Name: 全血-内皮相互作用と血栓動態をリアルタイムで研究するインビトロ微小流体疾患モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 学ぶ 微小流体系を用いたインビトロ血管モデルで全血と内皮細胞の相互作用をリアルタイムに可視化し、血栓形成と抗凝固薬の効果を評価する方法。個別化医療への応用も可能です。

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私たちは、プラズマタンパク質学科、サンキン研究ランドシュタイナー研究所、アムステルダムUMC、アカデミックメディカルセンター、アムステルダム、オランダ、この原稿に彼の入力に感謝します。この作品は、パエドラと再接続コンソーシアムに授与されたオランダの心臓血管同盟(DCVA)[2012-08、2014-11]とパエドラIMPACTコンソーシアムに授与されたインパルス助成金2018によって支えられました。これらの助成金には、オランダ心臓財団、オランダ大学医療センター連盟、オランダ保健研究開発機構、オランダ王立科学アカデミーによる団体資金が含まれます。さらに、この研究は、高度な助成金'VESCEL'プログラム(グラント番号:669768)の下で欧州研究評議会によって資金提供されました。XDMは、オランダのアムステルダムにあるVU大学医療センターの心臓血管研究研究所(ICaR-VU)の研究助成金を受けています。

この研究は、オランダのアムステルダムにある機関医学倫理審査委員会(METC VUmc、NL69167.029.19)によって承認されました。ヒト被験者の初回細胞隔離および採血は、ヘルシンキ宣言に従って書面によるインフォームド・コンセントが得られた後に行われた。
1. 初発ヒト肺動脈内皮細胞(PAEC)の分離と培養
<ol><li>暖かい完全な内皮細胞培地(cECM)は、5%胎児ウシ血清(FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)、1%内皮細胞増殖サプリメント(ECGS)、および1%非必須アミノ酸(NEAA)を37°Cの水浴中に添加した。手術用ハサミ、鉗子、メスを120°Cの熱滅菌器または70%エタノールで殺菌します。滅菌条件下で層流キャビネット内でPAECの分離を行います。</li>
	<li>高親和性の細胞結合60mm細胞培養皿( 材料表を参照)に2mLのフィブロネクチンを2 mL塗布し、37°Cで少なくとも15分間インキュベートします。</li>
	<li>手術(例えば、ロボ摘出術または肺内膜切除術)から肺動脈(PA)組織を得て、4°Cのコールドコードバッファー(4 mM塩化カリウム、140mM塩化ナトリウム、10mM HEPES、11 mM Dグルコース、および1%P/S、pH=7.3)に保存し、分離するまで氷上に保ちます。</li>
	<li>組織除去後2時間以内にPAから内皮細胞を単離する。鉗子でPAを取り、PBSで洗うために10センチペトリ皿に入れてください。PAがまだリングである場合は、はさみで開いた肺動脈を切り開きます。内皮は容易に損傷を受けたり、取除かれるので、器の最も内側の層に工具で触れないように注意してください。</li>
	<li>細胞培養皿からフィブロネクチンを取り出し、4 mLのcECM培地を加える。</li>
	<li>鉗子とPAティッシュを取り、媒体に置く。一方、慎重にメスで媒体に容器の内層を掻き取ります。しばしば、脂質蓄積は血管壁に見ることができる。細胞の成長に影響を与えるため、これらを省略してみてください。</li>
	<li>内皮細胞の小さなコロニーが出現し始めるまで、培養中の細胞を保持します。</li>
	<li>1日おきに培地を交換してください。繊維芽細胞が培養物を汚染する場合は、メーカーの指示に従ってCD144用磁気親和性細胞分離をキットで精製する( 材料表を参照)。最初の精製には2カラム法、連続した精製ごとに1カラム法を使用します。一般に、培養物は、フローサイトメトリーが≤10%汚染細胞を検出すると純粋に定義される。</li>
	<li>実験用に十分なPAICが成長するまで、1:3~1:4の比率で細胞を分割します。PAECs を使用する準備ができたら、次の手順に進みます。</li>
	<li>精製後、一次内皮細胞はEC特異的マーカー(例えば、VE-カドヘリン、CD31、TIE2)の存在、平滑筋細胞(α-SMA)、線維芽細胞(ビメンチン)、上皮マーカー(サイトケラチン)の存在を特徴付ける必要がある(図1B)。</li>
</ol>2. フローチャンバとPAEC単層の調製
注: 仮説に応じて、市販の流れチャンバー( 材料表 および 図1CオプションA、プロトコルのステップ2.1を参照)またはカスタムメイドのマイクロ流体フローチャンバー(図1CオプションB、 プロトコルのステップ2.2)のいずれかを使用します。
<ol><li>市販マイクロスライドにおける内皮単層の細胞播種 注:市販の流れチャンバは使いやすく、高いせん断率で使用できるチャネル全体に層流パターンを提供する。これらのマイクロスライドは、マルチチャンネルの並列実行を可能にし、正確で再現可能なフロープロファイルを提供するように設計されています。反転顕微鏡に最適化されているため、高品質の蛍光画像を取り込めます。さらに、流れチャンバの様々な次元は異なったチャネルサイズまたは幾何学で利用できる。これらのマイクロスライドは小さい次元を有し、多対的な実行を可能にするので、このアッセイのために6-ウェルの流れチャネルが好ましい。<ol>
<li>6ウェルフロースライド(3.5 mm幅x 0.4 mm高さx 17 mmの長さ)の1チャンネルをコーティングするには、1チャンネルあたり0.1%のゼラチンを30 μL使用し、37°Cで少なくとも15分間インキュベートします。</li>
		<li>1つのチャネルをシードするには、コンフルエントPAIcの10 cm2 をトリプシン化し、室温(RT)で7分間300 x g でスピンダウンします。</li>
		<li>PAECsを600 μLのcECMおよびピペット100 μL(1.5 cm2) のセル懸濁液1チャンネルで中断します。これは毛管の行為によってマイクロスライドをカバーする。遅すぎると気泡が形成されます。ピペットの際にもう少し力を使って気泡の形成を避けてください。 注: 細胞密度は内皮表現型に影響を与えます。チャネルの表面積は 0.6 cm2 であるため、チャネルあたりのコンフルエント セルの合計 1.5 cm2は過剰に対応します。実験を開始する前に、これらの細胞を最大合流に達するまでチャネル内でさらに6日間培養する。</li>
		<li>さらに50 μLのcECMをチャネルに加えて、37°C、5%CO2で一晩インキュベーション2に十分な培地を提供します。次の日に培地を変更して、非結合細胞を洗い流します。</li>
		<li>細胞を37°C、5%CO2で6日間培養し、PAECがしっかりとコンフルエントな単層を形成できるようにします。 1日おきに150 μLのcECMで交換してください。</li>
		<li></li></ol></li><li> <ol><li><ol><li><li><li> </li><li><li><li></ol></li><li><ol><li><li><li><li></ol></li><li><ol><li> </li><li><li><li><li></ol></li></ol></li><li><ol><li><li> </li><li><li><li><li></li><li></li><li></ol></li></ol><ol><li><li><li> </li></ol><ol><li><li><li></li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61068/61068eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61068/61068eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61068/61068eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61068/61068eq4.jpg"> <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61068/61068eq5.jpg"> <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61068/61068eq5.jpg"> </li><li></li></ol><ol><li><li></ol><ol><li></li><li><li></ol><ol><li><ol><li></li></ol></li><li> </li><li><li></ol><ol><li><li></li><li> </li><li></li><li></li><li></li></ol>

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著者らは利益相反を宣言しない。

凝固は、内皮と血液成分の間の複雑で時間的に制御された相互作用の結果である。この インビトロ アッセイは、内皮細胞の血栓形成特性をリアルタイムで調べる方法を提示する。様々なタイプの原発ヒト内皮細胞を使用することができ、臓器および患者特異的な方法 でのその際 の血栓症を容易にする。本研究では、健常ドナーとCTEPH患者から分離されたPAECsの血栓原性特性を比較するこのプロトコルの使用を示した。生血栓形成は、ヒスタミン活性化内皮上の健康な被験者からの全血の灌流によって研究されたが、DOACの効果は抗血栓剤として試験された。
市販のマイクロチャネルの使用に加えて、代表的な結果に示すように、カスタムメイドのマイクロ流体チャネルの導入は、血栓形成に対する血管幾何学的変化の影響の研究を可能にする。例えば、分岐点または狭窄で流れが減少すると、せん断応力が増加し、より多くの血小板活性化36が生じる。しかし、これらのカスタムメイドのマイクロ流体チャネルの重要な制限は、ステップ2.3.2で説明したように、ECsの安定した単層を形成するために高い細胞数の要件です。これは、患者由来細胞が不足している場合に制限要因を提示する可能性があります。市販のマイクロスライドの強みは、細胞培養のために表面積が改変され、成長領域が大きくなり、それによりECsがコンフルエントで安定した単層を形成できることである。一方、表面積が大きいと、大きなルーメンが生じてしまう。 式1によると、これはカスタムメイドのマイクロ流体と同様の流量に達するためにより高い血液量を必要とします。
このプロトコルの改善は、ライブECの損失やバリアの完全性の変化を調査することです。このプロトコルにおけるEC損傷は、実験の最後にのみ測定される。ライブトラッキングの場合、ICにはmCherry VE-cadherin(例えば37)でタグ付けできます。しかし、これは効率的なウイルストランスフェクションを伴う高度に最適化されたプロトコルを必要とするため、電気セル基板インピーダンスセンシング(ECIS)は、内皮の完全性およびバリア機能38を研究する代替手段として使用することができる。特殊なECIS流路上の灌流により、フロー下での内皮バリア完全性の縦方向モニタリングが可能です。これらの特定のECIS機能により、内皮バリア特性と血栓形成の並列測定が可能です。特にカスタムメイドアレイにおける並列ECバリア測定の代替方法として、ECバリア特性に応じて、内腔から拡散するペルフューザート内の蛍光デックストランスの使用が挙げられます。
記載されたプロトコルの制限は、VCが人体から取り除かれ、組織培養プラスチック上で培養され、硬く人工的な基質であることである。細胞は生物物理学環境に適応します。血小板活性化と壁剛性39との関連があるので、血小板活性化に対する内皮応答に影響を与える可能性がある。これらの培養プラスチックへの適応にもかかわらず、細胞は、5分の輸血後に血小板付着およびフィブリン沈着の異なるパターンを発揮した対照、CTEPH-PAEC、およびHUVECと示すように、健康なドナー由来のECと直接比較して同定できる疾患特異的特性を維持する。
他のプロトコルとは対照的に、このシステムは全血を使用し、他のシステムは血小板および白血球19、20、2120のような単一の血液成分とのEC相互作用を21研究する。19円形血管形状と軟質細胞外マトリックスを用いた血管モデルにおける内皮機能の研究を可能にする、より高度な微小流体モデルが開発されている。ただし、これらは HUVECs40、 41,、42で最適化されています。The novelty of the described protocol is the use of primary ECs combined with whole blood bringing the modelling of in situ thrombosis one step closer to in vivo conditions.患者由来のECsおよび患者由来の血液の使用のための議定書を最大限に活用した、より、疾患のモデル化をvitroで最適化し、個別の血栓形成および薬物治療の評価を可能にする。
記載されたプロトコルは、患者由来細胞に対する抗凝固療法の効果を研究するために適用することができる。ダビガトランを用いて血栓形成を阻害する一方で、凝固カスケードで因子Xaを直接阻害するリバロキサバンなどの他の抗凝固剤を使用することが可能である。クロピドグレルやアスピリンのような直接血小板阻害剤も同様に研究することができ、これらは血小板がECsに結合する止血症の一次相に作用する。最終的には、患者自身の血液と相互作用する患者特異的なECの血栓原性能力を使用して、個々の患者に対する抗凝固療法の個人的な影響を予測することができる。さらに、特定のタンパク質のノックダウンは、追加の機能情報を提供することができます。
説明されたプロトコルには、灌流実験を成功させるために重要ないくつかのステップがあります。まず、原細胞の単離の間に、高度に純粋なEC培養を得る必要がある。第二に、ACが安定したコンフルエント単層を形成することが重要である。そうでなく、せん断応力のわずかな変化が内皮損傷および凝固カスケードの活性化を引き起こす可能性があり、血小板が原始膜に結合し始め、偽陽性の結果をもたらす。第三に、気泡が内皮に損傷を与え、結果に影響を与える可能性があるので、気泡を防ぐことが不可欠です。
塩化カルシウムと塩化マグネシウムでクケイトされた血液を再石灰化した後、直ちに灌流実験を開始することが重要である。再石灰化は血小板の活性化および血栓形成において迅速な応答を誘発し、サンプル中に速い凝固をもたらす。
結論として、血栓症中の全血内皮細胞相互作用を研究するための非常に汎用性の高いプロトコルを記述する。

内皮は血管の内部細胞層を形成し、周囲の組織から血液を分離する。マイクロ環境を積極的に調節し、外部刺激に応答する動的器官として説明されている。血液を流れる血液との直接的な接触のために、内皮は止血および血栓症の制御において極めて重要であり、血小板凝集、凝固、および線維化を制御する主要な調節分子の多くの主要な供給源である2。健康な非活性化された内皮細胞(EC)は、血小板活性化を打ち消し、血球の血凝固および血栓形成を防止する複数の分子を産生し、プロスタサイクリン、トロンボモジュリン、または組織因子経路阻害剤(TFPI)2、3などの血流を維持する。2,3これにより、血小板の付着、血小板凝集、血栓形成を防ぐことができます。血管壁の損傷または活性化は、局所的な血小板付着および血塊形成を開始する前凝固性内皮表現型22,44をもたらす。内皮活性化血小板がフォン・ヴィルブランド因子(VWF)に付着すると、ICから放出される多量体タンパク質、または下層内皮マトリックスの露出結合部位に付着する。続いて、血小板の分子変化および組織因子への曝露(TF)は、凝固系の活性化を開始し、フィブリン重合55、66によって血栓形成を誘導する。一緒に、得られた血栓は再内皮化による創傷閉鎖の基礎を提供する7。凝固系の摂動は、フォン・ヴィレブラント病、血友病、または血栓症などの出血性疾患をもたらし、しばしば内皮血性経路22,33の調節不秩序な前血栓および抗血栓バランスに起因する。
止血のプロセスは、動脈循環と静脈循環の両方で起こる。しかし、動脈血栓症と静脈血栓症の根底にあるメカニズムは根本的に異なります。動脈血栓症は虚血性心疾患に見られるように、主に高剪断ストレスの条件下でアテローム硬化性プラークの破裂によって駆動されるが、静脈血栓症は、主に、stasis88、9、109,10の状態で内皮損傷の不在のときに発症する。深部静脈血栓は肺動脈に向かって塞栓して進み、そこで肺塞栓症を引き起こす。これは、慢性血栓塞栓性肺高血圧症(CTEPH)11、12、13、14の発症を含む、chonic肺疾患の発症を促進する可能性のある有意な機能能力11,12,の障害につながる慢性血管閉塞をもたらす可能性がある。13,14CTEPHは、血栓塞栓性物質による肺動脈の閉塞による肺圧の上昇を特徴とする15の抗凝固療法の少なくとも3ヶ月後である。肺塞栓症に加えて、肺内皮は、肺動脈の皮血栓症および慢性閉塞を促進するCTEPHにおけるプロトロンボメティック環境を提供し、最終的に心不全を引き起こす血圧の上昇を引き起こし、16,17,17を治療しないと仮定される。
過去数年間、血小板機能と凝固18を測定して血栓形成を調べるアッセイの開発に至った。しかし、それらのほとんどは、コラーゲンまたはフィブリンのような単一の細胞外マトリックス成分との全血の相互作用を研究するか、または内皮血小板または内皮-白血球相互作用19、20、21、22のような単一の血液成分と相互作用する内皮19,機能を研究する。,21,22これらのアッセイは、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)で最も一般的に行われ、これらの細胞は容易に得られる。しかしながら、血行抑制遺伝子は、血管樹、血管型、および器官系23,24,24を横切って差動発現し、これは、HUVECを用いて動脈血栓症または肺塞栓症に関与する内皮細胞を表すことを問題のある23にする。
EC可塑性に加えて、疾患特異的血行力学的変化および血管形態の変化は、正常な内皮25における血栓形成を促進することができる。より高い剪断速度は、局所的な血管収縮または血管形状の変化に起因して、例えば、急性血栓形成をもたらし、血流の停止を促進する狭窄を引き起こす26。カスタムメイドのマイクロエンジニアリングされた流路を使用することで、(patho)生物学を代表する血管形状を具体的に設計することができます。このようにして、健康または疾患を有するEC27に対する局所生物力の影響を研究することができる。
凝固カスケードには異なる相や分子を標的とする抗凝固療法があり、これらはすべて特定の障害に特有の特定のリスクと利点をもたらします。本論文で説明する疾患モデリングのアプローチは、血栓動態に及ぼす様々な抗凝固療法および抗血小板療法の効果をテストするのに特に適している。
目的は、プライマリICを含む血栓症のモデルを提示し、使用されるプライマリICの種類に応じて様々な形態の血栓症の分析に適した汎用性の高いモデルを生み出す。図として、CTEPH患者の肺動脈内皮細胞を、血栓形成に関与するすべての成分(血小板、白血球、赤血球、凝固タンパク質、補因子)を含む全ヒト血液との相互作用に使用した。このアプローチは、商用の並列流路または特定の血管設計を備えたカスタムメイドのマイクロ流体流路に適用できます。したがって、モデルは最終的に血栓形成と分解能の研究、疾患モデリングにおける炎症反応の評価、抗血小板または抗凝固療法、そして最終的には個別化医療に使用することができる。
この研究は、原発性ヒト肺動脈内皮細胞の単離を記述する。他の初次ヒト内皮細胞タイプの単離については、肺微小血管内皮細胞25、ヒト臍静脈内皮細胞28、および血液循環内皮コロニー形成細胞図1A29を含む、以前に公表された方法を参照する。

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>20 mL シリンジ</td><td>BD</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>20X 対物レンズ</td><td>Olympus</td><td>N1492900</td><td>LUCPLFLN20XPH/0.45</td></tr><tr><td>2-Propanol (IPA)</td><td>Boom</td><td>760514555000</td><td></td></tr><tr><td>Aladdin シリンジポンプ</td><td>ワード精密機器</td><td>AL-4000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488-Fibrinogen</td><td>Invitrogen</td><td>F13191</td><td>15 ug/mL</td></tr><tr><td>Alexa647-ヤギ抗ウサギ</td><td>Invitrogen</td><td>A21245</td><td>1:100</td></tr><tr><td>生検パンチ 直径 1 mm</td><td>テッド・ペラ</td><td>15110-10</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM-Red</td><td>Invitrogen</td><td>C3099</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>CD42b-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-208</td><td>1:100</td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>メルク</td><td>100244</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン I型、ラットテール</td><td>コーニング</td><td>354249</td><td>0.1 mg/mL</td></tr><tr><td>コーニング CellBIND 表面 60 mm 培養皿</td><td>コーニング</td><td>3295</td><td></td></tr><tr><td>クロスフローフード</td><td>バサン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デシケーター</td><td>デュラン</td><td>2478269</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>メルク</td><td>14431-43-7</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>内皮細胞培地 (ECM)</td><td>ScienCell</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン ヒト血漿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>フローチューブ</td><td>同上</td><td>10831, 10841</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>メルク</td><td>104070</td><td>0.1%</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>ミクロンスライド VI 0.4 フローチャンバー</td><td>同上</td><td>80606</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>v1.49</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>ラボオーブン</td><td>Quincy</td><td>10GC</td><td></td></tr><tr><td>LS720 蛍光顕微鏡</td><td>Etaluma</td><td>LS720</td><td></td></tr><tr><td>ルアーコネクター</td><td>ibidi</td><td>10802, 10825</td><td>オスエルボーコネクター, メスチューブコネクター</td></tr><tr><td>MACS 磁気ビーズ (アンチCD144)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-857</td><td>1:5</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド, 76 x 26 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAAA000001##12E</td><td></td></tr><tr><td>ネガティブフォトレジスト、SU-8</td><td>Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸 (NEAA)</td><td>ロンザ</td><td>13-114E</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>メルク</td><td>818715</td> PBS ペニシリン/ストレプトマイシン<td>中の 4% PFA</td></tr><tr><td>(P/S)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>1%</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>カルシウムまたはマグネシウム</td></tr><tr><td>血漿なしチャンバー、CUTE</td><td>フェムトサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン(PDMS)、シルガード184</td><td>ダウ</td><td>101697</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム採血チューブBD</td><td></td><td>363048</td><td></td></tr>ク<tr><td>エン酸三ナトリウム</td>メル<td>ク</td><td>106448</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA(0.05%)、フェノールレッド</td><td>Gibco</td><td>25300-045</td><td></td></tr><tr><td>VE-カドヘリン(D87F2)-XP</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>2500</td><td>1:300</td></tr></tbody></table>

全血-内皮相互作用と血栓動態をリアルタイムで研究するインビトロ微小流体疾患モデル

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

血栓の形成は、内皮細胞、その基礎となるマトリックス、様々な血液細胞、およびタンパク質との間の複雑な相互作用を伴う。内皮は、血小板凝集、凝固、および線維化を制御する主要な止血分子の多くの主要な供給源である。血栓症のメカニズムは何十年も前から調べられてきたが、 インビトロ 研究では、主に、下皮系マトリックスが露出する血管損傷の状況、または単一の血液成分との細胞間の相互作用に焦点を当てている。我々の方法は全血と無傷の、コンフルエントな血管細胞ネットワークとの間の相互作用を研究することを可能にする。
原発性ヒト内皮細胞を利用することにより、このプロトコルは、血栓動態に対する内皮細胞の影響を研究するユニークな機会を提供し、血栓性疾患の病態生理学に関する貴重な洞察を提供する。カスタムメイドのマイクロ流体流路を使用することで、疾患固有の血管形状の適用とモデル特定の形態学的血管変化を可能にします。血栓の発達は、血小板付着およびフィブリン沈着によってリアルタイムかつ定量的に特徴づけられる。変性血栓動態における内皮機能の効果は、特定の分子の免疫蛍光染色による事後分析によって決定される。
代表的な結果は、実験のセットアップ、データ収集、およびデータ分析を記述します。研究の質問に応じて、細胞タイプ、せん断率、チャネル幾何学、薬物療法、および後分析手順を含む、すべてのセクションのパラメータを調整することができます。このプロトコルは、慢性血栓塞栓症患者の肺動脈内皮上の血栓形成を定量化することによって検証される。

代表的な結果は、実験のセットアップ、データ収集、およびデータ分析のそれぞれのステップを表す3つの部分に分けることができます。研究課題に応じて、各ステップのパラメータを変更できます。提示されたデータは、血栓形成に対する内皮の影響を研究するために適用される。
実験用セットアップ 内皮細胞は、場所や時間に応じて、健康と病気23の間に、構造と機能において非常に不均一であることを確立されています。内皮細胞の様々な供給源は、内皮と血液相互作用を研究するために使用することができ、この場合、HUVECおよびPAICを市販した(図1A)。HUVECは実験室モデルで最も一般的に使用されてきたが、PAICは肺動脈から患者由来の単離細胞である。さらに、肺循環または血液循環内皮コロニー形成細胞(ECFC)25、28、29から微小血管内皮細胞(MVEC)を単離するために利用可能な確立されたプロトコル25,28,29がある。
単離後、内皮細胞は、内皮表現型を確認するためにVE-カドヘリン、CD31、およびTIE2染色によって特徴付けた。αSMAおよびサイトケラチンの存在に対する特徴は、線維芽細胞または上皮様表現型の存在を示した(図1B)。非常に純粋なECsの集団を得た後、3〜5細胞を通過して、商業マイクロスライドまたはカスタムメイドのマイクロ流体流路を播種した(図1C)。市販のマイクロスライドは主に平行流室、または高さまたは分岐角で明確に定義されたパラメータを有するY字型チャネルであるが、マイクロ流体スライドを用いると、実験パラメータを生体内血管形状および血流ダイナミクス31に適応させることができる。しかし、カスタムメイドのマイクロ流体サイズは小さく、細胞の広がりを制限し、より多くの細胞死を誘導する傾向がある32,33.細胞の余剰を使用すると、細胞のほんの一部しか付着しなさないだろうという事実を補います。これは、狭窄が導入されたときに観察され、そこで内皮細胞は、平行なマイクロ流体チャネルと比較してより細長い表現型を示した(図1D)。商業流れチャンバは細胞が結合できるより大きい表面積を有する。これにより、シード処理に必要なセル数が少なくなります。
内皮細胞と血液の相互作用を研究するために、全血を内皮単層に浸透させた。浸出した血液は、実験の日と灌流の直前に回収された。細胞は、VWF放出および血小板付着を30分灌流前に誘導するためにヒスタミンで刺激した(図1E)34,35。34,35Figure 1E寸法が小さいため、カスタムメイドのマイクロ流体チャネルは、より小さな血液量の使用を可能にしました。
データ収集 PAECs上の血栓形成を調査するために、Calcein AM-赤色蛍光標識血液細胞およびAlexa488-共役フィブリンを2.5 dyne/cm2で5分間灌流した(図2A–C)。接着性血液細胞および沈着したフィブリンを定量した。画像は30s毎に取得し、ImageJで定量化した。非接着血小板の自己蛍光を排除するために、背景を減算することが重要であった。しきい値の三角形アルゴリズムは、最小限の背景を定義するために使用されています。小さな血小板凝集体の測定を可能にした(図2D)。
予想されるが、非刺激条件下では、内皮に血小板およびフィブリンの結合はなかった。VWFの放出および血小板結合を促進するために、PAICはヒスタミンで刺激され、2.5分後に血小板付着が直ちに高原に達した。このとき、血小板は、血小板凝集およびフィブリノーゲン切断をフィブリンに誘導するオートクリン因子を分泌し始めた。フィブリンを3分後に沈着させ、4分後に血小板で安定した凝集体を形成した(図2E)。
この効果が直接経口抗凝固剤(DOAC)によって阻害される可能性があるかどうかを調べるため、血液を10 nMダビガトランで治療した。ダビガトランを血液希釈に添加し、そこで凝固経路における因子IIaを阻害し、フィブリン線維を形成するフィブリノーゲンの切断を阻止した。ダビガトラン処理血液が刺激PAICに浸透した場合、血栓形成は主にフィブリン沈着を遅らせることによって直接阻害され得る(図2F)。
データ分析 血栓形成に対する様々な内皮源の影響を調べ、5分の輸血時の細胞変化を分析した。内皮を固定し、共焦点顕微鏡下でイメージングする前に付着血小板をCD42bで標識した。これは、血液中の機能不全凝固因子を示す可能性のある血小板およびフィブリンの共局在化のための詳細な分析を提供した。血栓形成におけるECの影響は、標準免疫蛍光染色法によって決定された。内皮細胞接触は維持され、VEカドヘリン染色によって確認されたように、内皮間隙間の基底行列ではなく、内皮単層の上に形成された血栓を示す(図3)。さらに、異なる細胞源を用いることによって、内皮上に血栓形成の異なるパターンが生じる。HUVECは静脈内皮細胞であり、限られた血小板付着およびフィブリン沈着を示したが、CTEPH患者からの疾患原発PAECは健康なPAECと比較してヒスタミン刺激に対して豊富な血小板付着およびより多くのフィブリン沈着を示した。これは、CTEPH患者の内皮が血管活性化に対する応答性が高く、血栓形成の増加を示すことを示唆している。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61068/61068fig1.jpg"> 図1:プロトコルの概略図(A)様々なソースおよび異なるタイプの内皮細胞を単離し、灌流実験用のマイクロ流体流路で使用するために培養した。異なるタイプの内皮細胞の代表的な明視野画像。スケールバー=50μm(B)分離細胞は、内皮表現型を確認する免疫蛍光染色によって特徴付けた。Bスケールバー= 50 μm(C)セルは、市販のフロースライドまたはカスタムメイドのマイクロ流体チャネルのいずれかにシードすることができます。(D) 異なるチャネル形状で成長したHUVECの代表的な明視野画像。スケールバー= 50 μm(E) 輸血実験の実験クエンセレートした血液を採取し、生理食塩水緩衝液で希釈し、注射器ポンプで内皮細胞を透過させた。この図の肺と臍帯は、創造的な共通の帰属3.0一般的なライセンスの下でライセンスされたServierメディカルアートから変更されました。http://smart.servier.com/<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61068/61068fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61068/61068fig2.jpg"> 図2:血栓形成の画像取得と定量化(A)接着したカルセインAM-Red標識血小板の代表的なタイムラプスイメージングと、非刺激PAECs(B)上の全血灌流後1、3、および5分でAlexa488-共役フィブリンを堆積Bさせ、ヒスタミン刺激PAIC上に。(C) ヒスタミン刺激PAIC上に浸透したダビガトランを介して全血を注入した1、3、および5分間の灌流における血小板付着およびフィブリン沈着の代表的なタイムラプス画像。スケールバー = 50 μm(D) ImageJにおける画像定量の概略図。(E)非刺激およびヒスタミン刺激内皮上の30s毎の血小板付着およびフィブリン沈着の定量化。(F)血小板付着およびフィブリン沈着によって定量化された血栓形成に対するダビガトランの効果の定量化。データは、SD、n = 3±平均として表されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61068/61068fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61068/61068fig3.jpg"> 図3:内皮細胞上の血小板付着およびフィブリン沈着における血栓形成を特徴付けるフロー実験の代表的な共焦点像。 内皮細胞接触はVEカドヘリンによって特徴付け、対照PAECs、患者由来CTEPH PAICおよびHUVECで測定された。スケールバー= 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61068/61068fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

患者由来の内皮との全血相互作用を調べるインビトロ血管疾患モデルを紹介する。このシステムは、様々な状況下での原発性内皮細胞の血栓形成特性の研究を可能にする。この方法は、凝固の異なる段階でのその際の血栓性および抗凝固療法において評価するのに特に適している。

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...

この体外病モデルは、全血と患者由来細胞、具体的には内皮、血栓原性および抗凝固剤の有効性を評価する相互作用を研究するために使用することができる。これは、内皮細胞は、様々な状況で使用することができ、カスタムメイドのマイクロ流体を導入するか、または血流パラメータを調整することによって変更することができます。さらに、このモデルは、炎症性の状態で血栓のダイナミクスを研究したり、抗凝固剤および抗血小板療法の効果を評価するために使用することができます。最終的には、これらのアプローチは、個別化された医療の方法で使用することができます。外科用ヒト肺動脈組織サンプルを得た後、1ミリリットルフィボロネクチン当たり5マイクログラムの2ミリリットルで高親和性細胞結合60ミリリットル細胞培養皿をコーティングし、少なくとも15分間摂氏37度で皿をインキュベートする。インキュベーションの終わりには、滅菌条件下で層流キャビネットに滅菌鉗子を使用し、組織をPBSのペトリ皿に移す。組織がまだリングにある場合は、内皮が損傷して除去されやすいように、血管の最も内側の層に触れないように、はさみで開いた動脈を切断します。フィブロネクチンを取り除いた後、完全な内皮細胞培地の4ミリリットルを皿に加え、鉗子を使用して組織サンプルを媒体に移し、メスを使用して容器の内層を慎重に媒体に削り取り、血管壁に観察される脂質蓄積を避けるように注意する。細胞が収穫された後、プレートを細胞培養インキュベーターに入れる。繊維芽細胞が培養を汚染する場合は、CD144に磁気親和性細胞分離を使用し、細胞を精製するメーカーの指示に従ってください。一般的に、培養は純粋なものと定義され、フローサイトメトリーが10%以下の汚染細胞を検出する場合である。実験用に十分な数の内皮細胞が得られた場合、一次内皮細胞は、内皮細胞特異的マーカーの存在および平滑筋および上皮細胞マーカーの存在を特徴とすることができる。流れチャンバの準備のために、0.1%ゼラチンの30マイクロリットルで6つの井戸流れスライドの1チャネルをコードし、37°Cで少なくとも15分間このスライドをインキュベートする。商業流れチャンバに加えて、特定の次元のカスタムメイドの流れチャンバーは、血栓のダイナミクスに対する血管形状の影響を研究するために使用することができる。スライドがインキュベートされている間、 EDTAとトリプシンと沈血を伴うコンフルエント肺動脈内皮細胞培養から細胞を収集し、遠心分離によって細胞を600マイクロリットルの完全な内皮細胞培地に再び懸濁させ、強引に、各チャネルに100マイクロリットルの細胞を加え、完全な内皮細胞チャネルに50マイクロリットルを追加して、完全な内皮細胞チャネルに追加の50マイクロリットルを追加します。、摂氏37度および5%の二酸化炭素での一晩のインキュベーションに十分な培地を提供するために、翌日、非結合細胞を洗い流すために培地を変える。培養で6日後、細胞は安定したコンフルエント単層を形成しているはずである。7日目の肺動脈内皮細胞培養では、抗凝固治療を受けていない被験者から109個のクエン酸抗凝固管に静脈血球サンプルを取得し、血液を50ミリリットルチューブに移す。血液にはウイルスやその他の感染因子が含まれている可能性があります。したがって、常に手袋を着用し、人間の材料を扱うための安全指導に従うことが重要です。1~10,000マイクログラムのカルセインAMレッドと1ミリリットル当たり50マイクログラムの血液細胞を蛍光的に標識し、Alexa 488フィブリノーゲンを加え、37°Cで血液を15分間インキュベートして完全な吸収を可能にする。灌流の30分前に、肺動脈内皮細胞を、内皮細胞培地中の1マイクロモルヒスタミン100マイクロリットル、および他の添加物を含まない1%のウシ胎児血清で治療する。そして、洗浄システムチューブをすすぐために洗浄バッファーで満たされた20ミリリットルのシリンジを使用し、洗浄バッファーの2ミリリットルで3分の1〜20ミリリットルのシリンジをロードし、シリンジをシリンジポンプにロードします。2番目の20ミリリットルシリンジを使用して、フローチューブにヒッピーと1%のウシ血清アルブミンを含むバッファを充填し、肘の形状のローラコネクタを使用してチューブを慎重にマイクロスライドに接続し、スライドのコンセントを注射器に接続し、スライドを含むセルをステージに配置して顕微鏡から修復し、実験用のセットアップを組み立てます。、顕微鏡を調整し、イメージングのパラメータを設定します。強調血液の再石灰化。そして、これは凝固の幸せな共同スポンサーであり、さらにこれは内皮細胞層を損傷し、結果に影響を与えるので、気泡の形成を避けるようにしてください。灌流の直前に、再石灰化バッファーで血液を2回希釈し、マイクロスライドの入口チューブを血液のチューブに入れ、注射器ポンプで開始を押します。血液が内皮を流れ始めるとすぐに、顕微鏡を押して、事前に選択されたアクティブチャネルと関心のある領域の位置を使用して、5分間15秒ごとに画像を取得します。分析の最後に、記録と注射器ポンプを停止し、適切にクリーンアップします。カルセインAMレッドとアレクサ488共役フィブリノーゲンの添加と血小板のラベリングは、血小板接着および繊維および沈着による血栓形成の調査を可能にする。非刺激条件下では、内皮に血小板またはフィブリンの結合がない。ヒスタミンによる刺激は、2.5分後に血小板付着の即時増加をもたらし、この時点で、血小板凝集およびフィブリノーゲン切断をフィブリンに誘導するオートクリン因子を分泌し始め、3分後に繊維および沈着をもたらし、4分後に血小板と安定した凝集物を形成する。直接抗凝固剤による治療は、未処理の血液と比較して血栓形成および血小板接着の両方を阻害する。肺動脈内皮細胞血小板相互作用の免疫蛍光分析は、5分間の灌流後の肺動脈内皮細胞相互作用の維持を明らかにし、細胞接触は、血管内皮カドヘリン染色によって確認されるように、内皮間隙間の基底のマトリックス上に血栓が形成されることを示す。ヒト臍帯静脈内皮細胞は、肺動脈内皮に比べて血小板付着およびフィブリン沈着量が少ないことを示す。特に、慢性血栓塞栓性肺高血圧患者由来の疾患原発性肺動脈内皮細胞は、健康な細胞に比べて血小板付着およびフィブリン沈着量の増加を示す。内皮の血栓形成性は、血管床の起源または生物学的背景の部分のような複数の要因に依存する。このプロトコルを使用して、血管および血液成分における固有の機能不全、ならびに抗凝固療法の有効性は、血栓症止血症の異なる段階で試験することができる。このプロトコルは、血液およびテオ相互作用を理解するために使用することができ、抗凝固療法に対する患者固有の応答を予測する究極の可能性を有する様々な血栓塞栓性疾患において。

in-vitro-microfluidic-disease-model-to-study-whole-blood-endothelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

微小サイズのチャネル（&lt;30μm）を持つマイクロ流体デバイスの全体の内部の三次元表面全体に文化内皮細胞単層をに方法が記載されています。この...

血液疾患における血管相互作用を研究するためのEndothelializedマイクロフルイディクス

マイクロチャネル·オン·チップ·プラットフォームは、フォトリソグラフィリフローフォトレジスト技術、ソフトリソグラフィー、マイクロフルイディクスとの組み合わせによって開発されました。内皮マイクロチャネルプラットフォームは、 インビボにおける微小血管の3次元（3D）ジオメトリを模倣する制御された連続かん流の流れの下で実行され、高品質かつリアルタイムイメージングを可能にし、微小血管の研究に適用することができる。...

マルチ深円形の断面内皮マイクロチャンネル·オン·ア·チップの開発のための手順

人間の血管血液相互作用を調査するための信頼性のあるモデルへのアクセス性が欠けています。私たちは、血液中(ELISA)と血管コンパートメント内(顕微鏡)の両方の細胞相互作用を調査するために、培養された初代ヒト内皮細胞とヒト全血を組み合わせたin...

小説インビトロヒト全血と内皮の間の相互作用を研究するためのモデル

このプロトコルは、疾患の病理における細胞応答を決定するのを助けるために、インビトロで生理学的または病理学的な血流を複製します。血液ポンプの下流ダンピング室の圧力を導入することにより、脈管構造を横切る血流が血管内皮または模倣共培養の単層上で要約し、課すことができます。...

血管細胞リモデリングの研究への応用生理学的および病理学的血流のインビトロモデル

血小板輸血と止血は、血液貯蔵血小板の機能を調査するために、血液再構成とマイクロ流体フローチャンバーを使用してモデル化されました。このデータは、血小板蓄積病変がin...

マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しました<em&gt;インビトロ</em

Primary Human Umbilical Vein endothelial cells...

の開発と特性評価<em&gt;インビトロ</em&gt;微小血管ネットワークおよび内皮の定量的測定の[Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt;私</sub&gt;と一酸化窒素の生産

本稿では、同時に血小板機能および凝固を測定止血の実験モデルを説明します。血小板およびフィブリンの蛍光をリアルタイムで測定し、血小板付着率、凝固速度と凝固の開始が決定されます。モデルは、輸血用の濃縮物で流下血小板凝固促進特性を決定するために使用されます。...

血小板輸血や止血のためのマイクロ流体フローチャンバーモデルは、リアルタイムでの血小板沈着およびフィブリン形成を測定します

全体、高血圧症非血の研究と凝固解析を可能にする生体外モデルを提案します。健康な内皮細胞の自然な抗凝固効果に依存するシステムの抗凝固療法と血管内皮細胞の活性化血液凝固になります。...

3 D 細胞培養と非高血圧症全血を用いた血管内皮細胞の抗凝固および抗炎症作用の評価

ここで示されているのは、標準化された体外血球ループモデルのプロトコルです。このモデルは、輸血チューブまたは血管ステントのヘモ適合性を試験することを可能にする ISO (国際標準化機構) 標準 10993-4...

血管医療機器の血球適合性と宿主細胞活性化を調べるインビトロ血球ループモデル

in vitro血栓溶解アッセイは、消化されるモデル血栓や血栓溶解が起こっている環境など、生体内条件を再現するのに苦労することがよくありました。ここでは、ChandlerループとReal-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis...

In-vitro血栓溶解モデルにおけるせん断流下におけるChandler Loop形成全血栓の線維素溶解の追跡

ここでは、内皮細胞に同期振動性高血糖およびパルサタイルせん断応力を曝露するマイクロ流体システムを製作・運用するプロトコルを提示します。このアプローチは、糖尿病の内皮機能障害を研究するための生理学的に関連性の高い in...

生理的パルサタイルせん断応力と振動性高血糖を組み合わせた内皮機能障害をモデル化するためのマイクロ流体システム

学ぶ 微小流体系を用いたインビトロ血管モデルで全血と内皮細胞の相互作用をリアルタイムに可視化し、血栓形成と抗凝固薬の効果を評価する方法。個別化医療への応用も可能です。

全血-内皮相互作用と血栓動態をリアルタイムで研究するインビトロ微小流体疾患モデル

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