Name: 骨造形メカノダクタ化を刺激し、骨改造の機能的成果を解析するためのラボオンチッププラットフォーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 学ぶラボオンチッププラットフォームを用いた骨細胞培養と力学的負荷による骨形成・吸収の定量解析。骨改造メカニズムの解明や骨粗鬆症・骨折治癒研究への応用が可能です。

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この研究は、グラント・ノーズ(CBET 1060990およびEBMS 1700299)の下で国立科学財団によって支援されました。また、国立科学財団大学院研究フェローシッププログラム(2018250692)の支援を受けた研究成果を基にしています。この資料で表明された意見、調査結果、結論、または勧告は著者のものであり、必ずしも国立科学財団の見解を反映しているわけではありません。

1. チップマスクの準備
注: ステップ 1.1 ~ 1.3 は、チップ マスクを最初に受け取った時点で 1 回だけ実行する必要があります。彼らはマスクが使用中に弓をしないようにします。マイクロ流体マスクの設計は、前に11,14,14を説明した。マスクは、高解像度のステレオリソグラフィを使用して社内で設計され、商業的に製造された(図1A)。
<ol><li>マスクの上面をプラスチックシートで覆い、この表面を接着剤から保護します。スプレー接着剤を使用して、同じサイズのアクリルシートにチップマスクを固定します。接着剤が完全に治癒できるように、一晩一緒にピースをクランプします。接着剤が乾いた後、マスクの上部からプラスチックシートを取り除きます。</li>
	<li>両面テープを使用して、アクリルシートの底部を3Dプリントされたレベリングボックス(補足図1、補助ファイル1-4)に取り付けます。しっかりと押して、しっかりと結合を確保します。</li>
	<li>防水シーラントでレベリングボックスの取り外し可能な壁の近くに小さな開口部をシールします。シーラントを24時間硬化させる。</li>
	<li>70%エタノール(EtOH)でマスクの表面を洗浄してください。オーブンに目的のチップマスクとレベリングボックスを置きます。デジタル分度器を使用して、マスクの上部がレベルであることを確認します。必要に応じて、レベリングねじを調整します。</li>
</ol>2. PDMSの製造
注:浅いウェル(1 mm)チップ設計は機能活性(形成および再吸収)アッセイに使用され、深層(10mm)チップ設計は機械的ローディング研究に使用されます。深層ウェルの底部は、別の薄いPDMS膜を付着させることによって形成される(図1B)。
<ol><li>リッド層(レイヤ 1)<ol>
<li>プラスチックカップにPDMSプレポリマー63gと6.3gの硬化剤(10:1比)を組み合わせます。使い捨てのセルスパチュラと脱気を真空デシケーターで30分間十分に混ぜます。</li>
		<li>準備されたレベリングボックスにゆっくりと混合物を注ぎます。PDMSを30分間座らせてから、45°Cで18時間焼きます。</li>
		<li>先細りの実験室のへらでPDMSの端を緩め、レベリングボックスからポリマーシートを取り除きます。</li>
		<li>メスと3Dプリントテンプレートを使用して、個々の蓋をサイズ(70 mm x 34 mm)にカットします。</li>
		<li>バイオプシーパンチ(1mm直径)で各蓋を通して穴を開けます。</li>
		<li>表面は包装テープでふたをきれいにする。 注:蓋がすぐに使用されていない場合は、それぞれを包装テープで包み、室温(RT)で保管してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ウェルおよびマイクロチャネル層(レイヤー2)<ol>
<li>PDMSプリポリマーと硬化剤(10:1比)をプラスチックカップに組み合わせます。浅い井戸設計は、プレポリマーの43 gと硬化剤の4.3 gを必要とし、深い井戸設計には227gのプレポリマーと22.7 gの硬化剤が必要です。ポリマーを激しく混ぜ、30分間脱気します。 注: これは、152.4 mm x 152.4 mm のマスク寸法を想定しています。</li>
		<li>適切な事前レベルのマスクの上にゆっくりと混合物を注ぎます。PDMSを30分間座らせてから、45°Cで18時間焼きます。</li>
		<li>先細りの実験室のへらでPDMSの端を緩め、慎重にマスクから離れてポリマーを剥がします。個々のチップを切り取るためにメスと3Dプリントテンプレートを使用してください。 注:積み込み試験では、チップ寸法(70 x 34 mm)が正確であり、ウェルがチップの中央に位置することが重要です。</li>
		<li>表面は包装テープでPDMSをきれいにする。 注:チップがすぐに使用されていない場合は、各チップをテープに包み、RTに保管します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>薄いPDMS膜(層3) 注: このレイヤーは、深い井戸設計にのみ使用されます。<ol>
<li>プラスチックカップに12.7gのPDMSプレポリマーと1.3gの硬化剤(10:1比)を加えます。激しく混ぜ、30分間脱気します。</li>
		<li>準備されたレベリングボックスにポリマーをゆっくりと注ぎ、プラスチックカップを十分に削ってできるだけ多くのPDMSを取り除きます。</li>
		<li>セルスパチュラを使用して、PDMSを全面に広げます。 注:ポリマーが手動で広がっていない場合、表面張力はポリマーが均一なシートを形成するのを防ぐのに十分です。</li>
		<li>PDMSを30分間座らせてから、45°Cで18時間焼きます。</li>
		<li>先細りのヘラで PDMS の端を緩め、PDMS シートをレベリング ボックスから慎重に取り外します。レイヤー 2 の寸法に一致する個々の膜をカットします。</li>
		<li>キャリパーを使用して、膜の中心にある膜の厚さを測定します。所望の厚さ(0.5 mm ±0.1 mm)の外側にある膜を捨てます。</li>
		<li>包装テープで慎重にきれいな膜を、パラフィンフィルムの一部に置きます。 注:膜がすぐに使用されていない場合は、包装テープで膜の上部を覆い、RTに保管してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 機能活動の基質
注:ポリスチレンディスクと骨ウエハーは、それぞれ骨芽細胞および破骨細胞培養に使用される井戸の底部に取り付ける必要があります。
<ol><li>ポリスチレンディスク(図1C)<ol>
<li>マスキングテープを、ポリスチレンカバースリップを処理した組織培養の裏側に置きます。シャープにしたコルクボーラー(直径5.4mm)を使用して、カバースリップから円形のディスクをカットします。70%のEtOHでディスクを水没させ、一晩放置します。</li>
		<li>70%のEtOHに浸した綿の先端アプリケーターでディスクの上面を静かにこすります。ディスクの外縁が完全にクリーニングされていることを確認します。</li>
		<li>2組の鉗子を使用して、ディスクを保持し、マスキングテープのバッキングを取り外します。ディスクを下に置き、綿の先端のアプリケーターで裏側をきれいにします。</li>
		<li>綿の先端アプリケーターの木製の端を未硬化PDMSの脱ガス混合物に浸し、所望の井戸の底に少量のポリマーを置きます。 注:残りの未硬化PDMSは-20°Cで保存することができます。</li>
		<li>取り扱ったポリスチレンディスクを井戸に上げ、綿棒でディスクを軽く押し下げます。未硬化のPDMSがディスクの処理された側に接触しないようにします。 メモ:PDMSがディスクの処理された表面に接触する場合は、井戸からディスクを取り出し、手順3.1.4と3.1.5を新しいディスクで繰り返します。</li>
		<li>チップを30分間レベルの表面に置き、65°Cで4時間焼きます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ボーンウエハース<ol>
<li>100 mm 皿の底部に骨ウエハ(直径6mm、厚さ0.4mm)を配置するために鉗子を使用しなさい。鉗子でウエハーをしっかり持ち、メスでウエハーの背面に「X」をそっとエッチングします。 注: イメージングプロセスでは、'X' を使用して、ウエハの背面と、細胞をシードしたサーフェスを区別します。</li>
		<li>所望の井戸の底に少量の未硬化PDMSを加えるために綿の先端の塗布器の木製の端を使用してください。側面を下にマークした骨ウェーハを井戸に入れ、綿製のチップアプリケーターを使用してウエハーを押し下げる。</li>
		<li>チップを30分間レベルの表面に置き、65°Cで4時間焼きます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. チップアセンブリと滅菌
<ol><li>中型無線周波数(RF)電源設定(約10.2 Wに相当)を使用して、30 sのプラズマクリーナーでレイヤ1とレイヤ2の表面をアクティブにします。</li>
	<li>レイヤ 1 のアクセス ホールをレイヤ 2 のマイクロチャネルに合わせ、2 つのレイヤをしっかりと押します。</li>
	<li>ディープウェル設計の場合、レイヤー 2 とレイヤー 3 でステップ 4.1 を繰り返します。プラズマ処理の際、両面テープを使用して、層3のパラフィンフィルムを平らな表面に取り付けます。</li>
	<li>PDMS膜から余分な材料を切り取るためにメスを使用してください。慎重にチップの底からパラフィンフィルムのシートを剥がします</li>
	<li>65°Cでチップを10分間焼き、PDMS層間の結合強度を高めます。</li>
	<li>角度付きの分配の先端(18ゲージ、0.5のin、90°)を蓋のアクセス穴に挿入する。2部エポキシで蓋に分配の先端を固定します。各分配チップの周りにエポキシを適用するためにマイクロピペットの先端を使用してください。</li>
	<li>エポキシが完全に硬化した後、表面は70%のEtOHでチップをきれいにし、バイオセーフティキャビネットに置きます。バイオセーフティキャビネット内の後続の手順をすべて実行します。</li>
	<li>5 mL シリンジを無菌シリコーンチューブ(1/32'ID、長さ約10 cm)で分配チップに接続し、チップ全体に少なくとも30の70%EtOHを充填します。浅い井戸の設計のために、4 mL/hの流量に設定されたシリンジポンプとすべての液体を管理する。深い井戸の設計のために、ゆっくりと手で注射器を分配することによってすべての液体を管理する。</li>
	<li>チップからEtOHを取り出し、一晩UV光でチップを殺菌します。</li>
	<li>チップをdH2Oで3回洗浄し、チップをdH2Oで満たし、分配チップからチューブを取り除き、37°Cで少なくとも48時間インキュベートします。</li>
</ol>5. 機械式ローディング装置アセンブリ
注: 3D プリントされた機械式ローディング デバイス (図2A-C)の設計および製造プロセスは、前に説明されており、印刷されたコンポーネントのすべての設計ファイルは、以前は13.
<ol><li>121 °Cで30分間、ローディング装置のすべてのコンポーネントをオートクレーブします。 注:印刷されたコンポーネントの歪みを避けるために、各部分をホイルで個別にラップし、オートクレーブプロセス中に硬い平らな表面に置きます。金属ハードウェアは、一緒にラップすることができます。バイオセーフティキャビネット内の後続の手順をすべて完了します。</li>
	<li>プティンのシャフトの周りに圧縮スプリングを配置し、ベースの底部の中央の穴にプティンを挿入します(図2D)。</li>
	<li>4 本のセルフタッピングねじを使用して、ダイヤル ブロックを底面の底に取り付けます。</li>
	<li>中央のネジの周りに第2の圧縮スプリングを配置します。ダイヤルの底部にある六角形の穴にネジを挿入し、ダイヤルブロックの中央にあるネジ穴にアセンブリをねじ込みます。</li>
	<li>4人の男性と女性のスタンドオフをベースの底にねじ込みます。</li>
	<li>プテンの上部がベースの上部を下回るまでダイヤルを反時計回りに回して、デバイスから緩みを取り除きます。次に、盤板の上部がベースの上部と同じレベルになるまで、ダイヤルを時計回りにゆっくりと回します。</li>
</ol>6. 実験
注: 機能アクティビティ実験用のプロトコルは、以前は11,,12で提供されていました。
<ol><li>ローディング スタディ (図 3)<ol>
<li>ステップ4.9に続いて、5 mLのシリンジを使用して、深いウェルチップからdH2Oを取り除きます。ウェルの底部に0.15 mg/mL I型コラーゲン(CTI)を0.02 Mの酢酸で1時間コーティングします。</li>
		<li>Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水をカルシウムとマグネシウム(DPBS++)で3回洗浄します。</li>
		<li>チップホルダーにチップを入れ、MLO-Y4骨細胞をMLO-Y4骨細胞に入れ、5%の子牛血清、5%のウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補った最小必須アルファ培地(MEMα)で2 x 104細胞/mLの密度でシードします。</li>
		<li>分配チップからチューブを取り出し、チップを深層培養皿(150 mm x 25 mm)に入れます。細胞を37°Cで、5%CO2で272時間培養する。</li>
		<li>滅菌チューブを分配の先端に取り付け、5 mLシリンジを使用して、使用済み培地をチップから取り除きます。新鮮な培養培地でゆっくりと分配し、チップを補充します。</li>
		<li>チップホルダーをローディングデバイスベースの上部にある長方形のインセットに入れます。ローディングデバイスの蓋にあるスロットを通してチューブを供給し、4つのパンヘッドネジと六六本ナットで蓋をベースに固定します。 注: 蓋のレベルを保つには、まず、2 本のネジを互いに対角線で固定してから、残りの 2 本のネジを固定します。</li>
		<li>希望のプラメンの変位に達するまでダイヤルを時計回りに回してセルに荷重を適用します。 メモ:このデバイスは、ダイヤルの1回転が1mmのプッキの変位に相当するように設計されています。PDMS膜の上部に発生したひずみ場は、有限要素解析(FEA)13を用いてプッキーン変位の13関数として以前モデル化した。</li>
		<li>積み込み装置を空のP1000マイクロピペットチップボックスに入れます。15分間、塗布した負荷で細胞をインキュベートします。 注: ここで使用する読み込み時間は、例として機能します。代替の読み込み時間を使用できます。</li>
		<li>インキュベーションに続いて、プ盤が元の開始位置に戻るまでダイヤルを反時計回りに回してセルから負荷を取り除きます。装置から蓋を取り出し、チップホルダーを深層培養プレートに入れます。90分間のポストロード回復期間の細胞をインキュベートします。 注: ここで使用する復旧期間を例として使用します。代替の回復時間を使用できます。長期研究では、72時間ごとに細胞を供給する。</li>
		<li>5 mL のシリンジを使用して、調整された媒体をチップから取り出します。 注:この培地は、保存して-80 °Cで保存することができます。</li>
		<li>チップホルダーからチップを取り出し、テーパー付きヘラを使用してPDMS蓋とウェル層の結合を破ります。 注:細胞アッセイは、細胞培養プレートに対して確立されたプロトコルに従って実行できるようになりました。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

この記事では、骨細胞、破骨細胞、および骨芽細胞を培養するための骨リモデリングLOCプラットフォームを製造するための基礎について説明します。チップ内のウェルの深さと大きさを変更することにより、骨細胞を機械的負荷で刺激し、骨のリモデリングの機能的結果を定量化するために複数の構成が開発された(図1B)。
チップアセンブリの間、プラズマ酸化プロトコルの最適化は、漏れ問題を排除するために重要でした。我々は、PDMS表面を、約10.2Wに相当する中程度のRF電力設定(ステップ4.1)を用いて発生した30秒の酸素プラズマに曝露するだけで、層間に強い結合を生み出すのに十分であることがわかった。露出時間が長くなったり、RF電源設定が高くなったりすると、ボンディングの完全性が低下しました。これは、PDMSの酸素プラズマへの過度の暴露が表面粗さを増加させ、粘着性を低下させた17,18,18を指摘...

骨は、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞の3つの主要な細胞タイプ間の複雑な調整を必要とする非常に動的な組織です。これらの細胞間の多細胞相互作用は、麻痺および長期不動の間に起こる骨の損失、および成長と運動に応答して起こる骨形成の原因である。骨細胞は、最も豊富な骨細胞型であり、骨に適用される機械的刺激に対して高感度である。機械的刺激は骨細胞の代謝活性を変化させ、主要なシグナル伝達分子11,22の増加をもたらす。このプロセスを通じて、メカノトランスダクションとして知られている骨細胞は、骨芽細胞(骨形成細胞)および破骨細胞(骨再生細胞)の活動を直接調整することができる。骨恒常性を維持するには、骨形成と骨吸収率の間に厳しい調節が必要です。しかし、このプロセスの中断は、骨粗鬆症や骨化などの疾患状態をもたらす可能性があります。
これら3種類の細胞間の相互作用の複雑さは、マイクロ流体およびラボ・オン・チップ(LOC)技術を利用した調査に適しています。そのために、私たちの研究室は最近、骨のリフォームプロセスにおける骨吸収と形成(機能的結果)を分析するためのLOCプラットフォームの概念実証を確立しました。このプラットフォームは、細胞間相互作用、変化したローディング環境、および治験薬スクリーニングの研究に使用できます。近年、骨のリモデリングを調節する分子シグナル伝達経路を調べるための様々なマイクロ流体デバイスが開発されています。しかし、これらのシステムの多くは、機能的な活動を示す間接的なマーカーを通してリモデリングを定量化する3,,4,5,6,,7.当社のシステムの利点は、機能的な結果を直接定量化するために使用できることです。骨の改造は長期的なプロセスです。したがって、骨吸収および形成の直接定量化には、少なくとも数週間から8ヶ月、9、10、119,10,の間維持できる培養システムが必要である。11このように、LOCプラットフォームを開発する際に、形成および吸収に必要な長期培養プロトコルを確立し、システム内の細胞を最大7週間11に維持しています。さらに、我々はプラットフォームに両方の細胞タイプの適切な培養基質を組み込んだ。破骨細胞を骨上で直接培養し、プラスチック付着であることが知られている骨芽細胞をポリスチレンディスク上で培養した。さらに、我々は、再モデリング解析11,12,12のための無菌性、長期細胞毒性および欠け分解に関する問題に対処した。
LOCプラットフォームは、マトリックス変形による骨細胞メカノトランスダクションを誘導するためにも使用できます。LOCとペアリングし、セル13を伸ばすために平面外の静電気を適用するために3Dプリントされた機械的ローディングデバイスが開発されました。この機械的負荷に対応するために、LOC内のウェルの深さが増加しました。この小規模でシンプルな機械的ローディングデバイスは、エンジニアリング経験が限られているラボで簡単に製造することができ、以前は3Dプリントコンポーネント13の図面を共有しています。現在の研究では、LOCの使用成功に必要な新しい技術のいくつかを実証します。具体的には、チップ製造、機能基質上の細胞播種、機械的ローディング、および再モデリングのためのチップ分解を実証しています。これらの手法の説明は、視覚的な形式から利益を得ると考えています。

<table><tbody><tr><td>アクリルシート</td><td>Optix</td><td>-</td><td>-厚さ3.175ミリメートル</td></tr><tr><td>角度付きディスペンシングのヒント</td><td>ジェンセングローバル</td><td>JG18-0.5X-90</td><td>使用前にプラスチックコネクタを取り外す</td></tr><tr><td>バイオプシーパンチ</td><td>ロビンスインスツルメンツ</td><td>RBP-10</td><td>直径1mm</td></tr><tr><td>の骨ウェーハ</td><td></td><td>Boneslices.com 厚さ0.4mm</td>の<td>牛皮質骨</td></tr><tr><td>牛の子牛血清</td><td>ハイクロン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SH30072ノギス</td><td>グローバルインダストリアル</td><td>T9F534164</td><td></td></tr><tr><td>セルスパチュラ</td><td>TPP</td><td>99010</td><td></td></tr><tr><td>チップマスク</td><td>ProtoLabs</td><td>カスタムデザイン</td><td>印刷素材:Accura SL 5530</td></tr><tr><td>コルクボーラー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>07-865-10B</td><td></td></tr><tr><td>コットンチップアプリケーター</td><td>ピューリタン</td><td>806-WCL</td><td></td></tr><tr><td>カルチャーディッシュ (100 mm)</td><td>コーニング</td><td>430591</td><td>滅菌済み、非組織培養処理済み</td></tr><tr><td>培養ディッシュ (150 mm)</td><td>コーニング</td><td>430597</td><td>滅菌済み、非組織培養処理済み</td></tr><tr><td>両面テープ</td><td>3M 会社</td><td>スコッチ 237</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ハイクロン</td><td>SH30910</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>レベリングボックス</td><td>カスタムメイド</td><td>--</td><td>3Dプリント</td></tr><tr><td>マスキングテープ</td><td>3M Company</td><td>Scoth 2600</td><td></td></tr><tr><td>MC3T3-E1 preosteoblasts</td><td>ATCC</td><td>CRL-2593</td><td>Subclone 4</td></tr><tr><td>メカニカルローディングデバイス</td><td>カスタムメイド</td><td>--</td><td>3Dプリント</td></tr><tr><td>Minimum essential alpha medium</td><td>Gibco</td><td>12571-063</td><td></td></tr><tr><td>MLO-Y4 osteocytes</td><td>-</td><td>---</td><td>リンダ・ボネワルド博士からの贈り物</td></tr><tr><td>包装テープ</td><td>ダックブランド</td> <td>-</td> <td>標準包装テープ</td></tr><tr><td>パラフィンフィルム</td><td>Bemis Parafilm</td><td>PM999</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>p4333</td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td>エキスパンドプラズマクリーナー</td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサンキット</td><td>ダウコーニング</td><td>シルガード184</td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレンカバースリップ</td><td>Nunc Thermanox</td><td>174942</td><td>滅菌、組織培養処理</td></tr><tr><td>オーブン</td><td>クインシーラボ</td><td>12-180</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 破骨前</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>メス</td><td>BD メディカル</td><td>372611</td><td></td></tr><tr><td>シリコーンチューブ</td><td>サンゴバンタイゴン</td><td>ABW00001</td><td>ID:1/32インチ (0.79 mm)、OD:3/32インチ (2.38 mm)</td></tr><tr><td>SolidWorksのソフトウェア</td><td>Dassault Syst&egrave;mes</td><td>--</td><td>3Dプリントモデルの生成とFEAスプレー接着剤の実行に使用</td></tr><tr><td></td><td>ロックタイト</td><td>2323879</td><td>多目的接着剤</td></tr><tr><td>シリンジ(5ml)</td><td>BDメディカル</td><td>309646</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>ハーバード装置</td><td>70-2213</td><td>ポンプ11 Pico Plus</td></tr><tr><td>テーパード実験用ヘラ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>2部構成expoxy</td><td>Loctite</td><td>1395391</td><td>5 minute quick set</td></tr><tr><td>Type I コラーゲン</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>ラットテールコラーゲン</td></tr><tr><td>真空デシケーター</td><td>Bel-Art</td><td>F42010-0000</td><td></td></tr><tr><td>防水シーラント</td><td>Gorilla 8090001</td><td></td><td>100% シリコンシーラント</td></tr></tbody></table>

骨造形メカノダクタ化を刺激し、骨改造の機能的成果を解析するためのラボオンチッププラットフォーム

A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

骨のリフォームは、骨格の成長と修復だけでなく、機械的環境の変化に適応するために必要とされる厳しく調整されたプロセスです。この過程で、メカノセンシティを受けた骨細胞は、異化破骨細胞と同化破骨芽細胞との間の対立する応答を調節する。このプロセスを調節する非常に複雑なシグナル伝達経路をよりよく理解するために、私たちの研究室は、小規模システム内の骨改造の機能的成果(形成および吸収)を分析するための基礎的なラボオンチップ(LOC)プラットフォームを開発しました。骨のリモデリングは数週間から数ヶ月の順序で起こる長いプロセスであるため、我々はシステム内で長期的な細胞培養プロトコルを開発しました。骨芽細胞および破骨細胞は、LOC内の機能的活性基質上で成長し、最大7週間維持した。その後、チップを分解して骨形成と吸収の定量化を可能にした。さらにLOCプラットフォームと組み合わせた3Dプリント式メカニカルローディングデバイスを設計し、細胞マトリックスを変形させることで骨細胞メカノトランスダクションを誘導することができます。LOCプラットフォーム内で骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞の細胞培養プロトコルを最適化し、無菌性と細胞毒性の問題に対処してきました。ここでは、LOCの製造と滅菌、機能基質上の細胞の播種、機械的負荷の誘導、およびLOCを分解してエンドポイントの結果を定量化するためのプロトコルを紹介します。これらの技術は、骨のリモデリングのための真のオルガンオンチップを開発するための基礎を築いたと考えています。

浅い井戸構成は骨芽細胞および破骨細胞の機能活性を分析するために使用することができる。骨芽細胞を介した骨形成と破骨細胞による吸収は、数週間から数ヶ月のオーダーで培養時間を必要とする。MC3T3-E1前骨芽細胞からの骨形成は、アリザリン赤とフォンコッサ染色11、15,15を用いて定量した。49日目において、アリザリン赤色で染色された平均表面積は10.7%±2.2%(平均平均±標準誤差)11であった。フォン・コッサで染色された平均表面積は6.4%±1.611であった。図4Aは、アリザリンレッドとフォンコッサで染色された49日目の骨芽細胞培養の典型的な形成結果を示す。生骨細胞からの骨吸収は、トルイジンブルー染色11,15...

ここでは、ラボオンチッププラットフォーム内で骨のリモデリングを分析するためのプロトコルを紹介します。3Dプリントされた機械的ローディング装置は、細胞マトリックスを変形させることによって骨細胞のメカノストランスダクションを誘導するプラットフォームと組み合わせることができます。このプラットフォームは、破骨細胞および骨芽細胞(吸収/形成)からの骨リモデリング機能の結果を定量化するためにも使用できます。

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

ここでは、適応可能なラボオンチッププラットフォーム内で骨細胞を培養するためのプロトコルを紹介します。これらの技術は、機械的に誘発された骨のリモデリングを調節するメカニズムの理解をさらに深めるために使用することができます。当社のシステムは、変化した機械的負荷環境に応じて骨形成と吸収を直接定量化する骨細胞の長期培養を可能にします。これらの基礎技術の使用は、骨粗鬆症、骨折治癒、骨形成障害などの骨関連の問題の数に及ぶ発見につながることができます。ウェルとマイクロチャネル層を作成するには、PDMSプリポリマーと硬化剤をプラスチックカップに1対1の比で組み合わせ、激しく混ぜ合わせ、30分間ポリマーを脱気します。適切な事前レベルのマスクの上にゆっくりと混合物を注ぎます。30分間座らせて、摂氏45度で18時間焼きます。先細りの実験室のへらでPDMSの端を緩め、慎重にマスクから離れてそれを剥がし、メスと3Dプリントされたテンプレートで個々のチップを切り取り、包装テープでそれらをきれいに表面。PDMS膜層を作るためには、PDMSを混合、注ぎ、焼成するための前の手順を繰り返します。ベレディングボックスからPDMSシートを取り外し、ウェル層とマイクロチャネル層の寸法に一致する個々の膜を切断します。キャリパーを使用して、中央の膜の厚さを測定し、所望の厚さの外側にある膜を捨て、包装テープで膜を慎重に洗浄し、パラフィンフィルムの一部に置きます。PDMSの蓋層を作るためには、PDMSを混合、注ぎ、焼成するための前の手順を繰り返します。個々の蓋をサイズに切断した後、1ミリメートルの生検パンチでPDMSを通してアクセス穴をパンチし、包装テープでそれらをきれいに表面化します。中程度の無線周波数電源設定で、プラズマクリーナーでレイヤ1と2の表面を30秒間アクティブにし、レイヤ1のアクセスホールをレイヤ2のマイクロチャネルに合わせて、2つのレイヤーをしっかりと押し合います。深い井戸の設計のために、プラズマ処理の間に平らな表面に層3のパラフィンフィルムを取り付けるために両面テープを使用して層2と3でこのプロセスを繰り返します。PDMS膜から余分な材料を切り取り、慎重にチップの底からパラフィンフィルムのシートを剥がします。チップを65°Cで10分間焼いてPDMS層間の接着強度を高め、蓋のアクセスホールに角度分配チップを挿入し、マイクロピペットチップを使用して2部構成のエポキシで固定し、各先端の周りにエポキシを塗布します。エポキシが完全に硬化した後、表面は70%エタノールでチップを洗浄し、バイオセーフティキャビネットに移します。5ミリリットルのシリンジを滅菌シリコーンチューブで分配チップに接続し、チップ全体に70%エタノールを少なくとも30秒間充填します。チップからエタノールを取り出し、一晩紫外線で殺菌します。翌日、チップを蒸留水で3回洗い、水で満たし、分配の先端からチューブを取り除きます。チップを摂氏37度で少なくとも48時間インキュベートします。プティンのシャフトの周りに圧縮スプリングを配置し、ベースの底部の中央の穴に挿入し、4つのセルフタッピングネジでベースの底にダイヤルブロックを取り付けます。中央のネジの周りに第2の圧縮スプリングを配置します。ダイヤルの底部にある六角形の穴にネジを挿入し、ダイヤルブロックの中央にあるネジ穴にアセンブリをねじ込みます。4人の男性と女性のスタンドオフをベースの底にねじ込みます。プメンの上部がベースの上部を下回るまでダイヤルを反時計回りに回してデバイスから緩みを取り除き、プ盤の上部がベースの上部に合うまでゆっくりとダイヤルを時計回りに回します。5ミリリットルのシリンジを使用して深井戸チップから水を取り除き、酢酸に200マイクロリットルのI型コラーゲンを1時間コーティングします。カルシウムとマグネシウムでDPBSを使用してチップを3回リンスし、チップホルダーに入れ.子牛血清、FBS、ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したMEMアルファ培地でMLO-Y4骨細胞をチップにシードします。分配チップからチューブを取り出し、チップを深層培養皿に入れ、セルを摂氏37度、炭酸ガス5%で72時間インキュベートします。インキュベーションの後、滅菌チューブを分配チップに取り付け、5ミリリットルのシリンジを使用して使用済み培養培地をチップから取り除き、チップに新鮮な培地をゆっくりと補充します。チップホルダーをローディングデバイスベースの上部にある長方形のインセットに入れ、蓋のスロットにチューブを供給し、蓋をベースに固定します。目的のプッキーの変位に達するまでダイヤルを時計回りに回してセルに負荷を加え、空のP1000マイクロピペットチップボックスに積み込み装置を置き、細胞を15分間負荷でインキュベートします。インキュベーション後、ダイヤルを反時計回りに元の開始位置に回して細胞から負荷を取り除き、装置から蓋を取り出し、チップホルダーを深層培養プレートに入れ、90分間のポストロード回復期間細胞をインキュベートします。5ミリリットルのシリンジを使用して、調整された媒体をチップホルダーから取り出し、チップホルダーからチップを取り出し、テーパードスパチュラを使用してPDMS蓋とウェル層の間の結合を破ります。これで、セルを分析する準備が整いました。浅い井戸構成は骨芽細胞および破骨細胞の機能活性を分析するために使用することができる。前骨芽細胞からの骨形成は、アリザリン赤とフォンコッサ染色を用いて定量した。破骨細胞からの骨吸収をトルイジンブルー染色法および走査電子顕微鏡を用いて定量し、吸収ピットの存在を検証するために使用した。深いウェルチップ構成を使用して、細胞を静止で伸張して細胞を面外に伸ばして骨細胞メカノトランスダクションを誘導した。チップに播種された骨細胞の画像は、蒸留水でチップを48時間インキュベーションすることが、典型的な形態における細胞生存率を維持するために重要であることを示している。負荷の発作の間に、骨細胞はPDMS膜上で誘発されるひずみ勾配にさらされた。1ミリメートルと2ミリメートルの間の値に対する平均等価歪みとプラッセン変位の関係を決定し、誘導歪みの代表的なヒートマップを生成した。ローディング後、細胞生存率を乳酸デヒドロゲナーゼ染色およびアネキシンVおよび死細胞アッセイで分析した。伸伸骨細胞の乳酸脱水素酵素染色は、より高い歪み値の位置に対応するウェルの外縁付近で軽い染色を示した。当社のプラットフォームは、高い汎用性を提供し、負荷誘発メカノトランスダクション、炎症、薬物効果などの骨のリモデリングを調節する様々な要因を調査するために使用することができます。ここで紹介する技術は、骨の健康を調節する多細胞複雑さの理解を大幅に高めることができるチップ上の真の骨器官を開発するための基礎を提供します。

a-lab-on-chip-platform-for-stimulating-osteocyte-mechanotransduction

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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学ぶラボオンチッププラットフォームを用いた骨細胞培養と力学的負荷による骨形成・吸収の定量解析。骨改造メカニズムの解明や骨粗鬆症・骨折治癒研究への応用が可能です。

骨造形メカノダクタ化を刺激し、骨改造の機能的成果を解析するためのラボオンチッププラットフォーム

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