多アドレス可能なゲノム積分色(MAGIC)マーカーを皮質マウスアストロサイトに個別化する子宮内電気的

アストロサイトは大脳皮質を均一にタイル化し、複雑な形態の分析を細胞レベルで困難にします。ここで提供されるプロトコルは、子宮内のエレクトロポレーションに基づく多色標識を使用して、皮質アストロサイトを単一にし、ユーザーフレンドリーな画像解析パイプラインでボリュームと形態を分析します。

MAGIC Markerの子宮内エレクトロポレーションは、皮質アストロサイトの形態を迅速に個別化し、評価するための強力で汎用性の高い技術です。この特定の技術の主な利点は、複数の前駆細胞とニューロンおよびウイルスの子孫を正確な制御で標識することです。私と一緒に手順を実演するのは、主任研究者であるKarine Loulierです 手順を開始する前に、ガラスビーズ滅菌器で高温ですべての手術器具を滅菌します。

そして、電極ゲルを35mmの皿に一滴垂らします。マイクロピペットをマイクロインジェクションホルダーに挿入し、マイクロピペットの先端を折ってしまいます。DNA溶液を吸引し、1マイクロリットルの高速緑色溶液をピペットで3センチメートルの皿の蓋に基準として入れます。

次に、壊れたマイクロピペットから基準ドロップの隣に容量を追加し、必要に応じて圧力または時間パラメータを再調整します。マイクロインジェクターによって同等のサイズの液滴が生成されます。容量が基準容量より小さい場合は、マイクロピペットの先端を再度折って繰り返します。妊娠中のマウスを準備するために、体重を量り、麻酔薬を注射した後、麻酔をかけた雌マウスの反応の欠如を確認し、動物の眼に軟膏を塗布します。

温めパッドの上で仰臥位に置いたマウスの腹部をやさしく剃った。露出した肌は、ヨウ素を染み込ませたパッドとアルコールを染み込ませたパッドで拭きます。そして、動物の剃毛され、洗浄され、消毒された手術領域の周りに滅菌湿布を置きます。

マウスの準備ができたら、下腹部に2センチメートルの垂直正中線切開を行います。そして、胚の袋を優しく操作して子宮の角を露出させます。子宮頸部の位置と、子宮頸部の両側にある胚嚢の数を評価します。

そして、エレクトロポレーションされる胚の15.5日目の胚の脳を向き、脳裂に沿って走る3つの主要な血管の接合部で容易に認識できるブラフマを視覚化できるようにします。ブラフマーと目の間に仮想の線があることを想像し、仮想の線と縦方向の亀裂の間にマイクロピペットを導入します。次に、フットペダルを踏んで、1マイクロリットルのDNA溶液を標的半球の側脳室に送達します。

正常に注入された心室は青色に見えます。DNAが注入された後、注入された半球をアノードで覆うように、胚の両側に電極を塗布します。エレクトロポレーターのフットペダルを踏むと、950ミリ秒間隔で50ミリ秒35ボルトの電荷が4回

次に、温かい生理食塩水で胚を水和させます。標的となったすべての胚がエレクトロポレーションされたら、子宮角を腹部に戻し、腹腔を温かい生理食塩水で満たします。連続吸収性縫合糸で腹部の筋肉を閉じます。

そして、4-0吸収性縫合糸の約10針で皮膚を閉じます。外科的処置の最後に、切開部に沿って皮膚縫合糸を規則的に配置します。その後、完全に回復するまで監視しながら動物を清潔なケージに入れます。

完全に回復した妊娠中のマウスは、きちんとした毛皮と無傷の外科的切開を持っている必要があります。注入された組織のマルチチャンネル共焦点イメージングでは、適切なレーザーの励起用に顕微鏡を設定します。そして、エレクトロポレーション領域で最も明るいアストロサイトを見つけます。

表面に最も近いラベル付きセルは、スライス内の深いセルよりも明るく見える場合があるため、高低ルックアップテーブルを使用して、画像が飽和しないように表面セルの取り込み設定を調整します。適切にバランスの取れた画像には、青のピクセルがいくつか表示され、赤のピクセルはほとんど表示されません。次に、顕微鏡の電動ステージを使用して、隣接するスタック間に10%のオーバーラップがあるタイル張りの1024 x 1024ピクセルのZスタックを取得し、その後、エレクトロポレーションされた領域または対象ゾーンのモザイク再構成を可能にします。

標識されたアストロサイトは、20倍、0.8naの対物レンズで取得したタイル状の共焦点画像で評価でき、実証されているようにZスタック再構成として組み立てることができます。個々のアストロサイトの輪郭は、各アストロサイトが占める領域領域のセグメンテーションと再構築のために、共焦点画像スタックの個々の光学セクションごとに描写できます。同じZ画像スタックから、主要なアストロサイトプロセスの骨格を抽出できるオープンアクセスソフトウェアを使用して、選択した皮質アストロサイトの分岐形態をセグメント化できます。

手術中および閉鎖縫合糸を留置する前に適切な水分補給を行うことは、胚の生存者と母親の回復を促進するために重要です。MAGICマーカーツールボックスの子宮内エレクトロポレーションを使用して、発生価値の段階で異なるモデルで前駆細胞を標識し、単一細胞の分解能で系統を追跡できます。