ラットモデルにおける集中超音波を用いた位置特異的血液脳関門開口へのベンチトップアプローチ

マイクロバブル剤を用いた集中超音波は、血液脳関門を局所的かつ一過性に開くことができる。この技術は、血液脳関門を越えて幅広い薬剤を送達するために使用されてきた。この記事では、MRI ガイダンスの有無にかかわらずげっ歯類の脳へのローカライズされた配信のための詳細なプロトコルを提供します。

集束超音波と循環マイクロバブルの組み合わせにより、血液脳関門にミリメートルサイズの一時的な開口部を設けることができます。これにより、全身循環する薬剤を脳領域を標的とする非侵襲的な送達が可能になります。まず、カテーテルプラグに生理食塩水を入れ、動物が過熱しないように注意しながら、ラットの尻尾をランプで温めます。

マイクロバブル、エバンスブルー染料、MRIを使用する場合はガドブトロールMRI造影剤、および目的の実験薬剤を送達するために使用される24ゲージの尾静脈カテーテルを挿入します。静脈が当たると血液が鞘に充満します。ゆっくりと、シースを静脈にさらに押し込みながら、内側の針を取り外します。

ポートが血液で満たされたらすぐに、カテーテルプラグをカテーテルポートの端にねじ込みます。カテーテルとテールにラボテープを慎重に巻き付けて所定の位置に保ちます。上部の小さな部分から始めて、尾側に向かって作業します。カテーテルプラグの一番端を露出させたままにしておきます。

麻酔ラインを定位フレームの麻酔コネクタに差し込みます。次に、口をバイトバーに置き、イヤーバーを両方の耳道に導き、止めネジを締めて、動物の頭をフレームに固定します。動物をMRIベッドに移動します。

テキスト原稿に記載されているパラメータを使用して、脳全体をキャプチャする冠状および軸方向のT2重み付け画像と、座標測定のためのMRI基準を収集します。コロナ画像で、指標が最も大きく、指標の中心を示す画像を見つけます。フィデューシャルの上部から関心のある脳領域までの距離を、内側外側方向と背腹方向の両方でミリメートル単位で記録します。

軸方向の画像で、基準の最上部を示す画像を見つけ、基準の中心の X 座標と Y 座標、および関心のある脳領域の X 座標と Y 座標を記録します。基準の中心から標的の脳領域までの距離を、吻側-尾側と内側-外側の両方の方向で計算します。座標を収集したら、スキャン前の画像を収集します。

この定位固定装置フレームに動物を固定し、MRIベッドからベンチトップFUSセットアップに素早く運びます。麻酔の影響下で動物が眠っていることを確認してください。フレームをフレームホルダーにスライドさせ、所定の位置にしっかりとはめ込みます。

バリカンを使って動物の頭を剃り、余分な毛を払い落とし、頭皮に脱毛クリームを塗ります。3分間放置し、水とガーゼで拭き取ります。MRIガイダンスを使用する場合は、ポインターをアタッチし、ポインターをMRI基準の位置に移動します。

次に、ポインターを MRI 基準 (MRI 画像内のすべての距離が計算されたポイント) の最上部と中心に配置します。ポインターを取り外し、ポジショナーを内側-外側座標と吻側-尾側座標に移動します。ヌルポジションボタンをなめ、上50ボタンを押してポジショナーを持ち上げ、ウォーターバスと超音波ジェルを配置できるようにします。

超音波ジェルを動物の頭皮に塗布し、ポリイミドテープウィンドウをゲルに押し付けて、ゲルに気泡がないことを確認しながら、水浴を動物の上に置きます。ウォーターバスに脱気水を入れます。高出力トランスデューサを使用する場合は、磁石が水面のすぐ上にくるようにポジショナーを下げます。

トランスデューサーをポジショナーに取り付けます トランスデューサーを斜めに水に慎重に下げ、磁石を接続します。ポジショナーを背腹側座標まで下げ、RFパワーアンプをオンにします。3%エバンスブルー染料を1キログラムあたり1ミリリットル、針先をカテーテルプラグに刺して注入します。

動物全体が数秒以内に青くなり、カテーテルが尾静脈に適切に配置されていることを示します。染料を5分間循環させてから、バブルシェーカーでマイクロバブルを激しく振って活性化します。このシリンジを数回反転させてマイクロバブルを均一に分布させ、翼のある注入セットを取り付けて充填します。

シリンジを輸液ポンプに置き、輸液ポンプを1時間あたり6ミリリットルの速度で0.2ミリリットルを供給するように設定し、2分間のFUS曝露でマイクロバブルをゆっくりと注入します。翼のある針をカテーテルプラグに挿入します。まず輸液ポンプを作動させ、3秒待ってから、オンボタンとファンクションジェネレーターを押してFUS治療を開始します。

これを領域ごとに2回繰り返し、間に5分を挟んで、マイクロバブルがクリアされるようにします。関数発生器のオンボタンをもう一度押すと、輸液ポンプが2分で停止したときにFUS治療が停止します。マイクロバブルが解消されるまで5分間待ってから、注入と2回目のFUS治療を開始します。

2回目のFUS治療の直後に、ガドブトロール造影剤と目的の薬剤を注射します。すべての薬剤の総納入量は、キログラムあたり5ミリリットルを超えてはなりません。BBBの開口部を確認するには、動物をMRIベッドのまったく同じ場所に戻し、麻酔ラインを差し込みます。

プレスキャン画像と同じイメージングパラメータでMRIポストスキャンを収集し、BBB開口部の領域でのガドブトロールMRI増強を確認します。このプロトコルは、低電力浸漬トランスデューサと高出力集束超音波トランスデューサの両方を使用して、局所的な血液脳関門の開口部を誘導するために使用されました。まず、低電力浸漬トランスデューサーは、前脳半球または内側脳半球を対象としました。

動物は灌流の有無にかかわらず犠牲にされ、BBBの開口部はエバンスブルー色素の自家蛍光によって視覚化されました。後の実験では、FUSトランスデューサーは海馬または前帯状皮質のいずれかを対象としていました。エバンスブルー色素に加えて、MRI造影剤ガドブトロールを使用して、VIVOでのBBBの標的開口部を確認しました。

動物が犠牲にされた後、エバンスブルー染料の自家蛍光により、開口部の位置が確認されました。この手法が標的遺伝子導入に使用できるかどうかを評価するために、緑色蛍光タンパク質を発現するAAV nineとガドブトロール造影剤を、海馬の血液脳関門が開いた直後に注入しました。動物は、ガドブトロールコントラストで開口部を確認するために画像化されました。

その後、GFP発現により遺伝子導入を確認しました。このプロトコルは、MRIガイド下フォーカス超音波を介した血液脳関門の開口部に対するベンチトップアプローチを提供し、他の研究所が簡単に適応させて、定位手術に代わる非侵襲的なトランスレーショナルな代替手段を提供することができます。