ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊の ベクターコンピテンス分析

アルボウイルスによって媒介されるアウトブレイクにおいて、対抗策は主に蚊の駆除に限定されています。そのため、どの蚊の個体群や種が特定のアルボウイルスの媒介者となり得るかを特定し、標的とするべきかを判断するベクター能力解析は、極めて重要な予防戦略となります。したがって、感染症の伝播における蚊やその他の媒介者の役割を評価するためのツールボックスの中で、最も重要な要素の一つがベクター能力研究です。これらの実験では、例えば蚊やダニの種だけでなく、地理的系統や、異なるウイルスやその他の感染性生物の非常に特定の株までを精密に制御できるため、世界の非常に特定の地域における、異なる病原体を伝播させる種ごとのリスクについて、極めて精密で十分に制御されたデータを得ることができます。感染した蚊を扱うには、実験者へのリスクおよび感染した蚊の脱出リスクを最小限に抑えるため、専用の施設、トレーニング、経験、そして慎重な計画が必要です。そのため、これらの施設に新しく配属された個人が、非感染の血液摂食蚊を用いて時間をかけて作業し、技術やワークフローに習熟することは非常に重要です。

曝露当日、節足動物封じ込め施設内の電源を入れ、給餌ユニットを予熱します。採取したばかりのクエン酸またはヘパリン処理済みのヒト血球とウイルスストックを1:1の容量比で混合し、標準的な3 mLのリザーバーユニットに未感染のナイーブマウスの皮膚を被せます。カバーしたリザーバーを白いペーパータオルの上に置き、感染血を約2 mL、1 mLずつリザーバーに加えます。

次に、ペーパータオルで点検し、漏れがないことを確認します。感染アッセイを実施する24時間前に、Vero細胞を播種した24ウェル細胞培養プレートを用意し、各ウェルに蚊の個体識別番号とサンプル名を記入します。蚊に感染血 meal を摂取させる当日の朝、水に浸した脱脂綿を取り除き、人工血 meal が入ったリザーバーを、透明なプラスチック製の密閉グローブボックスを用いて給餌ユニットのリードに装着します。

飢餓状態の蚊が入った段ボール箱を、給餌ユニットの下にあるグローブボックス内に配置します。給餌完了後、リザーバーを取り出し、新しく調製した10%漂白剤に浸します。グローブボックス内で、麻酔によって冷却された蚊を氷上のペトリ皿に注ぎ、吸血個体と未吸血個体を分取します。

吸血した蚊を段ボール箱に戻し、速やかにスクリーンと蓋で覆います。箱から過剰なスクリーンメッシュを切り取り、蓋をテープで固定します。滅菌ろ過した10% sucroseを浸した脱脂綿をスクリーンに加え、湿度を維持するために湿ったスポンジを入れた大きなプラスチック製の二次容器に箱を入れます。

二次容器を27°Cでインキュベートし、実験が完了するまで蚊にショ糖を自由にとらせます。メカニカルアスピレーターを使用して、容器からあらかじめ定めた数のインキュベートした蚊を採取し、終了後に採取チューブをコットンラウンドで塞ぎます。グローブボックス内で、冷やして麻酔をかけた蚊を氷上のペトリ皿に注ぎ入れます。

蚊の各脚をすべて（計6本）取り除き、滅菌済みのステンレス製ボールベアリングと500 µLの蚊採取培地（MCM）を入れた、ラベル貼付済みの2 mLマイクロ遠心チューブに入れます。蚊をミネラルオイルの液滴の上にそっと置き、オイルが蚊の頭部や口吻に触れないように注意してください。熱不活化FBS 10 µLを満たしたマイクロピペットチップに口吻を挿入し、30分間唾液を分泌させます。

唾液の入ったピペットチップを100 µLのMCMが入ったマイクロ遠心チューブに排出し、死骸は滅菌済みのスチール製ボールベアリングと500 µLのMCMを入れた別の2 mmチューブに移します。チューブをバイオセーフティキャビネット内のビーズミル組織ホモジナイザーに輸送し、すべての体および脚のサンプルを26 Hzで5分間トリチュレーションし、上清中にウイルス粒子を放出させます。すべてのサンプルを200 ×gで5分間遠心分離して細胞残渣をペレット化し、清澄化します。

サンプルを接種する直前に、あらかじめ準備したVero細胞から培地を除去します。ペレットの状態にある蚊細胞のデブリを乱さないよう注意しながら、体または脚から得られた清澄化上清を各ウェルに100 µLずつ丁寧に分注します。その後、プレートを1時間インキュベートします。

インキュベーション後、各ウェルにメチルセルロースオーバーレイを1 mL加え、プレートをインキュベーターに戻して3〜7日間培養します。オーバーレイプレートをインキュベーターから取り出し、生物安全キャビネットに移動させます。メチルセルロースオーバーレイを10%漂白剤の入ったトレイに廃棄し、各ウェルをPBSで2回洗浄して、洗浄液をそれぞれトレイに廃棄します。

PBSを除去し、1ウェルあたり1 mLのメタノール・アセトンを加え、細胞をプレート上に30分間固定させます。その後、固定液を廃棄し、プレートを乾燥させます。オービタルプレートロッカーを用いて、各ウェルを非滅菌PBSで3回洗浄し（1回につき15分間）、次に各ウェルに1 mLのブロッキング溶液を加え、さらに15分間プレートを揺らします。

各ウェルに100 µLの抗ジカウイルス一次抗体または抗フラビウイルス一次抗体を加え、プレートをロッキングしながら一晩インキュベートします。翌日、一次抗体を除去し、PBSで洗浄を繰り返します。最後の洗浄後、100 µLの二次抗体を加え、ロッキングしながら1時間インキュベートします。

PBSでの洗浄を繰り返し、その後、ウェルあたり100 microlitersの基質発色試薬を加え、プレートを15分間揺曳させます。フォーカスまたはプラークが発色したら、プレートを水道水ですすいで反応を停止させます。水道水を捨ててプレートを風乾させた後、ウイルスフォーカスを定量し、当該サンプルに含まれるフォーカス形成単位数を決定します。

3つの蚊の個体群を、さまざまな血中力価のジカウイルス流行株に曝露させた。その後2週間にわたり、蚊のサブセットを処理し、感染、播種、および潜在的な伝播率を判定した。血中力価が低い場合、ブラジルのサルバドール由来の蚊は、外部潜伏期間が4日、10日、14日経過した後に感染したが、解析した脚において播種性感染の証拠は認められなかった。

最高タイターにおいて、ウイルスは蚊の脚から検出されたが、唾液からは検出されなかった。ドミニカ共和国産の蚊が感染に対して最も感受性が高く、試験したすべての吸血タイターにおいて最も高い伝播能を示した。3つの用量すべてを投与された蚊は、感染後7日までにウイルス拡散を示し、14日後には伝播能を示した。

テキサス州リオグランデバレーの蚊を低濃度の吸血感染にさらしたところ、感染後4日目という早い段階で感染が認められ、14日後に播種性感染が確認されました。最高濃度にさらした群では、感染後2日目から感染が観察され、4日、10日、および14日目にピークに達しました。播種性感染は7日目に観察されましたが、10日目に伝播能を有していたのはわずか1匹の蚊のみでした。

このプロトコルを実施する際は、迅速さよりも安全に作業することが重要です。したがって、脚や翅が除去されるまでは、感染した、あるいは感染している可能性のある蚊は、必ずグローブボックスまたはバイオセーフティキャビネット内で取り扱ってください。基本的なベクター能評価のワークフローは、伝播研究などの後続解析用の感染蚊の作製や、蚊、ウイルス、およびマイクロバイオーム間の相互作用の検討に適応させることが可能です。

ベクター能力（Vector competence）は、ウイルス性疾患の流行時にウイルスを伝播させる蚊の役割を理解するための極めて重要なツールとなっており、これは数十年にわたり同様です。しかし、この手法は、ウイルスと蚊というベクターとの相互作用について新たな知見が得られるたびに、それらを組み込む形で年々進化してきました。2つの例を挙げると、蚊の体内に存在するウイルスの遺伝的集団の多様性は、伝播能力にとって非常に重要であることが判明しており、現在ではウイルスの集団をシーケンシングする新しい手法を用いることで、ベクター能力の研究にその視点を取り入れることが可能になっています。

また、蚊の胃腸管内に生息する細菌やその他の微生物の集団も、伝播能力に大きな影響を与える可能性があることが分かってきており、現在では新しいシーケンシング手法を用いてその集団を評価することが可能です。したがって、ベクター能の評価は、これらの複雑な相互作用についての知見が深まるにつれて進化してきた手法であり、今後も進化し続けるでしょう。