Name: 成人マウスおよびラット心筋細胞の分離、トランスフェクション、長期培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 学ぶ成人マウスおよびラット心筋細胞の分離、siRNAトランスフェクション、長期培養の最適化プロトコル。ラミニンコーティング培地とRNAiMAXを用いて20日以上の生存率80〜90%を達成し、心筋細胞増殖と遺伝子発現研究を可能にする。

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この研究は、シンシナティ大学医学部の病理学・検査医学科からオヌール・カニシカ博士への資金提供によって支えられた。国立衛生研究所(R01HL148598)からオヌール・カニシカク博士への助成金。オヌール・カニシカク博士は、米国心臓協会キャリア開発賞(18CDA34110117)の支援を受けています。パーウェス・アラム博士は、米国心臓協会の博士研究員(AHA_20POST35200267)によって支えられている。マリナ・J・アイビー博士は、NIH T32助成金(HL 125204-06A1)によってサポートされています。

すべての実験は、米国国立衛生研究所(NIH)が発行する実験動物のケアと使用ガイドのガイドラインに従って行われるべきです。ビデオに表示されるすべてのプロトコルは、シンシナティ大学医学部の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。
1. 成体マウス(およびラット)からの心臓抽出前の調製
<ol><li>対応する灌流、酵素、および停止液を、 表1 および 表2に示したレシピに従って、それぞれラットおよびマウスの単離のために調製する。0.22 μmフィルターでソリューションをフィルターし、汚染や未溶解の粒子を除去します。</li>
	<li>手術器具を70%アルコールに15分間浸して洗浄し、滅菌し、その後二重蒸留水で洗浄します。清潔なペーパータオルで空気乾燥するツールを残します。</li>
	<li>水浴を37ºCに予熱し、水浴中の水位を確認し、手順中に灌流装置を通して温水の中断のない循環を確認します。</li>
	<li>70%のアルコールを5分間実行して、灌流装置を洗浄します。 注: 流量を増やすと、チューブのクリーニングに役立ちます。</li>
	<li>アルコールの流れが通った後、二重蒸留水を10分間流してアルコールの残骸をきれいにします。</li>
	<li>切除後に心臓をきれいにするために、3つの中型使い捨てポリスチレン計量皿を設置します。20 mL のミオサイトバッファーで料理を満たします。</li>
	<li>パスツールピペットの助けを借りて、各料理にヘパリンの2〜3滴を追加し、複数回ピペットすることによってよく混ぜます。</li>
	<li>鈍い針カニューレで10 mLの注射器を取ります。 注:鈍い針カニューレは、清潔で無菌の針の先端を切断することによって調製することができます。マウスとラット用のカニューレをそれぞれ作るために21G針と14G針を用いた。</li>
	<li>シリンジを灌流バッファーで満たす(表1)。シリンジから気泡を取り除き、斜めの位置で3番目の皿に入れます。テープで固定します。 注:ラットの場合、溶液A(表2)は、筋細胞灌流バッファーの代わりに使用された。</li>
	<li>外科的縫合糸でゆるい結び目を準備し、針の周りに置きます。</li>
	<li>腹腔内注射でヘパリン(100 USP単位/マウス)をマウスに注入し、麻酔注射の20分前に注射します。</li>
	<li>ミオサイト灌流緩衝液(表1)を灌流装置を通して循環させる。流量を3 mL/minに下げます。 注:ラットの場合、溶液A(表2)は、筋細胞灌流バッファーの代わりに使用された。</li>
	<li>5分後、酵素溶液で灌流バッファーを交換する(表1)。プロセス中に酵素溶液を酸素で飽和させます。流量は3 mL/minで行います。 注: ラット CM 分離の場合は、代わりにソリューション E (表 2) を使用してください。</li>
	<li>麻酔の腹腔内注射によりマウスを麻酔する。IACUCが推奨する麻酔の適切な用量を末端手術に使用する。</li>
	<li>つま先ピンチに対する応答の欠如によって麻酔の十分な深さを確認します。次に、外科用プラットフォームにマウスを置きます。</li>
</ol>2. 成体マウス(およびラット)からの心臓の抽出
<ol><li>70%アルコールで拭いて皮膚を殺菌する。</li>
	<li>慎重に胸を開きます。</li>
	<li>心を物品切りする。切除中の非心臓組織は避けてください。</li>
	<li>灌流バッファーで満たされた最初の皿に心臓を置く(表1)。 注: ラットのソリューション A を使用します (表 2)。</li>
	<li>穏やかに絞ることによって心臓から血液をクリアします。</li>
	<li>ハートを2番目の料理に移します。</li>
	<li>心臓から血液をきれいにし、非心臓組織を除去します。その後、心臓を3番目の皿に移します。</li>
	<li>肺および他の周囲の組織を切り取り、上昇大陸を介してカニュール。CMの品質と量を改善するために、この手順はできるだけ迅速に(<5分)実行する必要があります。</li>
</ol>3. 心の消化
<ol><li>マウス心臓の消化 注:マウスの心臓を通して循環するすべてのソリューション/バッファは、手順全体で酸素化する必要があります。<ol>
<li>慎重に注射器からカニューラシング針を取り出し、ランゲンドルフ灌流装置に接続します。</li>
		<li>心臓に入る気泡を避け、酵素溶液の流れや消化に影響を与える可能性があります。</li>
		<li>ウォータージャケットを上に移動して、均質な環境を心臓に提供します。酵素溶液が2-3 mL/minの速度で心臓を流れるようにします。 注: 通過ソリューションの速度は非常に重要であり、CMの量と品質の結果に大きな影響を与えます。</li>
		<li>酵素溶液が心臓を2分間流します。</li>
		<li>2分で、酵素溶液に40μLの100μMCaCl2 溶液を加えて混合します。酵素溶液が心臓を通過してさらに10〜15分間通過させます。 注:流れが滑らかになると、心臓は茶色く柔らかくなり、コラゲナーゼ酵素の均等な分布と心臓の適切な消化を示します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ラット心臓の消化 注:ラット心臓を通って循環するすべてのソリューション/バッファは、手順全体で酸素化する必要があります。<ol>
<li>慎重に注射器からカニューラシング針を取り出し、ランゲンドルフ灌流装置に接続します。</li>
		<li>心臓に入る気泡を避け、酵素溶液の流れや消化に影響を与える可能性があります。</li>
		<li>ウォータージャケットを上に移動して、均質な環境を心臓に提供します。</li>
		<li>3-5分間の速度で2-3 mL/minの速度で溶液Aの流れを開始し、心臓から血液を除去します。 注: 通過ソリューションの速度は非常に重要であり、CM品質の結果に大きな影響を与えます。</li>
		<li>血液が心臓から取り除かれたら、溶液Aから溶液Eに切り替える(表2)。溶液中の0.1 mMの最終濃度のために以下に示すようにCaCl2 とのTitrate溶液E:<ol>
<li>10分の灌流の後、0.1 M CaCl2の12.5 μLを加える。</li>
			<li>15分の灌流の後、0.1 M CaCl2の25 μLを加える。</li>
		</ol>
</li>
		<li>酵素溶液は、流れが急速になり、心臓が柔軟になるまで、さらに30〜40分間心臓を通過させます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. CM単細胞懸濁液の調製
<ol><li>CM単細胞懸濁液(マウス)の調製<ol>
<li>ランゲンドルフ灌流システムから心臓を取り除きます。5 mLの酵素溶液を充填した60mmペトリ皿に移動し、バイオセーフティフードに皿を移します。 注:ランゲンドルフ灌流システムから心臓を除去する前に、十分な心臓消化を確保してください。消化時間は、酵素活性、溶液の流れ、および心臓の大きさに依存します。</li>
		<li>バイオセーフティフードでさらなる機械的分解を行い、無菌性を確保し、汚染を回避します。</li>
		<li>心房(基底心部の1/4番目 )と余分な脂肪組織を慎重に取り除きます。</li>
		<li>胸を鉗子で細かい部分にミンチ。</li>
		<li>滅菌パスツールピペットを取り、45º角度でその先端をカットします。</li>
		<li>このパスツールピペットを使用して、穏やかなピペットによって単細胞懸濁液中の心臓組織を分配します。最適な消化は、単細胞心筋細胞の懸濁液を提供する。 メモ:トランスファーパイプの狭い底部を取り外して、機械的なシーリングによるCMの損傷を減らします。</li>
		<li>次いで、5 mLの停止溶液を加えて酵素活性を停止し、消化過剰の可能性を回避します。</li>
		<li>新鮮な50 mL円錐形を取り、その上に無菌100 μmの細胞ストレーナーを置きます。</li>
		<li>細胞ストレーナーを通して心筋細胞懸濁液を通過し、組織チャンクを除去する。ペトリ皿とストレーナーを別の5 mLの停止溶液で洗浄し(表1)、ストレーナーに取り付けられたままの心筋細胞を採取します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>CM単細胞懸濁液(ラット)の調製<ol>
<li>ランゲンドルフ灌流システムから心臓を取り除きます。5 mLの溶液Aを充填した100mmペトリ皿に心臓を移動し、バイオセーフティフードに皿を移動します。 注:ランゲンドルフ灌流システムから心臓を除去する前に、十分な心臓消化を確保してください。消化時間は、酵素活性、溶液の流れ、および心臓の大きさに依存します。</li>
		<li>バイオセーフティフードでさらなる機械的分解を行い、無菌性を確保し、汚染を回避します。</li>
		<li>心房(基底心部の1/4分の1)と余分な脂肪組織を慎重に取り除きます。</li>
		<li>胸を鉗子で細かい部分にミンチ。</li>
		<li>滅菌パスツールピペットを取り、45º角度でその先端をカットします。</li>
		<li>このパスツールピペットを使用して、穏やかなピペットによって単細胞懸濁液中の心臓組織を分配します。最適な消化は、単細胞心筋細胞の懸濁液を提供する。 メモ:トランスファーパイプの狭い底部を取り外して、機械的なシーリングによるCMの損傷を減らします。</li>
		<li>5 mLの溶液B(表2)をCM懸濁液に加え、100 μmの細胞ストレーナーを通して溶液を渡して、残りの脂肪または他の非消化組織を除去します。</li>
		<li>新鮮な50 mL円錐バイアルで濾液を収集します。</li>
		<li>別の5 mLの溶液Bを使用して、ペトリ皿および残りのCMを細胞ストレーナーで洗浄します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 非CMの削除
<ol><li>成体単細胞懸濁液(マウス)からの非CMの除去<ol>
<li>細胞懸濁液を20xgで3g分間遠心分離する。</li>
		<li>上清を捨て、細胞を停止液の10mLに再び懸濁させる(表1)。 注:停止溶液中のBSA濃度を上げると、その粘度が増加し、非CMの沈め水速度が低下します。</li>
		<li>管の穏やかな反転によってCMを3-5回再中断しなさい。</li>
		<li>3分間隔で、100 μM CaCl2 溶液の10 μLを加えて混合します。3回繰り返します。</li>
		<li>4回目の添加後、心筋細胞懸濁液を20xgで3分間g遠心分離する。</li>
		<li>上清を捨てます。</li>
		<li>事前に温めたCM(37 ºC)、成体マウスCMめっき媒体のCMを再中断する(表3)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>成体単細胞懸濁液(ラット)からの非CMの除去<ol>
<li>20 x g で 25 ºC で 3 分間ペレット細胞。</li>
		<li>上清を捨て、細胞を溶液Bの25mLに再び懸濁させる(表2)。</li>
		<li>穏やかな反転によって細胞を混合し、CMが重力下で落ち着くようにチューブスタンドに置きます。</li>
		<li>上清を慎重に捨てなさい。</li>
		<li>溶液Bの新鮮な25 mLで細胞を再懸濁し、3-5分間隔で50 μL、75 μL、および100 μLの0.1 MCaCl2を段階的に添加して1.0 mM CaCl2に滴下します。 注: このステップでは、溶液 B の BSA 濃度が高くなります。溶液B中のBSA濃度を上昇させることで粘度が増加し、非CMの沈沈速度が低下します。</li>
		<li>ペレット細胞は25°Cgで3分間20xgで、上清を吸引し、成人ラット細胞培養培地の所望の体積を加える(表4)。</li>
		<li>ラミニンコーティングされたプレートにCMをシード。 注:非被覆培養プレート上のCMのプレメッキは、非CM細胞の汚染を最小限に抑えるために使用することができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 成人CMめっき
<ol><li>プレメッキ<ol>
<li>心筋細胞を培地に再中断する。</li>
		<li>マウスまたはラットCM用の60mmまたは100mm皿に細胞をプリプレートします。</li>
		<li>37 ºCで5%CO2を補充インキュベーターで2時間の2CMをインキュベートする。</li>
		<li>プレプレートインキュベーションの際に、細胞培養プレートにラミニン(PBSで10 μg/mL)を塗布し、CM培養を長期間行います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プレメッキの2時間後、50 mL円錐バイアルにCMを集める。</li>
	<li>皿から細胞を収集し、トランスフェクション実験のためのラミニンコーティング24ウェル培養プレートに再プレートします。</li>
	<li>培養細胞は37ºCで培養細胞を5%CO2で補った。4〜6時間は、表面と心筋細胞に付着するのに十分であり、したがって、トランスフェクションは、メッキ後6時間行うことができる。 注:FBSを含むめっき媒体は一般的に使用され、拡散試験とのより良い適合性を示しています。しかし、無血清培地は、分泌因子が分析されている実験に使用することができます。</li>
</ol>7. トランスフェクション
<ol><li>ラミニンでコーティングした細胞培養プレートにCMを4〜6時間インキュベートします。</li>
	<li>CMがラミニンコーティングされたプレートに播種してから4時間後、製造業者のプロトコルに従ってトランスフェクション試薬(例えば、リポフェクタミンRNAiMAX)を用いて関心のあるsiRNA(50nM)を有する細胞をトランスフェクトする。</li>
	<li>トランスフェクションの24時間後、その後24時間ごとに最大20日間交換します。</li>
	<li>20日後、リンポニンなどの心臓特異的マーカーに対する免疫細胞化学を含む、下流の用途に対してPBSで4%PFAの細胞を固定し、生きた心筋細胞を長期培養することに成功した。</li>
</ol>

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</ol>

細胞特異的な機械学的研究を行うために、成人心筋細胞単離および長期培養のためのプロトコルを確立することが重要である。成人の CM 分離プロトコルについて説明する報告はごくわずかで、さらに少ない数が成体マウス CM15、16、1716,17の長期培養に使用されます。15成体ラットCMは、成体マウスCM10、11、12,11,12よりもインビトロ培養に対する耐性が高いことが示されている。本報告では、定期的に使用されるプロトコルの変更を最小限に抑え、CM単離、siRNAトランスフェクション、長期培養、および誘発増殖の下流分析のためのプロトコルを確立する。
成人のCM単離のための利用可能なプロトコルは、細胞外マトリックス(...

心臓病は、世界中の主要な死因の一つです。ほとんどすべてのタイプの心障害は、成人心筋細胞(CM)の有意な喪失をもたらす。成人哺乳類の心臓は、成人のCM1の老化性のために心臓損傷を修復することができない。したがって、成人哺乳類の心臓に対する侮辱は、CMの永久的な喪失をもたらし、心機能および心不全の減少をもたらす。成人哺乳類とは異なり、ゼブラフィッシュやイニュートハートのような小動物は、既存のCM増殖22、3、43,4を通じて心臓損傷を再生することができる。世界的な取り組みは、増殖と不拡散の両方のアプローチを介して心臓傷害に対する新たな治療介入を見つけ出すために進行中である。過去数十年の間に、様々なタイプの遺伝的マウスモデルが心臓損傷および修復を研究するために開発された。しかし、in vivo動物モデルを使用することは、二次的な効果から細胞自律機構を解読するための追加の複雑さを伴う高価なアプローチであり続けています。また、生体内システムは、CMから心保護シグナル伝達を誘導する薬理学的介入のCM特異的効果を分析することは困難である。
さらに、CM増殖解析を行うためには、成人CMの長期培養が必要である。CM増殖アッセイは、細胞が細胞周期に誘導され、その後正確なデータを得るために最低4〜5日を必要とする。さらに、電気生理学的研究、薬物スクリーニング、毒性試験、およびCa++ホメオスタシス研究のために単離されたCMを利用する研究は、すべて改善された培養系5、6、76を必要と7している。5さらに、最近の研究では、CM(カーディオカイン)8,9,9から分泌されるサイトカインの心保護的意義を示す。心臓の修復と再生の間にこれらのカーディオキンの治療的役割と分子機構を調べるには、長期培養が必要である。
成人ラットのCMは、インビトロシステム10、11、12,11,12における単細胞単細胞分離および長期培養に十分に堅牢である。しかし、成虫マウスCMは、ラットCM13では不可能な様々な革新的な分析の設計と実行を可能にする様々な遺伝子組み換えマウスモデルの入手可能性のために、インビトロアッセイに大きな関心を持っています。成体ラットCMの分離とは対照的に、成体マウスの心臓から単細胞懸濁液を得ることは非常に困難であり、培養中の成体マウスCMの長期的な培養はさらに困難である。
ランゲンドルフシステムを使用したマウスとラットの心臓からの成人のCM分離は、以前にCM機能55、14、1514,15を研究するために確立されています。ここでは、ラットおよびマウスの両方からの成人CM単離のためのプロトコル、ならびに単離細胞の修飾された長期培養、トランスフェクション、およびCM増殖について詳細に説明した。

<table><tbody><tr><td>2,3-ブタンジオンモノキシム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0753</td><td></td></tr><tr><td>ブレビスタチン</td><td>APExBIO</td><td>B1387</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養プレート</td><td>Corning Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>細胞ストレーナー</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Cel-miR-67</td><td>Dharmacon</td><td>CN-001000-01-50</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ type2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て目盛り付きトランスファーピペット</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>ディスポーザブルポリスチレン計量皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z154881-500EA</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグル's medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>EdU</td><td>Life Technologies</td><td>C10337</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Corning</td><td>35-015-CV</td><td></td></tr><tr><td>ファインポイント 高精度鉗子</td><td>Fisherbrand</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-5400</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Hausser Scientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>剤医薬品</td><td>PSLAB-018285-02</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>高精度ストレート ブロード ストロング ポイント ピンセット/鉗子</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-000-128</td><td></td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8281</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>Light Microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Life Technologies</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Natural Mouse Laminin</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Henry Schein</td><td>24352</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼXIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147-1G</td><td></td></tr><tr><td>Selenium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229865+5G</td><td></td></tr><tr><td>siMeis2</td><td>Dharmacon</td><td>s161030</td><td></td></tr><tr><td>siRb1</td><td>Dharmacon</td><td>s128325</td><td></td></tr><tr><td>ストレート ブラント/シャープ解剖はさみ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>28252</td><td></td></tr><tr><td>ストレート超微細精密先端鉗子</td><td>フィッシャーブランド</td><td>16-100-120</td><td></td></tr><tr><td>タウリン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>トランスフェリン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T8158-100MG</td><td></td></tr><tr><td>超滑らかで斜めのエッジ仕上げのはさみ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>22-079-747</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>3006S</td><td></td></tr></tbody></table>

成人マウスおよびラット心筋細胞の分離、トランスフェクション、長期培養

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

成人哺乳類心筋細胞(CM)のエクスビボ培養は、心臓生物学のインビトロ研究に最も関連する実験システムを提示する。成人哺乳類のCMは、増殖能力が最小の末端分化細胞である。成人CMのポストミトティック状態は、心筋細胞周期の進行を制限するだけでなく、CMの効率的な培養を制限します。また、CMの増殖や遺伝子発現の解析など、多くの研究には成人CMの長期培養が必要です。
マウスとラットは、心筋細胞の分離に使用される2つの最も好ましい実験動物である。ラットCMの長期培養は可能ですが、成虫マウスCMは死亡しやすく、通常の条件下では5日以上培養できません。したがって、成人マウスのCMの細胞分離および長期培養プロトコルを最適化する必要があります。この変更されたプロトコルを使用すると、成体マウスとラットの両方のCMを20日以上正常に分離および培養することが可能です。さらに、単離されたCMのsiRNAトランスフェクション効率は、以前の報告に比べて有意に増加する。成人マウスCMの分離のために、ランゲンドルフ灌流法は、最適な酵素溶液と完全な細胞外マトリックス解離のための十分な時間で利用される。純粋な心室CMを得るために、両方の心房を解剖し、解離およびめっきを進める前に廃棄した。細胞をラミニンコーティングされたプレート上に分散させ、効率的かつ迅速な付着を可能にした。CMは、siRNAトランスフェクションの前に4〜6時間沈着させた。培養培地を24時間ごとに20日間リフレッシュし、その後、トロポニンなどの心臓特異的マーカーやKI67などの細胞周期のマーカーについてCMを固定し染色した。

現在の変更されたプロトコルは、ラットとマウスのCMを効率的に分離し培養することができます。ラットCM単離の場合、処置で合計3匹の成人(12週齢)の雄フィッシャー344匹を使用した。 図 1 は、手順に必要な手術装置と分離セットアップを示しています。各部分は、図の凡例にマークされ、説明されています。コラゲナーゼタイプ2は、正常な分離から高品質のCMの高い量をもたらす消化に使用されました(図2A)。24時間の分離後、これらの細胞は 、Rb1 および Meis2に対して特異的なsiRNAを誘導する細胞周期をトランスフェクトしたが、一方、cel-miR-67は実験11においてトランスフェクション制御として使用された。CMは、形態学的変化を観察するために、7日間(図2B)または最大20日間(図2C)の培養で維持された。細胞周期活...

ここでは、成体マウスおよびラット心筋細胞の分離、トランスフェクション、および長期培養のためのプロトコルを提示する。

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

このビデオの目的は、成人型心筋細胞の分離、長期培養およびトランスフェクションのための標準化されたプロトコルを実証することです。マウスまたはラットから心筋細胞を単離し、培養することは、健康で疾患の心臓内の心筋細胞の細胞自律生物学を調べるのに不可欠な方法であり続ける。孤立した心筋細胞を使用して答えることができるいくつかの質問があります。増殖ポテンシャルなど。傷害反応時に遺伝子発現変化または特異的サイトカイン発現がある。残念なことに、マウス心筋細胞は、通常の培養条件では過去1週間は生存しない。したがって、このビデオでは、成体マウス心筋細胞を分離する最適化された方法を説明し、それらをトランスフォームして21日を超えて培養し、この技術は当初習得が困難である。しかし、練習では、分離後の心筋細胞で約80〜90%の生存を達成し、約100%のトランスフェクション効率を達成することができます。そして、正しい条件でこれらの心筋細胞のほとんどは、過去20日間生き残ることができます。手術器具を70%アルコールに15分間浸し、その後二重蒸留水で洗浄して、手術器具を洗浄して殺菌します。水の後、次に乾燥する空気中のツールを残し、それぞれ5分間2回アルコール70%を実行して拡散装置を清掃する。流量を増やすと、アルコールが残りのアルコールを10分間二重蒸留水で洗い流した後、チューブをきれいにするのに役立ちます。切除後に心臓をきれいにするために3つの料理を設定します。ミオサイトバッファーの 20 ミリリットルで各料理を充填します。.パスツールピペットで各料理に2〜3滴のヘパリンを加え、何度も上下にピペットを入れ、よく混ぜます。10ミリリットルの注射器を取り、筋細胞バッファーでそれを埋めます.シリンジから気泡を取り出し、3番目の皿に斜めの位置に置き、テープで固定します。外科的縫合糸でゆるい結び目を準備し、針の周りに置きます。麻酔の20分前にIP注入を通してヘパリンでマウスを注入する。1分間に3ミリリットルの流量で、拡散装置を通して筋細胞拡散バッファーを循環させる。5分後、拡散バッファーを酵素溶液に置き換え、プロセス中に酵素溶液を酸素で飽和させ、再度、酵素溶液を毎分3mLの流量に設定する。つまみつまみで麻酔を確認し、外科用プラットフォームにマウスを置きます。70%アルコールで皮膚を殺菌する。胸を慎重に開き、心臓を運動し、最初の皿に心臓を入れます。穏やかな絞りによって心臓から血液をクリアし、心臓から血液をさらに浄化し、非心臓組織を除去するために心臓を2番目の皿に移します。その後、心臓を3番目の皿に移します。大通りを見つけて、あなたの鉗子を使ってペイトンをもっとカニューラッティング針の周りに置きます。あなたの前のタイトな結び目の締め付けを引き下げ、2番目の結び目を作ることによってそれを固定します。さらな

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

本稿では、成体ラットの心筋細胞を分離、培養に一般的な方法を説明した。コラゲナーゼとプロテアーゼは、単一の心筋細胞を消化して単離するために使用されています。心筋細胞は、ほとんどの実験の要件を満たすこのプロトコルに従って培養した。...

成体ラットの心筋細胞の初代培養

成人心筋細胞は動物の心臓から分離し、数日間培養することができる主要な細胞である。この培養期間内にアデノウイルス遺伝子導入は、遺伝的に符号化されたバイオセンサー（GEBs）または蛍光融合タンパク質を発現させることができる。両方のアプローチは、共焦点顕微鏡による細胞の調査を許可する。...

共焦点イメージングのための成人心筋細胞の単離と遺伝子操作

初代マウス心筋細胞培養は、筋原線維組織や機能の調査のための極めて重要なツールの一つである。以下のプロトコルは、新生児マウスの心臓から初代心筋細胞の単離および培養について説明します。得られた心筋細胞培養物は、続いて、生体力学的、生化学的および細胞生物学の種々のアッセイに使用することができる。...

新生仔マウス心筋細胞の単離および培養

ここでは、ランゲンドルフ灌流システムを使用して、成体マウスcardiomyoctyesの単離を記載している。得られた細胞は、電気的に休止状態、のCa 2 +·トレラントであり、培養およびアデノ又は遺伝子発現を操作するためのレンチウイルスでトランスフェクトすることができる。それらの機能は、MMSYSシステムおよびパッチクランプ技術を用いて分析することができる。...

アイソレーション、文化、および成体マウスCardiomyoctyesの機能解析

我々は、成体マウス心筋細胞の単離のための信頼できる方法を記載している。このプロトコルは、遺伝子改変マウスの様々から機能大人の心筋細胞の培養のための一貫性のある結果が得られます。...

細胞シグナリングのための成体マウスの心筋細胞の単離と文化<em&gt; in vitroで</em&gt;心肥大

このプロトコルは、成体マウス心筋細胞の再現性のある単離と長期培養のための段階的な方法を説明しています。これは、高収率、純度、および生存率を備えています。...

成体マウスの心筋細胞の単離、培養および形質導入

ラット心臓から様々な心臓細胞型を単離するためのいくつかのプロトコールが開発され、記載されている。ここでは、単一の調製物から高品質の主要な心臓細胞型（心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞）の単離を可能にし、実験コストを削減する最適化プロトコルが記載されている。...

成体ラット心臓からの高品質心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞の同時単離

ここでは、分離と培養ラット心室心筋細胞 (ARVC) のためのプロトコルを提案する.分離 ARVC は、短期および長期の栽培に使用できます。分離と ARVC...

ラット心筋細胞の分離と培養

単成マウス心臓の心房と心室の両方から筋細胞と非筋細胞を同時に分離する方法について説明する。このプロトコルは、高生存性心筋細胞および非筋細胞の一貫した収量をもたらし、フェノタイピングおよびインビトロ分析のための最適な細胞特異的培養条件を詳述する。...

心房筋細胞、心室筋細胞、および非筋細胞の同時分離と培養

細胞および分子機能実験の心臓病学のゴールドスタンダードは心筋細胞です。この記事では、マウス心筋細胞を単離するための非ランゲンドルフ法への適応について説明します。...

マウス心筋細胞を一貫して単離するための簡単で効果的な方法

学ぶ成人マウスおよびラット心筋細胞の分離、siRNAトランスフェクション、長期培養の最適化プロトコル。ラミニンコーティング培地とRNAiMAXを用いて20日以上の生存率80〜90%を達成し、心筋細胞増殖と遺伝子発現研究を可能にする。

成人マウスおよびラット心筋細胞の分離、トランスフェクション、長期培養

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