナマイシン(50μg/L)およびクロラムフェニコール(15μg/L)を含むLB培地を使用して 大腸菌 株DB3.1で維持/伝播する必要があります。</li>
		<li>上清を新しい遠心管に移します。2.5量のエタノールと3M酢酸ナトリウム(pH =4.0)の1/10容量を加え、激しく混ぜます。14,000 x g で10分間遠心分離機を使用し、上清を取り除く。</li>
		<li>70%エタノールと渦の1 mLでペレットを精力的に洗浄します。14,000 x g で10分間遠心分離機を使用し、上清を取り除く。ペレットを乾燥させ、消化したPVX-LICプラスミドを100 μLのddH2Oで溶解します。</li>
		<li>T4 DNAポリメラーゼ反応を2.5 μLの消化PVX-LICベクターDNAを混合して氷上にセットアップし、 0.5 μLの10x T4 DNAポリメラーゼバッファー、0.05 μLの1 M DTT、0.25 μLの100 mM dTTP、0.1 μLのT4 DNAポリメラーゼ(3 U/μL)の合計体積5μLで、37°Cで37°Cでインキュベート混合物を15minで75m°Cで処理し、75m°Cで製品を治療します。T4 DNAポリメラーゼを不活性化します。</li>
	</ol></li>
	<li>LIC反応を使用して、STTM配列をPVX-LICベクターにクローン化します。T4 DNAポリメラーゼ処理STTM PCR産物(5μL)とT4 DNAポリメラーゼ処理PVX-LICプラスミド(5μL)を混合します。70°Cで5分間インキュベートし、0.1°C/sのランプで22°Cまで冷却し、PCR機を使用して22°Cで30分間保ちます。 注意:LICクローニングの効率を高めるために、4°Cで一晩にインキュベーション時間を延長してください。</li>
	<li>LIC反応生成物の5μLを大腸菌DH5αに変換し、50 μg/mLカナマイシン62,63を含むLBプレート上で成長させます。PVX-LIC ベクターのクローニングプライマーとユニバーサルプライマーを使用して、シーケンシングを行い、正のコロニーを検出して検証します。<ol>
<li>PVX-LIC(5'-GTGTTGGTGCAACTAGAT-3')のフォワードプライマーでコロニーPCRを行い、STTMクローニング用リバースプライマーと組み合わせて陽性クローンを同定します。PCR バンドのサイズは、300 bp 以下にする必要があります。 注: ターミネータサイクルシーケンシング64,65でSTTMフラグメントのシーケンスを確認します。</li>
	</ol></li>
	<li>PVX-STTMプラスミドを検証済みのクローンから分離し、GV3101、GV2260、またはEHA10562,63のアグロバクテリウム株に変換します。PCRでアグロバクテリウムコロニーを確認します。 注: PVX-LIC のフォワードプライマーと STTM クローニング用のリバース プライマーを使用して、PCR による アグロバクテリウム コロニーを確認します。</li>
</ol>3. ポテトプラントでPVXベースのVbMSアッセイを行う。
<ol><li>4週齢のインビトロポテト植物を土壌に移植する。移植された植物は3〜4日後にVbMSアッセイを受ける。</li>
	<li>PVX-STTMプラスミドを含む アグロバクテリウム を用いてポテト植物を接種する。 注:ジャガイモのVbMSアッセイでは、 アグロバクテリウム媒介性浸潤と爪楊枝引っ掻き接種が同時に行われます。<ol>
<li>PVX-STTMベクターを含む正の形質転換体を50 μg/mLカナマイシンおよび50 μg/mL リファンピシンを含む液体LB 50 mLに選んで接種します。OD600 = 1.0まで220 rpmで28°Cインキュベーターで16時間成長します。</li>
		<li>同時に、陽性のアグロバクテリウムコロニーを、50 μg/mL カナマイシンと50 μg/mL リフィンピシンを含む少なくとも2つの新しいLBプレートにストリークし、28°Cで1日間成長します。コントロールとして PVX-LIC38,66 ベクターを、ウイルスの拡散を監視する PVX-GFP67,68 を含めます。</li>
		<li>室温で10分間3,400xgで遠心分離することにより、アグロバクテリウム液培養液を収集します。等量の浸潤バッファー(10 mM MgCl2、10 mM MES、および200 μM アセトシリンギロン、pH = 5.6)のアグロバクテリウム細胞を再懸濁し、OD600 = 1.0 に調整します。室温で6時間インキュベートする。</li>
		<li>1 mLの無針注射器で完全に膨張した葉の腹側に アグロバクテリウム 培養物を浸透させる。<ol>
<li>片方の手で葉をめくって持ち、1本の指を使って浸潤部位のアダクシャル側から葉の層を支えます。もう一方の手で葉の表面に垂直にシリンジを保ち、ラミナの腹軸側に アグロバクテリウム 培養物を浸透させます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>LBプレートから アグロバクテリウム 培養物を削り、浸潤したジャガイモ植物の最初の1つまたは2つの節間の茎表面を爪楊枝で傷つける。茎の表皮を軽く引っ掻きます。茎を突き抜け、植物に深刻な損傷を引き起こす可能性があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>浸潤した植物を22°Cで22°Cで、16時間光/8時間の暗い光周期と120 μmol/m2∙ s1 の光強度を温室で成長させます。 注:miRNAサイレンシングによって引き起こされる型の素型は、通常、2~4週間の後分に現れます(図2、 図3)。VbMS 表現型が浸透した後に現れるのに通常 10 ~ 20 日かかります。VbMS表現型は、特定のmiRNAおよび標的遺伝子の特性、成長条件、およびジャガイモの品種に依存する。</li>
</ol>4. 式解析を実行します。
<ol><li>表現型が2~4週間の後に出現する場合、はさみでコントロール植物からVbMS植物や組織から、芽、葉、花、根などの組織をVbMS植物や組織から採取します。収集した組織から総RNAを分離します。</li>
	<li>分光光度計でOD260吸光度を測定して、電気泳動62,63でRNAの品質を確認し、RNA濃度を定量化します。</li>
	<li>miRNAの発現を分析するために、ステムループリアルタイム逆転写PCR(RT-PCR)を使用します。<ol>
<li>特定のmiRNAの場合は、ステムループ逆転写プライマーを設計します。ステムループRTプライマーは、ユニバーサル5'バックボーンと特定のmiRNAの3'6-nt拡張を含みます。ステムループ構造を形成する5'-GTCTCCTGTGTGGCagggtgcgttgcACCAGAGGAGAC-3'を設計します。(大文字は逆繰り返しシーケンスに対応し、下のケースはループ領域に対応します)。</li>
		<li>ループを形成する5'バックボーンシーケンスの一部は、その後のPCR増幅のためのリバースプライマーとして機能します(バックボーンシーケンスにおける太字斜体配列)。逆に目的のmiRNAの3'末端に逆相補的である6-nt拡張配列をステムループプライマーに加え、逆転写に特異性を与える(補足図1A)。 注:陳ら69およびエリカ・バルコニ-ガシックら70,71,72によって記述されるように、ステムループ逆転写プライマーを設計します。例えば、Stu-miR160用のステムループ逆転写プライマーは、5'-GTCTTGtGtGtGGGggcgtgggggtgtattgcACCAGAGGAGGAGGGCATA-3'として設計されています。ポテトmiR165/166ファミリー用のステムループ逆転写プライマーは、5'-GTCTTGTGtGtGGGgcgtgggtgtgtgtattgcACCAGAGGAGACGG(A/G)A-3'として設計されています。(太字の大文字シーケンスは、特定の miRNA に対する逆転写の特異性を提供します)。</li>
		<li>総RNA50~200ng、ステムループ逆転写プライマー1μL(100μM)、10x緩衝液2μL、RNase阻害剤0.2μL(40 U/μL)、0.25μLのdNTP(各10mM)、1μLの逆転転写反応を設定します。ヌクレアーゼフリーddH2Oを合計20μLに追加します。</li>
		<li>パルス逆転写処理を使用して逆転写を行います。逆転写反応混合物を16°Cで30分間インキュベートし、30sで30°C、30sで42°C、1sで42°C、合計60サイクル、85°Cでインキュベーションして逆転写酵素を5分間不活性化する。</li>
		<li>miRNA発現のリアルタイムPCR解析のために、miRNA配列に基づいてフォワードプライマーを設計しますが、上記の設計されたステムループ逆転写プライマーと重なる配列は含みないでください。長さ、溶融温度、および GC コンテンツを最適化するために、フォワードプライマーの 5' に 3-7 nt の拡張を追加します (補足図 1)。 注: ユニバーサルリバースプライマーは 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'です。例えば、Stu-miR160用のステムループ逆転写プライマーは、5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3'として設計されています。miR165/166ファミリーのステムループ逆転写プライマーは5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3'です。太字のシーケンスは、プライマー最適化のための 5' 拡張として機能します。miRNA用のステムループ逆転写プライマーおよびリアルタイムPCRプライマーは、miRNAプライマー設計ツール73を使用して設計することができます。</li>
	</ol></li>
	<li>標準的な逆転写 PCR (RT-PCR) によって標的 mRNA の cDNA を合成する。逆転写反応混合物を37°Cで60分間インキュベートし、85°Cに加熱して逆転写酵素を5分間不活性化する。 注:(1)標的mRNAが不明な場合は、psRNATargetプログラム74 を用いて標的mRNAを予測する。(2) mRNAの普遍的な逆転写プライマーは、アンカープライマー5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVTVN-3'である。</li>
	<li>目的のmiRNAとターゲットmRNAの両方にリアルタイムPCR反応を設定します。0.5 μLのテンプレート cDNA、SYBR グリーンの 2x リアルタイム PCR バッファ 5 μL、各フォワードプライマーとリバースプライマー(40 μM)の 0.05 μL、氷上の合計体積 5 μL の ddH2O を 4.4 μL 混合します。</li>
	<li>95°Cで3分間、3sで95°Cの40サイクル、30sで60°Cでインキュベートします。その後の融解曲線解析を、95°Cで15sでインキュベートし、20°C/sの傾斜で60°Cまで冷却し、60°Cで60°Cに保ち、0.2°C/sの傾斜で95°Cに加熱し、95°Cで15°Cに保ちます。ΔΔCt メソッド76,77を使用して Ct 値を分析し、標準誤差を持つ平均をプロットします。 注: (1) 標的mRNAのリアルタイムPCRプライマーは、75を説明するように設計することができます。(2)ポテト ポリウビキチン10 遺伝子は、ジャガイモ中の正常化のための内部制御として役立つことができる。ジャガイモ ポリウビキチン10 遺伝子のフォワードプライマーは、5'-ATGTTGCCTTCTTTATGTGTGGTG-3'および逆プライマー5'-ッタッタタカターサーガッカクトカクトカACC-3'です。(3) リアルタイム PCR 解析の場合、汚染およびプライマー ダイマー形成により、偽陽性の結果が生じることがあります。非特異的増幅を監視し、リアルタイムPCR分析の責任を増大させるために、リアルタイムPCRアッセイ用のテンプレートおよび逆転写酵素を含まないコントロールを含めることが推奨されます。</li>
</ol>

STTM設計をPVXベクターに組み込むことにより、ジャガイモ中の内因性miRNAの機能を特徴づけるためのPVXベースのmiRNAサイレンシングシステムを紹介する。VbMSシステムは、植物種全体で保存度の高いmiRNAファミリーであるジャガイモ中のmiRNA165/166をサイレンシングするのに有効であることが判明した。
TMアプローチは、miRNA相補配列内の期待される切断部位にミスマッチループを作成するように設計された人工miRNA標的模倣に基づくmiRNAの発現を妨害するように開発されており、標的miRNAの隔離とその活性の停止22,35,78,79.TM分子と標的miRNAとの組み合わせは、特異的miRNAまたはmiRNAファミリーのレベルをノックダウンすることによってmiRNAの機能を遮断し、標的mRNAのアップレギュレ...

植物マイクロRNA(miRNA)は、20-24ヌクレオチド長の核コード化された調節RNA1として特徴付けられており、成長および発達2,3、光合成および代謝4,5,6,7、ホルモン合成およびシグナル8,9、生物および非生物応答10、生物合成および非生物応答を含む植物生物学的プロセスのほぼすべての側面において基本的な役割を果たす11,12,13,および栄養素およびエネルギー規制14,15。植物miRNAの調節的役割は、ターゲットmRNAを切断または翻訳的に抑圧することによって、通常、転写後レベルで十分にプログラムされ、果たされます。
ジャガイモ16,17,18,19,20,21におけるmiRNAの同定、転写プロファイリング、および目標予測に向けて大きな進歩が見られました。しかし、ジャガイモを含む植物のmiRNAの機能的特徴付けは、効率的で高スループットな遺伝的アプローチの欠如のために他の生物に遅れをとっている。ほとんどのmiRNAは、かなりの遺伝的冗長性を持つ家族に属するため、標準的な機能損失分析によって個々のmiRNAの機能解析を行うことは困難です22。さらに、単一のmiRNAは複数の標的遺伝子23を制御することができ、いくつかの異なるmiRNAは、同じ分子経路を共同で24,25に調節することができる。これらの特性は、特定のmiRNAまたはmiRNAファミリーの機能を特徴付けることを困難にします。
miRNAの機能分析の多くは、明らかな制限がある機能の得るアプローチに大きく依存してきました。人工miRNA(amiRNA)法は、内因性一次転写物(pri-miRNA)を利用して高レベルでmiRNAを産生し、標的遺伝子発現26,27,28,29の阻害を招く。しかし、強力な構成的な35Sプロモーターを用いた活性化タグ付けおよびmiRNA過剰発現は、多くの場合、インビボ状態を代表しないmiRNAの発現を高め、したがってmiRNA30の内因性機能を反映しない可能性がある。結合および/または切断部位に不用な突然変異を含む標的遺伝子のmiRNA耐性形態の発現を含む別のアプローチが開発された31,32,33。しかし、このアプローチはまた、トランスジェニックアーチファクトによるmiRNA耐性標的トランスジーンに由来する表現型の誤解釈を引き起こす可能性がある。したがって、これらの機能獲得研究からの結論は注意34で描かれるべきである。上述のアプローチのもう一つの大きな制限は、人件数が多く時間のかかる変換が必要なことです。さらに、遺伝子導入依存的アプローチは、変換-再石灰化植物種にはほとんど適用されません。したがって、miRNAの機能を解明するためには、高速かつ効率的に機能喪失アプローチを開発することが不可欠です。
変換手順の前提条件を回避するために、標的模倣(TM)戦略をウイルス由来ベクターと組み合わせることにより、ウイルスベースのマイクロRNAサイレンシング(VbMS)が確立された。VbMSシステムでは、人工的に設計されたTM分子はウイルス骨格から一過性発現し、強力で高スループットで時間を節約するツールを提供し、植物内因性miRNA35,36の機能を解剖します。VbMS は、タバコガラガラウイルス (TRV)35,36,37 を持つ N. ベンタミアナとトマトで開発され、ジャガイモウイルスX(PVX)38、綿葉のくしゃくしゃウイルス (ClCrV)39、 キュウリモザイクウイルス (CMV)40,41,41,422、および大麦ストライプモザイクウイルス(BSMV)44,45。
ジャガイモ(ソラナム結節)は、4番目に重要な食品作物であり、主にその高い栄養価、高エネルギー生産、および比較的低い入力要件のために、世界で最も広く栽培された非穀物作物である46。ジャガイモのいくつかの特徴は、魅力的な二コチドのモデル植物になります。これは、高い外交率、異種性、および遺伝的多様性を有する栄養学的に伝播された多倍化作物である。しかし、現在までに、VbMS を使用したジャガイモの miRNA の機能を特徴付けるレポートはありません。ここでは、ライゲーション非依存クローニング(LIC)適合ポテトPVXベースVbMSアプローチを用いて、ジャガイモ植物におけるmiRNAの機能を評価する38を提示する。miR165/166ファミリーとそのターゲットmRNAおよびクラスIIIホメオドメイン/ルージッパー(HD-ZIP III)転写因子が22,47,48に大きく特徴付けられているため、VbMSアッセイを説明するためにmiR165/166ファミリーを選択しました。HD-ZIP III遺伝子はメリステムの発達と器官極性の主要な調節因子であり、miR165/166機能の抑制はHD-ZIP III遺伝子の発現の増加をもたらし、その結果、有天性優位性の低下や葉極性の異常なパターンなどの多方性発生欠陥が生じる22,35,38,41.容易に相関性のある発生表現型はmiRNA165/166のサイレンシングと相関し、PVXベースのVbMSアッセイの有効性を正確に評価することを可能にする。
本研究では、PVXベースのVbMSシステムがジャガイモ中のmiRNAの機能を効果的に遮断できることを実証した。PVXベースのウイルス誘導遺伝子サイレンシング(VIGS)システムは、多くのジャガイモ品種49,50,51,52に確立されているため、このPVXベースのVbMSアプローチは、広範囲のジプロイドおよびテトラロイドジャガイモ種に適用される可能性が高い。

<table><tbody><tr><td>100 & マイクロ;M dATPおよび100 &micro;M dTTP</td><td>Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071, USA</td><td>TQAC136</td><td></td></tr><tr><td>3 M 酢酸ナトリウム, pH 4.0.</td><td>Teknova、Hollister、CA 95023、USA</td><td></td><td></td></tr> #S0297 <tr><td>Acetosyringone</td><td>TCI America、Portland、OR 97203、USA</td><td>D2666-25G</td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens株:GV3101、GV2260またはEHA105。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0757-950ML</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド, DMSO</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, USA</td><td>D0798-25G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0281-25G</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DB3.1</td><td></td><td></td><td>for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene</td></tr><tr><td>大腸菌DH5&alpha;</td><td></td><td></td><td>LICクローニングによって生成された目的地の構築物</td></tr><tr><td>肥料:Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed</td><td>ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA</td><td>G99260</td><td></td></tr><tr><td>High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs</td><td>Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA, USA</td><td>7958960001</td><td></td></tr><tr><td>Isoamyl alcohol</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0944-1L</td><td></td></tr><tr><td>Koptec Pure Ethanol &ndash; 200 Proof</td><td>Decon Labs, King of Prussia, PA 19406, USA</td><td>V1005M</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, USA</td><td>M0606-250G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td><td>MFCD00149781</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV Reverse Transcriptase</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0253L</td><td></td></tr><tr><td>ナノドロップ分光計: NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td><td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>PCR マシン: Bio-Rad MyCycler PCR System</td><td>Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA</td><td>170-9703</td><td></td></tr><tr><td>PCR マシン: Eppendorf Mastercycler pro</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA</td><td>950030010</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA</td><td>ベンチトップ pH / mV メーター - 860031</td><td></td></tr><tr><td>フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール (25:24:1)、pH 6.7/8.0.</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0883-400ML</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel: Gellan Gum</td><td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA</td><td>J63423-A1</td><td></td></tr><tr><td>PVX VIGS ベクター: PVX-LIC</td><td></td><td></td><td>Zhao et al., 2016</td></tr><tr><td>リアルタイム PCR マシン: QuantStudio 6 Flex リアルタイム PCR システム</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td><td>4485697</td><td></td></tr><tr><td>リアルタイムPCR試薬:KAPA SYBR&reg;FAST qPCR Master Mix (2x) Kit</td><td>Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA 01887, USA</td><td>7959389001</td><td></td></tr><tr><td>制限酵素:SmaI</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>逆転写試薬:qScript cDNA SuperMix</td><td>Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA</td><td>95107-100</td><td></td></tr><tr><td>RNA 抽出キット:E.Z.N.A. 植物RNAキット</td><td>Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA</td><td>SKU: D3485-01</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor Murine</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0314L</td><td></td></tr><tr><td>RNAzol RT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA</td><td>R4533</td><td></td></tr><tr><td>Soil: Metro-Mix 360</td><td>Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA</td><td>Metro-Mix 360</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ポリメラーゼバッファ</td>ニュー<td>イングランドバイオラボ、イプスウィッチ、マサチューセッツ州01938-2723米国</td><td>M0203S</td><td></td></tr></tbody></table>

ポテトウイルスxベースマイクロrnaサイレンシング(vbms)ポテト中。

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.

ウイルスベースマイクロRNAサイレンシング(VbMS)は、植物におけるマイクロRNA(miRNA)の機能的特性評価のための迅速かつ効率的なツールです。ニコ チアナ・ベンタミアナ、トマト、シロイヌナズナ、綿、小麦やトウモロコシなどのモノコット植物など、さまざまな植物種に対してVbMSシステムが開発・適用されています。ここでは、PVXベースのVbMSベクターを用いて、ジャガイモ中の内在性miRNAを沈黙させる詳細なプロトコルについて述べている。特定のmiRNAの発現をノックダウンするために、目的のmiRNAの標的模倣(TM)分子が設計され、植物ウイルスベクターに統合され、 アグロバクテリウム 浸潤によってジャガイモで発現され、目的の内因性miRNAに直接結合し、その機能を遮断する。

図2 は、静脈に沿った葉層の腹軸側から葉組織の異所性成長を有するPVX-STTM165/166ジャガイモ植物(Katahdin)を示す。トランペット状の葉形成のようなより厳しい表現型も観察されている。これに対し、PVX制御プラントでは、フェノミツ異常は認められなかった。これらの結果は、VbMSシステムがテトラピドポテト植物の内因性miRNA機能を抑制するのに有効であり、PVX-VbMSシステムは特定のmiRNAまたはmiRNAファミリーの機能を決定するための堅牢な遺伝的ツールであったことを示した。
図3 は、葉層の静脈に沿った葉層の腹側から異所性葉組織成長を有するPVX-STTM165/166ジャガイモ植物(ラセットバーバンク)を示す。これらの結果は、PVX-VbMSシステムが主要なジャガイモ品種を含む他のジャガイモ種に適用できることを示している。
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我々は、ポテトウイルスX(PVX)ベースのマイクロRNAサイレンシング(VbMS)システムの詳細なプロトコルを提示し、ポテト中の内因性マイクロRNA(miRNA)を機能的に特徴付ける。目的のmiRNAの標的模倣(TM)分子はPVXベクターに統合され、一過性にジャガイモで発現して標的miRNAまたはmiRNAファミリーを沈黙させる。

ポテトウイルスXベースマイクロRNAサイレンシング(VbMS)ポテト中。

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has ...

植物におけるマイクロRNAの機能解析における従来のアプローチは、主に安定したノックダウン植物の生成に依存していました。このウイルスベースのmicroRNAサイレンシングシステムは、面倒で時間のかかる形質転換を必要としません。ウイルスベースのmicroRNAサイレンシングは、植物のマイクロRNAの機能特性評価のための迅速かつ効率的なツールであり、幅広い二倍体および四倍体のジャガイモ種に適用できます。その手順を実演するのは、私の研究室のポスドク研究員であるJinping Zhaoです。ターゲット模倣モジュールを設計するには、目的のmicroRNAの逆補体配列にミスマッチ配列を、microRNAの10番目から11番目のヌクレオチドに対応する部位に挿入します。短いタンデムターゲット模倣フラグメントを増幅するには、目的の各プライマー、48ヌクレオチドスペースオリゴ、10倍PCRバッファー、dNTP混合物、ハイフィデリティPCR DNAポリメラーゼ、および最終容量50マイクロリットルまでの二重蒸留水を用いてPCR反応を設定します。次に、示されているパラメーターを使用して、標準PCRによってmicroRNAを増幅します。ショートタンデムターゲット模倣物を精製するには、2.5容量のエタノールと1/10容量の3モル酢酸ナトリウムをPCR産物に加えます。激しく混合してから、反応を14, 000倍Gで10分間遠心分離します。上清を取り除いた後、ペレットを1ミリリットルの70%エタノールですすぎ、ペレットを乾燥させてから、ペレットを20マイクロリットルの二重蒸留水に溶解します。T4 DNAポリメラーゼ反応を設定するには、精製した短タンデムターゲット模倣PCR産物を、10倍のT4 DNAポリメラーゼバッファー、1モルのジチオスレイトール、100ミリモルのdATP、T4 DNAポリメラーゼ、および二重蒸留水と混合して、氷上で最終容量5マイクロリットルにします。次に、混合物を摂氏37度で15分間インキュベートし、続いて摂氏75度で20分間インキュベートしてT4 DNAポリメラーゼを不活性化します。PVXベースのVBMSコンストラクトを調製するには、5マイクログラムのPVXライゲーション非依存性クローニングプラスミドを、総容量100マイクロリットルの2.5マイクロリットルのSMA1で消化します。イソアミルアルコールに同量のフェノールをクロロホルムに添加し、精力的に混合して消化されたPVXライゲーションに依存しないクローニング製品に25対24対1の比率を添加し、遠心分離により生成物を回収します。イソアミルアルコールに等量のクロロホルムを上清に対して24対1の比率でボルテックスで加えてから、チューブの内容物を2回目の遠心分離にかけます。スピンの終わりに、上清を新しい遠心分離チューブに移し、2.5容量のエタノールと1/10容量の3モル酢酸ナトリウムを激しく混合して加えます。チューブを遠心分離し、1ミリリットルの70%エタノールと激しいボルテックスでペレットをすすぎます。チューブを再度遠心分離し、上清を取り除き、ペレットを風乾させます。次に、消化したPVXライゲーション非依存性クローニングプラスミドペレットを100 μLの二重蒸留水に溶解します。T4 DNAポリメラーゼ反応をセットアップするには、消化したPVXライゲーション非依存クローニングベクターDNAを、10倍のT4 DNAポリメラーゼバッファー、1モルのジチオスレイトール、100ミリモルのdTTP、およびT4 DNAポリメラーゼを氷上で最終容量5マイクロリットルまで混合します。次に、混合物を摂氏37度で15分間インキュベートし、続いて摂氏75度で20分間インキュベートしてT4 DNAポリメラーゼを不活性化します。短いタンデムターゲット模倣配列をPVXライゲーション非依存的なクローニングベクターにクローニングするには、5マイクロリットルのT4 DNAポリメラーゼ処理ショートタンデムターゲット模倣PCR産物と5マイクロリットルのT4 DNAポリメラーゼ処理PVXライゲーション非依存クローニングプラスミドを混合し、混合物を摂氏70度で5分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、PCR装置でチューブの内容物を毎秒0.1°Cの速度で22°Cに冷却し、目標温度に達したらチューブをサーモサイクラーに30分間放置します。インキュベーションの終了時に、標準的な形質転換プロトコルを使用して、5マイクロリットルのライゲーション非依存クローニング反応産物を大腸菌DH5アルファに形質転換し、50マイクログラム/ミリリットルのカナマイシンを含むLBプレート上で形質転換細菌を増殖させます。ターミネーターサイクルシーケンシングにより短いタンデムターゲット模倣フラグメントの配列を検証した後、検証されたクローンからPVX VBMSプラスミドを単離し、それらを適切なアグロバクテリウム株に形質転換します。生後4週間のin vitroジャガイモ植物にPVX VBMSプラスミドを含むアグロバクテリウムを接種するには、PVX VBMSベクターを含む正の形質転換体を選び、50ミリリットル/ミリグラム/ミリリットルのカナマイシンと50マイクログラム/ミリリットルのリファンピシンを含む50ミリリットルの液体LBに、摂氏28度、毎分220回転で16時間接種します。インキュベーション中に、カナマイシンとリファンピシンを含む少なくとも2つの新しいLBプレートに陽性のアグロバクテリウムコロニーをストリークし、培養物を摂氏28度で1日間増殖させます。600ナノメートルの光学密度が1.0に達したら、遠心分離によりアグロバクテリウム液体培養物を回収し、ペレットを十分な量の浸透バッファーに再懸濁して、600ナノメートルの光学密度を1.0に調整します。室温で6時間のインキュベーション後、1ミリリットルの無針注射器にアグロバクテリウム懸濁液を装填し、片手で1つのジャガイモ植物の膨張した葉をひっくり返して保持します。1本の指で、葉の薄層を同軸側から目的の浸潤部位で支えます。そして、もう一方の手でシリンジを葉の表面に対して垂直に保持し、100〜200マイクロリットルのアグロバクテリウム培養物を椎弓板の軸側に浸透させます。次に、つまようじを使用してアグロバクテリウム培養プレートからコロニーを収集し、浸潤したジャガイモ植物の最初の1つまたは2つの節間と茎の表皮の茎表面を引っ掻き、次に浸潤した植物を温室で2〜4週間成長させます。表現型が現れたら、ハサミを使ってVBMSと対照植物から表現型を含むサンプルを採取します。採取した組織から全RNAを単離し、逆転写酵素PCRを使用してmicroRNAを分析し、各サンプルのmRNA発現を標的とします。これらの画像では、PVXショートタンデムターゲットが165/166ジャガイモ植物を模倣しており、葉脈に沿った葉の軸側からの葉組織の異所性成長が観察できます。トランペット状の葉の形成など、より深刻な表現型も観察されています。一方、PVX制御植物では表現型異常は観察されず、VBSMシステムが四倍体ジャガイモ植物の内因性マイクロRNA機能の抑制に有効であることが示されました。PVXショートタンデムターゲットは165/166ジャガイモ植物を模倣し、葉のラミナの軸方向側からラミナ静脈に沿って葉から組織への異所性成長を示し、PVX VBMSシステムが主要なジャガイモ品種を含む他のジャガイモ品種に適用できることを示しています。葉への浸透と、同じ植物の茎への同じアグロバクテリウム培養物への接種を同時に行うことが不可欠です。標的模倣分子をジャガイモ植物に安定的に導入するトランスジェニックアプローチは、標的マイクロRNAのサイレンシング状態を子孫の世代で維持する必要がある場合に推奨されます。

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