危険評価のための上皮細胞と原発性免疫細胞からなる多細胞ヒト歯槽モデル

これらの個々のヒトオーディオモデルは、関連する免疫細胞を強力なツールとして使用して、ナノ材料や知識薬を含む物質の急性免疫応答を予測します。これらの医療は、ヒト上皮細胞とヒト初等免疫細胞を組み合わせて、これらの特異的反応を評価する。新鮮な、凍結した単球の使用は実験計画に柔軟性を提供する。

このモデルは、行動感覚と免疫感覚の間の星間コミュニケーションに関する洞察を提供できることを、多くの研究が示しています。このデモには、細胞培養における個人的な形質をモデルに付けるための重要な詳細がすべて含まれているので、実験を再現するための視覚的な指示を示します。膀胱のプロトコルのいくつかのステップは複雑であり、特別な取り扱いを必要とする。

したがって、簡単に従うことができるすべての必要な詳細を示しています。ヒトバフィーコートからの末梢血単球の分離のために、収穫バフィーコートバッグの内容物を250ミリリットルの円錐形チューブの間で均等に分割する。PBSで各チューブ250ミリリットルの総体積を慎重に持参し、3つの穏やかな反転とチューブを混合します。

その後、バフィーコートPBS溶液を4つの新しい50ミリリットルチューブの間で均等に分割し、その後、チューブに7番目の総細胞をCD 14正の磁気ビーズの10マイクロリットルを追加し、ピペットによってよく混合します。充填時にピペットをピペットから取り外し、すぐにピペットの上部開口部を親指で差し込み、充填されたピペットを1つのチューブの底に置き、ピペット開口部を抜き、密度勾配媒体がピペットの中に1ミリリットル残るまで、バフィーコートPBS混合物の下にゆっくりと流れる密度勾配媒体を可能にします。密度勾配培地が各管に同じように添加された場合、密度勾配遠心分離により細胞を分離し、血漿と密度勾配媒体層の間から白2〜3ミリメートル厚末梢血単核細胞層を採取するための血清学的ピペットを使用する。

層を接続する最善の方法は、最初にプラズマを除去し、次に細胞を収集するために私たちの論理的なピペットを抑制することです。2つのチューブの各セットから末梢血単核細胞を1つの新しい50ミリリットルチューブに引き出し、洗浄ごとに新鮮なPBSの合計体積50ミリリットルで細胞を2回洗浄します。その後、上清を捨て、新鮮なPBSの5ミリリットルでそれぞれピペットを再中断し、セルの懸濁液をカウント用の単一のチューブにプールします。

カウント後、再び細胞を遠心分離し、7番目の細胞に出席して1回80ミリリットルの磁気分離バッファーにペレレットを再懸濁する。その後、チューブに7番目の総細胞に出席するごとにCD 14陽性磁気ビーズの10マイクロリットルを追加し、ピペットによってよく混合します。摂氏4度で15分間のインキュベーションを行った後、3ミリリットルの磁気分離バッファーで磁気カラムをリンスし、セルをカラムに加えます。

1回の洗浄で3ミリリットルのバッファーでカラムを3回洗浄し、新鮮な磁気分離バッファーの1ミリリットルを含む15ミリリットルチューブにカラムを移します。次に、プランジャーと5ミリリットルのバッファーを使用して、CD 14陽性細胞をチューブにフラッシュします。磁気ビーズ単離CD14陽性細胞の分化を誘導する。

まず、細胞培養培地中のミリリットル濃度当たり6細胞に一度に再懸濁する。MDDC分化は、チューブに1ミリリットル当たり10ナノグラムを加え、グラナサイトマクロファージコロニー刺激因子を加え、6つのウェル細胞培養プレートの各ウェルウェルに3ミリリットルの細胞を加える、またはMDM分化は、ちょうど実証したように細胞に1ミリリットル当たり10ナノグラムのマクロファージコロニー刺激因子を加え、細胞をプレートする。ヒト肺胞上皮細胞組織トリプル細胞共培養モデルを設定するには、まず1.5ミリリットルのプレウォーム細胞培養培地を12ウェルプレートの適切な数のウェルに移し、細胞培養インサートを各ウェルに入れる。

次に、500マイクロリットルの上皮細胞懸濁液を5倍の密度で500マイクロリットルから1ミリリットル当たり5番目の細胞を各挿入物のアプリカル側に加え、細胞培養インキュベーターで4日間プレートを覆う。またはMDDC播種は、MDDC分化に使用される6つのウェルプレートのウェルズからの上清を1ミリリットルの新鮮な温細胞培養培地に置き換え、細胞スクレーパーを使用して各ウェルから接着細胞を取り外す。各井戸を上華で3回洗い、各ウェルで洗浄し、すべての細胞溶液を1つの遠心分離管に組み合わせます。

遠心分離と無菌ピンセットによって収穫されたMDDCは、無菌ペトリ皿に12ウェルプレートからのインサートを逆さまに配置する。挿入物の基底側から任意の上皮細胞を掻き取り、新鮮な細胞培養培地中のMDDCを再中断し、この細胞の濃度をミリリットル当たり10倍にする。次に、各インサートに150マイクロリットルのセルを加え、挿入物の基底面全体が泡なしで液体で均等に覆われるようにします。

MDDCに対して実証された分化MDDMを収穫した後のMDDM播種の場合、細胞を新鮮な細胞培養培地濃度の4ミリリットル当たり2.5倍に希釈し、各上皮細胞およびMDDC含有細胞培養インサーの壁に500マイクロリットルの細胞を加え、蓋をプレートに置き、プレートにプレートにプレートを置く。翌日、各細胞培養インサートとウェルズの補助領域と基底領域の両方から上清を吸引する。その後、ピンセットを殺菌してウェルズからインサートを持ち上げ、600マイクロリットルの新鮮なプリウォームを細胞培養培地に各ウェルに加えます。

6日間の分化の後、MDMは形状が丸く表示され、MDDCはより細長い形状と観察可能な突起を持つ細胞で構成されたクラスターを形成します。膜挿入物上で3日間の増殖の後、上皮細胞は膜破断に対する陽性対照への暴露時に基底コンパートメントの細胞培養培地において高密度の高い乳酸デヒドロゲナーゼ放出の有意な増加を認め、細胞傷害性物質に対するモデルの応答性を証明する。TNFアルファまたはLPSによるアプリカル刺激で測定した乳酸デヒドロゲナーゼ放出の増加なし。

IL6およびIL8の放出における統計的に有意な増加は、未処理細胞の対照と比較してLPSおよびTNFアルファ処理サンプルの両方で観察される。新末梢血単球由来のMDDMとMDDcを用いた共培養モデルと、LPSおよびTNFα露出共培養で解凍細胞を用いたものと比較して、細胞形態の違いは認められず、破壊された上皮層が観察された。気道や気管支の細胞などの他のタイプのヒト細胞を用いることができ、他の端点も解析できる。

主に研究者は、セットアップに似ていますが、異なる細胞タイプを使用して、この技術に触発されています。