Name: 多アドレス可能なゲノム積分色(MAGIC)マーカーを皮質マウスアストロサイトに個別化する子宮内電気的 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 学ぶ子宮内電気穿孔法による皮質アストロサイトの個別化と形態解析。MAGICマーカーを用いてマウス胎児の神経細胞を標識し、コンフォーカル顕微鏡で詳細な三次元構造を可視化する手法を解説します。

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S.フーケと、モンペリエ研究所とニューロサイエンス・ド・モンペリエ研究所(MRIおよびRAM)のイメージングおよび動物のコア施設に感謝します。この作品は、レギオン・イル=ド・フランスとフォンダシオンARCのフェローシップが、スラ・レシェルシュ・シュル・ル・ガンをS.Cに注ぎ、パリ・サクレー大学(イニシアチブ・ドクナール・ディスクリネール)からL.A.に支援されました。 欧州研究評議会(ERC-SG 336331、PI J.ヴァレット)からE.H.への資金援助により、ANR-10-LABX-65(LabEx LifeSenses)、ANR-11-EQPX-0029(イキペックス・モルホスコープ2)、ANR-10-IN-04、フォンダシオンは、ラ・レシェルシュ・メディカル(Ref. DBI2014123328)、欧州研究評議会(ERC-CoG 649117、PI J.リベット)、およびATIP-Avenirプログラム(PI K.ルーリエ)を注ぎます。

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<li>Figueres-Oñate, M., Sánchez-Villalón, M., Sánchez-González, R., López-Mascaraque, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+Tracing+and+Cell+Potential+of+Postnatal+Single+Progenitor+Cells+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Lineage Tracing and Cell Potential of Postnatal Single Progenitor Cells In Vivo.</a> Stem Cell Reports. 13 (4), 700-712 (2019).</li>
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<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li>
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<li>Chen, F., LoTurco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+stable+transgenesis+of+radial+glia+lineage+in+rat+neocortex+by+piggyBac+mediated+transposition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition.</a> Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 172-180 (2012).</li>
<li>Siddiqi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+Mapping+by+PiggyBac+Transposase+Reveals+That+Neocortical+GLAST%2B+Progenitors+Generate+More+Astrocytes+Than+Nestin%2B+Progenitors+in+Rat+Neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Fate Mapping by PiggyBac Transposase Reveals That Neocortical GLAST+ Progenitors Generate More Astrocytes Than Nestin+ Progenitors in Rat Neocortex.</a> Cerebral Cortex. 24 (2), 508-520 (2014).</li>
<li>Yoshida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+expression+of+different+transgenes+in+neurons+and+glia+by+combining+in+utero+electroporation+with+the+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system.</a> Genes to Cells. 15 (5), 501-502 (2010).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+Improved+Tools+for+In+Utero+Electroporation+Studies+of+Developing+Cerebral+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and Improved Tools for In Utero Electroporation Studies of Developing Cerebral Cortex.</a> Cerebral Cortex. 19, suppl 1 120-125 (2009).</li>
<li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+Genetic+Manipulation+of+Dendrites+and+Spines+in+the+Mouse+Cerebral+Cortex+and+Hippocampus+using+in+utero+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using in utero Electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e4163(2012).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

皮質前駆体中のMAGICマーカーの子宮エレクトロポレーション(IUE)では(図1)出生後異なる段階で出生後大脳皮質全体のアストロサイトの標識が可能になった(P4-P7-P21、図2)。興味深いことに、E13.5からE15.5に行われるエレクトロポレーションは皮質アストロサイト14に関する同様の標識パターンをもたらすので、IUEの段階は重要ではない。しかし、皮質のパレンチマにおける標識された錐体ニューロンの位置は、エレクトロポレーション段階によって変化する。実際、E15で行われたIUEは、層2〜3ニューロンをマークし、E13で行われたIUEは、層5から層2〜36、27まで、すべての皮質層のピラミッド型ニューロンを標識する。MM IUEに続く皮質錐体ニューロンのこの関節標識は、緻密なニューロン標識がアストロサイトプロセス認識を妨げる層におけるアストロサイト形態...

アストロサイトは脳の発達と生理学の中で多くの重要な機能を果たします。栄養摂取や血流を調節する血液脳関門での役割のほかに、ニューロンの活動や行動を変えることができる神経調節薬を産生しながら、シナプス形成と機能に積極的に寄与する。さらに、アストロサイト機能障害は、様々な神経障害3に寄与する。大脳皮質に位置するアストロサイトは、神経細胞プロセスとの広範な接触を可能にする精巧な形態を示す。これらの接触は、回路機能に必須であり、また、細胞接着タンパク質4を介してアストロサイト形態形成およびシナプト生成を制御する。神経科学者は、関心のある神経学的モデルにおけるアストロサイトの発達と形態形成を調査するための便利で堅牢なツールを必要としています。しかし、近隣に対するアストロサイトの接近と均一な三次元タイリングにより、皮質アストロサイトを単一にし、免疫マーカーを使用してその形態を包括的に評価することは困難です。
現在、2つの主要な遺伝子工学戦略は、その際の皮質アストロサイトの標識と個別化を可能にする:トランスジェニックマウスラインでのまばらなレポーター活性化またはレポータープラスミドのエレクトロポレーションを用いた体細胞トランスジェネシス。最初の戦略は、タモキシフェン送達時にアストロサイトで特異的に活性化されたクレリコンビナーゼの誘導可能な形態を発現するマウスでフロクスされたレポーターマウスラインを繁殖させることに依存する(例えば、Aldh1l1-CreERT25)。この戦略には、いくつかの欠点があります。まず、トランスジェニックマウスの繁殖には多数の動物が必要であり、多重アッセイは典型的には、皮質アストロサイトの十分にまばらな標識を提供するためにタモキシフェンの適切な用量を決定するために必要である。目的の遺伝的マウスモデルで皮質アストロサイト表現型を分析するには、さらに多くの繁殖とマウスの消費が必要になります。さらに、子宮タモキシフェン注射では分化を妨げることが知られており、この戦略はアストロサイトの初期段階の研究に適用することが困難である。インビボDNAエレクトロポレーションは、動物の最小数6に依存する代替タモキシフェンフリー戦略である。胚期または出生後の段階で行われるこのアプローチは、げっ歯類の側腹腔にレポータープラスミドを注入し、続いて細胞膜に毛穴を作る電気パルスを注入することで構成され、DNAが心室を裏打ちする前駆細胞に入ることを可能にする。続いて、電気ポレートされたプラスミドによって運ばれるレポータートランスジーンは、標的細胞機械によって処理され、7を発現する。2つのエレクトロポレーション方法は、以前にマウス皮質アストロサイトにラベルを付けるために説明されている:1)早期出生後段階で1-2単色エピソードレポータープラスミドのエレクトロポレーションに依存するエレクトロポレーション(PALE)による出生後アストロサイトラベリング。2)複数の単色統合レポータープラスミド8、9、10の子宮エレクトロポレーション(IUE)に基づくStarTrack戦略。これら2つの技術は、効率的に大脳皮質にPrAを標識するが、彼らはまた、いくつかの制限を提示する。それらの初期バージョンでは、両方の方法は、アストロサイトの発現を駆動するためにグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)プロモーターに依存しており、これは、通常の安静時PrA11,12よりも強くGFAPを発現するピアルおよび反応性アストロサイトに対してラベリングを偏らせる可能性がある。PALEに関しては、早期生まれのPrA(または初期の剥離前駆体から生じるもの)の標識を防ぐエレクトロポレーションの後期段階と、アストログリア開発の初期段階の分析、およびPrAが出生後13週目の間に受ける大規模な分裂の間に連続した分裂を通じて希釈されるエピソームベクターの使用である。PALEとは対照的に、StarTrackは、PrAへの胚性および出生後前駆物質の両方の寄与を追跡することを可能にする統合レポータープラスミドの胚エレクトロポレーションに基づいています。ユビキチンCプロモーター(UbC-StarTrack)に依存する更新されたStarTrackスキームは、神経前駆物質15、16、17の神経およびグリア降下(アストロサイトを含む)の両方における蛍光レポーターのより広い発現を達成する。しかし、現在のバージョンでは、このアプローチの実装は、部分的な励起および発光スペクトルの重複を有する6つの蛍光タンパク質(FP)を発現する12の異なるプラスミドの等モル混合物に依存するため、複雑である。
ここで提示される、強力で広く活性なプロモーターによって駆動される統合レポーター構築物を用いた子宮エレクトロポレーションベースの多色ラベリング法における簡単な表題は、皮質アストロサイト14を単一化する。また、ライセンス(例えば、イマリス)とオープンアクセス(Vaa3D18、19、20)の両方を使用した容易な画像解析パイプラインが、それぞれアストロサイトの領土容積と樹状化をセグメント化するために提供される。前述の方法と比較して、この戦略は、細胞質に向けられた1〜2色の多色積分性遺伝子多アドレス組み込み色マーカー(MAGICマーカーまたはMM21)と、細胞メガロウイルスエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター、ウサギβ-globinsplicesを含む合成CAGプロモーターによって発現が駆動される核細胞コンパートメントのみに依存する。これにより、胚性から出生後後期までの皮質アストロサイトの標識および追跡が可能となり、GFAP発現14,23とは無関係である。これらのトランス遺伝子のそれぞれは、次の4つの異なるFPを有する:eBFP、mTurquoise2/mCerulean、EYFP、およびtdTomato / mCherryは、1)シーケンシャルチャネル取得で簡単に回避できる最小限のスペクトル重複を表示する;2)最適化された励起力とコレクションのゲイン。3)狭いFP放出窓を収集するために特定の二色フィルタ。MM戦略は、細胞集団におけるFPの確率発現を駆動するために、自己切除可能なCreリコンビナーゼ(seCre)とCre/loxの再結合を使用する。MMトランスジーンの単一のコピーは、相互に排他的な方法でFPを発現し、複数の遺伝子がFPの組み合わせを生み出し、数十の異なる色合いを生み出します。遺伝子導入のゲノム積分は、ピギーバク(PB)またはTol2転置システム24、25、26によって駆動される。したがって、子宮エレクトロポレーションを通して、MMツールキットとそれが生成する多色の「モザイク」は、複数の隣接する皮質前駆物質の同時マーキングと、皮質アストロサイトを含むそれらのグリア降下の追跡を長期間にわたって可能にする。色のコントラストは、PrAの輪郭の明確なFPの表現から生じるコントラストを許可し、その後、その領土容積(IMARISを使用)と複雑な形態(Vaa3Dを使用)に関する重要な情報を抽出します。ここで詳しく示される多色戦略は、様々な発達段階で野生型マウスの皮質アストロサイト表面および形態に迅速かつ容易にアクセスできる便利で堅牢な方法であり、トランスジェニックレポーターラインを使用することなく、神経疾患のマウスモデルにおけるアストロサイト解剖学的特徴を調査するために容易に適応可能である。

<table><tbody><tr><td>1.1 バクテリア transformation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>Euromedex</td><td>EU0400-C</td><td></td></tr><tr><td>DH5 アルファ コンピテント セル</td><td>フィッシャー サイエンティティック</td><td>11563117</td><td></td></tr><tr><td>アイス ボックス</td><td>ダッチャー</td><td>139959</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>シグマ</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>LB 寒天</td><td>シグマ</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>SOCミディア</td>ム<td>フィッシャーサイエンティスティック11563117</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌ペトリ皿-10cm</td><td>サーモフィッシャー150350</td><td></td><td></td></tr>ウォーター<tr><td>バス</td><td>VWR462-0556H</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.2プラスミド培養</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>14ml培養チューブ</td><td>ダッチャー</td><td>187262</td><td></td></tr><tr><td>ガラス三角材 - 2L</td><td>フィッシャー サイエンティック 11383454</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB ミディアム</td><td>シグマ</td><td>L3522</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.3 プラスミド DNA 調製</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi Plus EF</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740426.10</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.1 溶液の調製</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>26 G x 1/2 針</td><td>テルモ</td><td>8AN2613R1</td><td></td></tr><tr><td>30 G x 1/2 針</td><td>テルモ</td><td>8AN3013R1</td><td></td></tr><tr><td>ファスト グリーン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>F7272</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てポリプロピレン シリンジ、1 mL</td><td>ダッチャー</td><td>50002</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.2 手術材料の準備</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adson 鉗子 - DeBakey パターン- 12.5 cm</td><td>FST</td><td>11617-12</td><td></td></tr><tr><td>アーチ型先端鉗子 - 10</td><td>cm FST</td><td>11071-10</td><td></td></tr><tr><td>ガラスビーズ滅菌器 Steri 250</td><td>シグ</td><td>マ Z378569</td><td></td></tr><tr><td>ガラスマイクロピペット 1 mm直径</td><td>FHC</td><td>10-10-L</td><td></td></tr><tr><td>グレーフ鉗子 - チタン 1 mm チップ わずかなカーブ - 10 cm</td><td>FST</td><td>11651-10</td><td></td></tr><tr><td>グレーフ鉗子 - チタン 1 mm チップ ストレート - 10 cm</td><td>FST</td><td>11650-10</td><td></td></tr><tr><td>アイリスハサミ - デリケート ストレート - 9 cm</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>ラボテープ</td><td>フィッシャー サイエンティスティック</td><td>11730454</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクター</td><td>INJECT+MATIC</td><td>カタログ番号</td><td></td>なし</tr><tr><td>Olsen-Hegar ニードルホルダー - 12 cm</td><td>FST</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>光ファイバー</td><td>VWR</td><td>631-1806</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックコーティングされたホワイトペーパー</td><td>ディストリム</td><td>700103</td><td></td></tr><tr><td>Signagel 電極ゲル</td><td>Free-Med</td><td>15-60</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ペトリ皿 - 35 mm</td><td>ダッチャー</td><td>056714</td><td></td></tr><tr><td>滅菌器、ガラスドライビーズ、ステリ 250</td><td>シグマ</td><td>Z378569<</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>2.3 妊娠中の女性マウスの準備</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アルコールパッド</td><td>アルコムド</td><td>1731000</td><td></td></tr><tr><td>Buprecare</td><td>Axience</td><td>0.3 mg/ml</td><td></td></tr><tr><td></td><td>tRAFFIN</td><td>70189</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>Merial</td><td>Imalgene 1000</td><td></td></tr><tr><td>眼球ゲル</td><td>tvm lab</td><td>Ocry-gel</td><td></td></tr><tr><td>RjOrl:SWISS マウス</td><td>Janvier Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベタジン、10% 溶液</td><td>Vetoquinol</td><td>4337400113B</td><td></td></tr><tr><td>保温パッド</td><td>ハーバード 装置</td><td>72-0493</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>Bayer</td><td>Rompun 2%</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><ストロング>3.2 エレクトロポレーション</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>吸収性縫合糸 サイズ 4-0 45 cm 縫合糸 1本針 19 mm 長さ 3/8 サークル リバース</td><td>ノボシン</td><td>C0068220</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーター ソニデル</td> ソ<td>ニデル</td><td>NEPA 21</td><td></td></tr><tr><td>滅菌トランスファーピペット(個別包装)</td><td>ダッチャー</td><td>043202S</td><td></td></tr><tr><td>3 mmプラチナディスク電極付きピンセット</td><td>Sonidel</td><td>CUY650P3</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4.1 組織採取および切片化</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Antigenfix</td><td>Microm Microtech</td><td>U/P0014</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>ダッチャー</td><td>100266</td><td></td></tr><tr><td>ドレタル</td><td>ベトキノール</td><td>DOL202</td><td></td></tr><tr><td>DPBS(10X)、カルシウム、マグネシウムなし</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>11540486</td><td></td></tr><tr><td>マニキュア</td><td></td>EMS72180<td></td><td></td></tr><tr><td>スライド</td><td>ダッチャー</td><td>100001</td><td></td></tr><tr><td>ベクタシールド</td><td>Vectorlabs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>ビブラートム</td><td>ライカ</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5。マルチチャンネル共焦点イメージング</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20倍オイル NA 0.85</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査顕微鏡</td><td>カールツァイス</td><td>LSM880</td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>プランアポクロマート 20倍/0.8 M27</td><td>カールツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><強い>6。アストロサイトの領土体積セグメンテーション</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMARIS 8.3以降のバージョン</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7.アストロサイトアーボライゼーショントレーシング</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3D可視化支援解析ソフトウェアスイート(Vaa3D)</td><td>HHMI - Janelia Research Campus /Allen Institute for Brain Science</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

多アドレス可能なゲノム積分色(magic)マーカーを皮質マウスアストロサイトに個別化する子宮内電気的

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

マウス大脳皮質に位置する原質星血球(PrA)は、しっかりと並置され、成人期に明らかに連続した三次元マトリックスを形成する。これまでのところ、免疫染色戦略はそれらを選び出して、成熟した動物および皮質形成の過程でそれらの形態をセグメント化することはできません。皮質PrAは、後側のパリウムに位置する前駆物質に由来し、統合ベクターの子宮エレクトロポレーションで容易に標的化することができる。これらの細胞に対して、ピギーバク/Tol2転位とCre/lox の組み換えによって特定の細胞内区画に対処された明確な蛍光タンパク質(青、シアン、黄、赤)を表すマルチアドレス可能なゲノム統合色(MAGIC)マーカー戦略でこれらの細胞にラベルを付けるプロトコルが提示されます。この多色の運命マッピング戦略は、神経新生の開始前にカラーマーカーの組み合わせを持つその場で近くの皮質前駆物質をマークし、個々の細胞レベルで胚性から成体段階まで、アストロサイトを含む子孫を追跡することを可能にする。マルチアドレス可能なゲノム積分カラーマーカー(MAGICマーカーまたはMM)によって提供される電気ポレートベクターと色コントラストの濃度を調整することによって達成される半スパース標識は、アストロサイトを個別化し、その緻密な解剖学的配置にもかかわらず、その領土と複雑な形態を選び出すことを可能にする。ここでは、エレクトロポレーション手順の詳細、共焦点顕微鏡によるマルチチャネル画像スタックの取得、および実験者が個々のPrA量と形態を評価することを可能にするコンピュータ支援3次元セグメンテーションを含む包括的な実験ワークフローを提示します。要約すると、MAGICマーカーのエレクトロポレーションは、多数のアストロサイトを個別にラベル付けし、異なる発達段階で解剖学的特徴にアクセスするための便利な方法を提供します。この技術は、トランスジェニックレポーターラインを持つ複雑な十字に頼ることなく、様々なマウスモデルにおける皮質アストロサイト形態学的特性を分析するのに有用である。

胚皮質前駆物質におけるMAGICマーカーのエレクトロポレーションにより、大脳皮質の初期から後期までの天体の標識が可能になります(図1)。これらのアストロサイトは、大脳皮質全体に広く分散した様々な出生後段階(P4、P7、P21)ですべての皮質層で発見された。それらは、20x 0.8 NA(またはそれ以上のNA)目的で取得したタイル化された共焦点画像で評価され、Zスタック再構築として組み立てられた(図2)。MAGICマーカーの組み合わせ標識により、皮質アストロサイトの個別化と、その容積および形態に関する情報の抽出が可能になりました。市販の画像解析ソフトウェアを用いて、個々のアストロサイトの輪郭を共焦点画像スタックの個々の光学部分に分線化し、各アストロサイトが占める領域を分割して再構築した(図3)。同じZ-imageスタックから、シングルアウト皮質アストロサイトの分岐形態を、主なアストロサイトプロセスの骨格の抽出を可能にするオープンアクセスソフトウェアを使用してセグ...

アストロサイトは大脳皮質を均一にタイル化し、複雑な形態の分析を細胞レベルで困難にします。ここで提供されるプロトコルは、子宮内のエレクトロポレーションに基づく多色標識を使用して、皮質アストロサイトを単一にし、ユーザーフレンドリーな画像解析パイプラインでボリュームと形態を分析します。

多アドレス可能なゲノム積分色(MAGIC)マーカーを皮質マウスアストロサイトに個別化する子宮内電気的

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at ...

MAGIC Markerの子宮内エレクトロポレーションは、皮質アストロサイトの形態を迅速に個別化し、評価するための強力で汎用性の高い技術です。この特定の技術の主な利点は、複数の前駆細胞とニューロンおよびウイルスの子孫を正確な制御で標識することです。私と一緒に手順を実演するのは、主任研究者であるKarine Loulierです 手順を開始する前に、ガラスビーズ滅菌器で高温ですべての手術器具を滅菌します。そして、電極ゲルを35mmの皿に一滴垂らします。マイクロピペットをマイクロインジェクションホルダーに挿入し、マイクロピペットの先端を折ってしまいます。DNA溶液を吸引し、1マイクロリットルの高速緑色溶液をピペットで3センチメートルの皿の蓋に基準として入れます。次に、壊れたマイクロピペットから基準ドロップの隣に容量を追加し、必要に応じて圧力または時間パラメータを再調整します。マイクロインジェクターによって同等のサイズの液滴が生成されます。容量が基準容量より小さい場合は、マイクロピペットの先端を再度折って繰り返します。妊娠中のマウスを準備するために、体重を量り、麻酔薬を注射した後、麻酔をかけた雌マウスの反応の欠如を確認し、動物の眼に軟膏を塗布します。温めパッドの上で仰臥位に置いたマウスの腹部をやさしく剃った。露出した肌は、ヨウ素を染み込ませたパッドとアルコールを染み込ませたパッドで拭きます。そして、動物の剃毛され、洗浄され、消毒された手術領域の周りに滅菌湿布を置きます。マウスの準備ができたら、下腹部に2センチメートルの垂直正中線切開を行います。そして、胚の袋を優しく操作して子宮の角を露出させます。子宮頸部の位置と、子宮頸部の両側にある胚嚢の数を評価します。そして、エレクトロポレーションされる胚の15.5日目の胚の脳を向き、脳裂に沿って走る3つの主要な血管の接合部で容易に認識できるブラフマを視覚化できるようにします。ブラフマーと目の間に仮想の線があることを想像し、仮想の線と縦方向の亀裂の間にマイクロピペットを導入します。次に、フットペダルを踏んで、1マイクロリットルのDNA溶液を標的半球の側脳室に送達します。正常に注入された心室は青色に見えます。DNAが注入された後、注入された半球をアノードで覆うように、胚の両側に電極を塗布します。エレクトロポレーターのフットペダルを踏むと、950ミリ秒間隔で50ミリ秒35ボルトの電荷が4回連続で供給されます。次に、温かい生理食塩水で胚を水和させます。標的となったすべての胚がエレクトロポレーションされたら、子宮角を腹部に戻し、腹腔を温かい生理食塩水で満たします。連続吸収性縫合糸で腹部の筋肉を閉じます。そして、4-0吸収性縫合糸の約10針で皮膚を閉じます。外科的処置の最後に、切開部に沿って皮膚縫合糸を規則的に配置します。その後、完全に回復するまで監視しながら動物を清潔なケージに入れます。完全に回復した妊娠中のマウスは、きちんとした毛皮と無傷の外科的切開を持っている必要があります。注入された組織のマルチチャンネル共焦点イメージングでは、適切なレーザーの励起用に顕微鏡を設定します。そして、エレクトロポレーション領域で最も明るいアストロサイトを見つけます。表面に最も近いラベル付きセルは、スライス内の深いセルよりも明るく見える場合があるため、高低ルックアップテーブルを使用して、画像が飽和しないように表面セルの取り込み設定を調整します。適切にバランスの取れた画像には、青のピクセルがいくつか表示され、赤のピクセルはほとんど表示されません。次に、顕微鏡の電動ステージを使用して、隣接するスタック間に10%のオーバーラップがあるタイル張りの1024 x 1024ピクセルのZスタックを取得し、その後、エレクトロポレーションされた領域または対象ゾーンのモザイク再構成を可能にします。標識されたアストロサイトは、20倍、0.8naの対物レンズで取得したタイル状の共焦点画像で評価でき、実証されているようにZスタック再構成として組み立てることができます。個々のアストロサイトの輪郭は、各アストロサイトが占める領域領域のセグメンテーションと再構築のために、共焦点画像スタックの個々の光学セクションごとに描写できます。同じZ画像スタックから、主要なアストロサイトプロセスの骨格を抽出できるオープンアクセスソフトウェアを使用して、選択した皮質アストロサイトの分岐形態をセグメント化できます。手術中および閉鎖縫合糸を留置する前に適切な水分補給を行うことは、胚の生存者と母親の回復を促進するために重要です。MAGICマーカーツールボックスの子宮内エレクトロポレーションを使用して、発生価値の段階で異なるモデルで前駆細胞を標識し、単一細胞の分解能で系統を追跡できます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

子宮内エレクトロポレーションでは発達中の中枢神経系（CNS）における空間的および時間的に制御された方法で迅速な遺伝子デリバリーを可能にする。ここでは、終脳、間脳や網膜など、複数の胚中枢神経系領域、中に発現構築物を提供するために使用することができる子宮内エレクトロポレーションプロトコルにおける適応性の高いを説明します。...

使用した複数のCNS準州への効率的な遺伝子送達子宮内でエレクトロポレーション

発展途上のマウス脳への遺伝子導入法は、ユニークな手術法と電極の特殊な形状を用いて記述されます。このユニークな手法は、脳の発達の研究に多くの神経科学者を支援する時間的および空間的にプラスミドDNAのトランスフェクションすることができます。...

マウス子宮内でエレクトロポレーション：制御時空間遺伝子導入

この資料では詳細に子宮内で大脳皮質およびマウスのE14.5における海馬をエレクトロポためのプロトコルについて説明します。また、このこれらの2つの脳領域で樹状突起と棘を研究する貴重な方法であることを示している。...

使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作<em&gt;子宮内で</em&gt;エレクトロポレーション

出典: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains.J. Vis. 経験。...

マウス皮質介在ニューロン前駆細胞におけるアガロース包埋エレクトロポレーション支援遺伝子導入

視床下部の機能や医療の重要性にもかかわらず、...

マウスの遺伝子操作は、視床下部を介して開発<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーション

この原稿は、単一細胞レベルおよび蛍光標識された神経細胞の興奮で、ニューロンの構造的接続性を記述するために子宮内エレクトロポレーション（IUE） で使用するプロトコルを提供します。組織学は、樹状突起および軸索突起を特徴付けるために使用されます。急性スライスにおける全細胞記録は、興奮性を調査するために使用されます。...

子宮内エレクトロポレーションは、神経部分集団の興奮とシングルセルの接続を研究するためのアプローチ

脳における遺伝子の細胞の自律的機能損失を誘導することによって学ぶことができるまたは細胞のまばらな人口の機能を得る。ここでは、関数の vivoの損失を引き起こす floxed の遺伝子を持つ皮質ニューロンの開発のまばらな人口に Cre...

子宮内エレクトロポレーション マウス大脳皮質における Cre lox 組換えを誘導します。

子宮エレクトロポレーションの二重は、空間的および時間的に分離された細胞集団を標的にすることを可能にする。この技術は、通常の条件で蛍光タンパク質を使用して、また、目的の遺伝子を摂動する機能実験の後に、それらの細胞集団間の相互作用を視覚化するのに有用である。...

時間的および空間的に分離された細胞集団を標的とする子宮エレクトロポレーションの二重

二重マーカー(MADM)を用いたモザイク解析を用いて、単一細胞レベルで候補遺伝子の系統トレースと機能遺伝子解析を行うプロトコルを紹介する。MADMクローン解析は、個々の前駆細胞とその娘細胞の増殖行動、細胞出力、および系統関係を測定するための定量的枠組みを提供します。...

二重マーカーを用いたモザイク解析を用いた大脳皮質の開発における系統トレースとクローン解析(MADM)

ここでは、出生後マウスの中枢神経系のさまざまな領域に由来するアストロサイトの高度に濃縮された培養物を生成し、転写因子の強制発現によって機能的ニューロンに直接変換するための詳細なプロトコルについて説明します。...

マウスアストロサイトの単離と直接ニューロンリプログラミング

大脳皮質の発達中、ニューロンとグリア細胞は、心室の内側を覆う心室ゾーンで発生し、脳表面に向かって移動します。このプロセスには多くの遺伝子が関与しています。このプロトコルでは、移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージングの技術を紹介します。...

マウス胚脳切片における移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージング

学ぶ子宮内電気穿孔法による皮質アストロサイトの個別化と形態解析。MAGICマーカーを用いてマウス胎児の神経細胞を標識し、コンフォーカル顕微鏡で詳細な三次元構造を可視化する手法を解説します。

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