Name: 共焦点顕微鏡による単細胞自然蛍光シグネチャの再構築 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 学ぶ共焦点顕微鏡を用いた単細胞自然蛍光シグネチャ再構築法。細菌・酵母・植物・動物細胞など多様な生体システムに適用可能な非侵襲的解析技術で、細胞集団の表現型異質性を解明し、微生物研究や医療・生態学分野への応用が期待されます。

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本研究は、文部科学省(18K04843)からY.八幡、JST ERATO(JPMJER1502)から野村への科学研究助成によって支えられた。

1. サンプルの調製
<ol><li>グラススライドに、厚さ1mmのシリコーンガスケットとウェルを置きます。</li>
	<li>シリコーンガスケットのウェルに厚さ0.8%(w/v)のアガローススラブを1mm入れる。</li>
	<li>任意の微生物細胞培養物の細胞密度を600 nm(OD660)=1.0の光学密度に希釈します。</li>
	<li>アガローススラブに5μLの細胞懸濁液を置きます。</li>
	<li>ガラスカバースリップでやさしく覆います。</li>
</ol>2. 顕微鏡のセットアップ
注意:CRIF技術は、共焦点反射顕微鏡(CRM)と多チャンネル共焦点顕微鏡を組み合わせたものです。CRMは、細胞の自然な蛍光から独立している細胞形態と空間局在化のための情報源として機能します。多チャンネル共焦点顕微鏡は、細胞の自然蛍光のスペクトル情報を提供します。以下のプロトコルにおいて、CRMまたは共焦点蛍光顕微鏡で取得した任意の画像は、それぞれCRM画像または多チャネル共焦点顕微鏡画像と呼ばれる。
<ol><li>反射スペクトルチャンネルを持つ共焦点顕微鏡を、光増倍管(PMT)またはGaAsP検出器に接続します。 注: これらの設定は、いくつかの製造元から入手できます。</li>
	<li>顕微鏡に十分な倍率を持つ高い数値開口(NA)の目的を装備します。 注: 細菌細胞の解析には、NA &gt; 1.4 の 63x の目的が推奨されます。</li>
	<li>細胞の形態を可視化するために入射光の細胞散乱に依存するCRMに対応するために、半反射ミラー(例えば、NT 80/20)を顕微鏡に装備します。</li>
	<li>多チャンネル共焦点顕微鏡では、顕微鏡に二色性ミラーを装備します。たとえば、405、458、488、488、488、514、543、または633 nmのexの場合は、MBS InVis405、MBS458、MBS458/514、MBS488/543/513、またはMBS 488/543/633ビームスプリッターを使用します。</li>
	<li>レーザーパワーメーターを使用して、励起波長ごとに照明強度を調整します。励起波長を通して一定の顕微鏡の下で出力を保つ(例えば、63xの目的で50 μWを使用)。</li>
</ol>3. 画像取得
<ol><li>顕微鏡ソフトを使用してピンホールサイズを1 AUに設定します。</li>
	<li>各励起波長のピクセルのドウェル時間(すなわち、走査速度)を設定します。 注: ピクセルの長い時間が長すぎると、セルに損傷を与える可能性があります。細胞への光の損傷を最小限に抑えるために、過度に長いピクセルのドウェル時間を避けてください。細菌サンプルの場合、ピクセルドウェルタイム&lt;55.6 μs/μm2 (顕微鏡下での放射出力が〜17μW/cm2の場合)は、通常、増殖阻害を避けるために適しています。このパラメータは、生物や実験の設定によって異なる場合があります。</li>
	<li>スキャンの解像度を設定します。細菌などの小さな細胞の場合は、1,024 x 1,024のスキャンエリアを使用してください。</li>
	<li>対象領域がカバーされるように Z スキャン範囲を設定します。 注:アガローススラブに分布する細菌および酵母細胞サンプルの場合、Zスキャン範囲は通常〜15μmで十分です。</li>
	<li>スキャン解除された検出器を設定して、可視波長範囲(例:416~691 nm)をキャプチャします。8-10 nm のスペクトル ウィンドウを使用します。</li>
	<li>蛍光画像のZスタックを作成するために、長いから最短の励起波長までのシーケンスで多チャンネル共焦点顕微鏡画像を取得します。</li>
	<li>CRMイメージを取得します。</li>
	<li>取得したイメージを 16 ビットの TIFF ファイルとしてディレクトリに保存します。名前付け規則 XXXcYYzZZ を使用してファイルに名前を付けます.tif XXX は励起波長、YY は検出チャネル番号、ZZ は Z スライス番号、"c"と "z" はそれぞれ検出番号と Z スライス番号のプレフィックスです。<ol>
<li>例えば、多チャンネル共焦点顕微鏡画像が励起波長405nmで撮影された場合、検出器アレイの第1検出器チャネル、およびZスタックの第5のスライスである場合、その名前は「405c01z05.tif。CRM イメージの場合は、XXX の代わりに文字列 "CRM" を使用します ("CRMc01z05.tifなど)。 注: 2D または 3D セグメンテーションが画像データに最適かどうかを決定します。小さな細胞が2D平面に拘束される状況(例えば、ガラス表面に付着した細菌集団)で、2Dセグメンテーション法を使用します。細胞集団が3次元空間(例えば、バイオフィルムおよび組織サンプル)に分布している場合、または細胞サイズが光学スライスの厚さ(例えば、酵母細胞、哺乳類細胞)よりも大きい場合には、3Dセグメンテーション法を使用する。2D セグメンテーションについては、セクション 4 を参照してください。3D セグメンテーションについては、セクション 5 を参照してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 2D画像解析
<ol><li>ワークステーションに画像解析ソフトウェア(MATLABなど)を装備します。</li>
	<li>単細胞の自然蛍光シグネチャの細胞のセグメンテーションと再構築を行います。<ol>
<li>画像解析ソフトウェアを開きます。</li>
		<li>表示されているスクリプトの 1 つをダブルクリックして開きます "Script2D.m" 。</li>
		<li>[エディタ] タブに移動し、[実行] をクリックします。フォルダ選択ウィンドウが表示されます。</li>
		<li>ステップ 3.8 で作成したディレクトリを選択し、[ 開く ] をクリックして続行します。セグメンテーション パラメータの入力を求めるダイアログ ボックスが自動的に表示されます。 注: テスト目的で、提供されたデータセット (「Sample_2D」) を選択します。サンプル データセットは圧縮ファイルとして提供され、事前に抽出する必要があります。</li>
		<li>セグメンテーション パラメータを入力します: イメージ 二値化のしきい値 ( 0.45)、 セル領域の上限しきい値 (ピクセル単位) = 200、 セル領域の下限 (ピクセル単位) = 10、 検出器の数 = 32。[ OK] を クリックして続行します。 注: これらのパラメータは、画質に応じて調整が必要な場合があります。</li>
		<li>CRM イメージを表示する新しいイメージ ウィンドウが表示されます。背景の減算に使用する任意の背景領域 (セルが存在しない領域) を選択します。CRM イメージ内の四角形をマウスでドラッグして描画します。選択した領域内をダブルクリックして、選択を確定します。</li>
		<li>手順 4.2.4 で選択した同じディレクトリで Signature という名前の新しいディレクトリを見つけます。 注: 指定されたコードは、このディレクトリを自動的に作成します。「署名」ディレクトリは、一般的な接頭辞「署名」の後に連続して番号が付.pngファイルとして、集団内の各微生物細胞の自然蛍光シグネチャを格納します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5.3D画像解析
<ol><li>ワークステーションに画像解析ソフトウェア(材料表)を装備します。</li>
	<li>単細胞の自然蛍光シグネチャの細胞のセグメンテーションと再構築を行います。<ol>
<li>画像解析ソフトウェアを開きます。</li>
		<li>ダブルクリックして、提供されているスクリプト "Script3D.m" を開きます。</li>
		<li>[エディタ] タブに移動し、[実行] をクリックします。フォルダ選択ウィンドウが表示されます。</li>
		<li>ステップ 3.8 で作成したディレクトリを選択し、[ 開く ] をクリックして続行します。セグメンテーション パラメータの入力を求めるダイアログ ボックスが自動的に表示されます。 注: テスト目的で、提供されたデータセット (「Sample_3D」) を選択します。サンプル データセットは圧縮ファイルとして提供され、事前に抽出する必要があります。</li>
		<li>セグメンテーション パラメータを入力: イメージ 二値化のしきい値 (0 –1) のイメージ の二値化 = 0.01、 セル体積の上限しきい値(ピクセル数)=1,000、セル領域の下限しきい値(ピクセル単位)=20、Xピクセルサイズ[μm/ピクセル]=0.26、Yピクセルサイズ[μm/pixel]=0.26、Zピクセルサイズ[μm/ピクセル]=0.42、検出器数= 32。[OK] をクリックして続行します。励起波長の数の入力を促すダイアログボックスが表示されます。 注: これらのパラメータは、画質に応じて調整が必要な場合があります。</li>
		<li>画像取得に使用する波長数を入力します(例えば、405、488、561、630を使用する場合は、ダイアログボックスに 4 と入力します)。[ OK] をクリックします。</li>
		<li>最短(すなわち、ボックス名: 励起番号1)から最長波長までのシーケンスで励起波長を入力して、ダイアログボックスに入れます。[ OK] を クリックして続行します。CRM イメージを表示する新しいイメージ ウィンドウがポップアップ表示されます。</li>
		<li>背景の減算に使用する任意の背景領域(つまり、セルが存在しない領域)を選択します。CRM イメージ内の四角形をマウスでドラッグして描画します。選択した領域内をダブルクリックして、選択を確定します。</li>
		<li>手順 5.2.4 で選択したディレクトリで 、Signature という名前のディレクトリを見つけます。 注: 指定されたコードは、このディレクトリを自動的に作成します。「署名」ディレクトリは、一般的な接頭辞「署名」の後に連続番号が付いた.pngファイルとして、集団内の各単一の微生物細胞の自然蛍光シグネチャを格納します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 統計分析
注:細胞集団のハイパースペクトルの分布を可視化するために、寸法縮小技術(例えば、主成分分析[PCA])を行います。提供されたスクリプト(PCA.py)は、2つのセル集団(すなわち、2つのクラス)に対してPCAを実行する。
<ol><li>ワークステーションにプログラミング言語と付属のライブラリとモジュールを装備します (資料表)。</li>
	<li>C ドライブ (またはそれと同等) に空のディレクトリを作成し、ディレクトリに 「Parent_directory」という名前を付けます (C:/Parent_ディレクトリ)。</li>
	<li>2つの細胞集団のそれぞれについて、2つの細胞集団の蛍光シグネチャ(例えば、ステップ4.2.7で生成された.pngファイル)を2つの別々のディレクトリに格納します。 注: 2 つのディレクトリは両方とも "Parent_directory" に配置する必要があります。 C:/Parent_directory/ <img alt="image 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img1.jpg">プティダKT2440/ <img alt="image 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img2.jpg"> <img alt="image 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">Signature01.png <img alt="image 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img2.jpg"> <img alt="image 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">シグネチャー02.png <img alt="image 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img2.jpg"> <img alt="image 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">: <img alt="image 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img1.jpg">プティダKT2442/ 
	 <img alt="image 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">Signature01.png 
	 <img alt="image 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">シグネチャー02.png 
	 <img alt="image 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">:</li>
	<li>PCA.py を「Parent_directory」にダウンロードします。</li>
	<li>ワークステーションのコマンド・ライン・インターフェースを開きます。</li>
	<li>コマンドラインインターフェイスに「python C:/Parent_directory/PCA.py」と入力します。</li>
	<li>「対象ディレクトリの選択」というメッセージが表示されたら、「Parent_directory」を選択します。</li>
	<li>「C:/Parent_directory」で、結果として得られるPCAプロットを含む「PCA.png」を見つけます。</li>
</ol>

<ol><li>Monici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+tissue+autofluorescence+research+and+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Annual+Review%22%5BJournal%5D)">Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).</li>
<li>Tang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genomics%22%5BJournal%5D)">Microbial metabolomics.</a> Current Genomics. 12, 391-403 (2011).</li>
<li>Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H., Yuen, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Then+and+now%3A+use+of+16S+rDNA+gene+sequencing+for+bacterial+identification+and+discovery+of+novel+bacteria+in+clinical+microbiology+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories.</a> Clinical Microbiology and Infection. 14, 908-934 (2008).</li>
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<li>Leblanc, L., Dufour, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+identity+of+bacteria+using+their+intrinsic+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Monitoring the identity of bacteria using their intrinsic fluorescence.</a> FEMS Microbiology Letters. 211 (2), 147-153 (2002).</li>
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<li>Yawata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+interspecies+variability+of+single-cell+innate+fluorescence+signature+of+microbial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Intra- and interspecies variability of single-cell innate fluorescence signature of microbial cell.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85, 00608-00619 (2019).</li>
<li>Nelson, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+and+comparative+analysis+of+the+metabolically+versatile+Pseudomonas+putida+KT2440%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440.</a> Environmental Microbiology. 4 (12), 799-808 (2002).</li>
<li>Bagdasarian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific-purpose+plasmid+cloning+vectors.+II.+Broad+host+range%2C+high+copy+number%2C+RSF1010-derived+vectors%2C+and+a+host-vector+system+for+gene+cloning+in+Pseudomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas.</a> Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).</li>
<li>Luo, Y., Vijaychander, S., Stile, J., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+analysis+of+DNA-binding+proteins+by+yeast+one-hybrid+and+one-two-hybrid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Cloning and analysis of DNA-binding proteins by yeast one-hybrid and one-two-hybrid systems.</a> Biotechniques. 20 (4), 564-568 (1996).</li>
<li>Yawata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+biofilm+development+in+a+microfluidic+device+using+modified+confocal+reflection+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Monitoring biofilm development in a microfluidic device using modified confocal reflection microscopy.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 110 (3), 377-380 (2010).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy.+Third+edition%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third edition</a>. , Springer. Germany. (2006).</li>
<li>Blacker, T. S., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+mitochondrial+redox+state+using+NADH+and+NADPH+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence.</a> Free Radical Biology & Medicine. 100, 53-65 (2016).</li>
<li>Croce, A. C., Bottiroli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+spectroscopy+and+imaging%3A+A+tool+for+biomedical+research+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis.</a> European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2461(2014).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

再現性のある結果を得るために密接に従う必要があるこの方法の2つの重要なポイントがあります:1)励起波長と実験を通じて顕微鏡目的の下でレーザー出力を一貫して保ち、2)正確な細胞セグメンテーションを行います。
最初の点は、異なる実験間で自然蛍光シグネチャを比較する際に特に重要です。最大出力出力はレーザーライン間で大きさが大きく異なる場合があるため、励起波長に同じ「パーセント出力」設定を適用しないようにしてください(すなわち、405、488、514、および530 nmのレーザーラインのすべてに対して5%の出力を使用します)。さらに、目的と内部光学は、通常、不均一な光学吸収特性を有し、また考慮する必要がある。これらの理由から、実際にレーザーパワーメータ(材料表)を使用して目的の出力を測定することをお勧めします。この測定は、レーザーラインからの出力が数年にわたって著しく減衰する可能性があるため、数回の実験、または定期的に行うことをお勧めします。
第2の点は、正確な細胞セグメンテーション、内または種間変動...

セル1内の多様な生体分子は自己蛍光シグナルを放出し、細胞の自然蛍光シグネチャはこれらのシグナルの集合体から成る。このシグネチャー蛍光は、様々な細胞特性および生理学的状態の違いを反映しています。自然な蛍光の分析は、低侵襲であり、完全な細胞破壊に軽度の代謝修飾から痕跡の範囲を残す伝統的な、より侵襲的な微生物学的プローブを補完することができます。DNAや細胞内容抽出2,3、蛍光インストハイブリゼーション4、および蛍光レポーター遺伝子のゲノムへの導入は、細胞の種類や生理学的状態の決定に有効であるが、一般的には細胞の操作または侵襲的なタグ付けのいずれかが必要である。
バルク微生物培養懸濁液5,6、活性汚泥7、哺乳動物組織8,9、および哺乳動物細胞1,10を含む様々な生きた微生物コロニーの自然な蛍光の研究は、自然な蛍光分析が細胞型および生理学的状態のタグフリー分析を促進することを示した。自然蛍光シグネチャは、従来、単細胞レベルではなく集団レベルで分析されてきたため、クローン培養が必要です。これに対し、このコンフォーカル・レンレクシス法は、コンフォーカル・レンレクシス法を支援する単細胞中華離性の分析(CRIF)技術111を、個々の生きた微生物細胞の自然な細胞蛍光シグネチャを再構成およびカタログ化する。さらに、CRIFは、3次元(3D)空間に分布する集団内の単一の微生物細胞の自然蛍光シグネチャを体系的に照合することができます。

<table><tbody><tr><td>アガロース</td><td>和光化学</td><td>312-01193</td><td></td></tr><tr><td>ビームスプリッター</td><td>カールツァイス、ニコン</td><td></td><td>MBSInVis405、MBS458、MBS488、MBS488/514、MBS488/543、MBS 488/543/633 ビームスプリッター (カールツァイス)</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>カールツァイス、ニコン</td><td></td><td>LSM 880 (カールツァイス)、A1R (ニコン)</td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>松波ガラス</td><td>C024601</td><td></td></tr><tr><td>スライドガラス</td><td>松波ガラス</td><td>S011120</td><td></td></tr><tr><td>半反射鏡</td><td>カールツァイス、ニコン</td><td></td><td>NT80/20</td></tr><tr><td>レーザーパワーメーター</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>PM400(パワーメーターコンソール)・S175C(センサー)</td></tr><tr><td>LB ブロス</td><td>ナカライ テスク</td><td>20066-95</td><td>細菌培養用</td></tr><tr><td>画像解析ソフト</td><td>The MathWorks</td><td></td><td>MATLAB バージョン 2019a 以降、Image Processing Toolbox が必要です</td></tr><tr><td>顕微鏡対物レンズ</td><td>Carl Zeiss, Nikon</td><td>440762-9904</td><td>eg. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss)</td></tr><tr><td>顕微鏡ソフトウェア</td><td>Carl Zeiss, Nikon</td><td></td><td>ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon)</td></tr><tr><td>PBS(-)</td><td>和光化学工業</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>プログラミング言語</td><td></td><td></td><td>Pythonとライブラリ、モジュール(numpy、scikit-learn、scikit-image、os、glob、matplotlib、tkinter)は、提供されたPCAスクリプトを実行するために必要とされます。</td></tr><tr><td>シリコンガスケット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P24744</td><td></td></tr><tr><td>ワークステーション</td><td></td><td></td><td>ディスクリートGPUを搭載した高性能ワークステーションをお勧めします。</td></tr><tr><td>酵母エキス-ペプトン-デキストロース(YPD)寒天培地</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1500-250G</td><td>酵母培養</td></tr><tr><td>用YPD培地</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1375-250G</td><td></td></tr></tbody></table>

共焦点顕微鏡による単細胞自然蛍光シグネチャの再構築

Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

ここで説明するのは、共焦点反射顕微鏡支援単一細胞自然蛍光分析(CRIF)であり、3次元(3D)空間に分布する集団内の各個体の生細胞からの自然な細胞蛍光シグネチャを再構築するための低侵襲的な方法である。細胞の自然蛍光シグネチャは、細胞内の様々な生体分子によって放出される蛍光シグナルの集合体です。これまでの研究では、自然蛍光シグネチャは、様々な細胞特性と生理学的状態の違いを反映し、細胞の特性評価と同定のための豊富な情報源であることを確立しました。自然蛍光シグネチャは、伝統的に母集団レベルで分析されてきたが、単細胞レベルではクローン培養を必要としない。CRIFは、個々の細胞からの蛍光シグナルの3D分解能および/または選択的抽出を必要とする研究に特に適しています。蛍光シグネチャは細胞の自然な性質であるため、CRIFは、無傷および単一細胞のタイプおよび/または生理学的状態のタグフリー予測にも適しています。この方法は、異種集団における各単一細胞の表現型を、細胞タグ付けなしで顕微鏡下で自己蛍光シグネチャによって直接評価することができる、合理化された細胞分析のための強力なツールであり得る。

図1Aは 、従来のスペクトルプロット(上)およびヒートマップ(中央)として提示される細菌細胞の典型的な単細胞蛍光シグネチャを示す。 図1B は、土壌細菌の集団の元のCRM画像に重ね合わせた正確な2D細胞セグメンテーションの結果を示す(シュードモナスプチダ KT2440)12。結果として生じる母集団の自然蛍光シグネチャは 、図1Dのヒートマップとして提示される。なお、細胞のセグメント化が成功した後、母集団内変動は比較的軽微であった。 図1Bに示すように、P .プチダ の同じ集団に重ね合わされる、不正確な細胞セグメンテーションの例を 図1Cに示す。不正確な細胞セグメンテーションが母集団の自然蛍光シグネチャに及ぼす影響は、かなりの数の外れ値から容易に明らかである(<...

ここでは、3次元空間に分布する全ての個々の生細胞から自然な細胞蛍光シグネチャ(すなわち細胞自家蛍光)を光学的に抽出およびカタログするためのプロトコルが提示される。この方法は、細菌、真菌、酵母、植物、および動物からの細胞を含む単一細胞分解能で、多様な生物学的系の自然蛍光シグネチャを研究するのに適しています。

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

この技術は、侵襲的なタグ付けを必要とせずに、単一細胞レベルで細胞の同一性または生理学的特性を証明するための独自の研究を提供します。この手法の主な利点は、解析のシングルセルレベルの空間分解能を容易にすることと、バックグラウンドプロセスと区別できることです。したがって、この技術は、病原性微生物の同定と表現型解析に貢献できる可能性があります。この手法は、表現型の不均一性の研究、または関心のある微生物集団の生理学的状態のモニタリングにも適用できます。その手順を実演していただくのは、私の研究室の高部恭介助教です。共焦点反射顕微鏡とマルチチャンネル共焦点顕微分光法のセットアップ。デスキャンされたスペクトルチャンネルを備えた共焦点顕微鏡を光電子増倍管に接続します。顕微鏡に高開口数対物レンズを装備し、適切な倍率で対応します。また、顕微鏡に半反射ミラーを装備して、入射光の細胞散乱に依存して細胞の形態を視覚化する共焦点反射顕微鏡に対応します。マルチチャンネル共焦点顕微分光法の場合は、顕微鏡にダイクロイックミラーを装備し、レーザーパワーメーターを使用して各励起波長の照明強度を調整します。次に、顕微鏡下での出力を励起波長を通じて一定に設定します。顕微鏡で細菌を画像化するには、顕微鏡ソフトウェアでピンホールサイズを1.0面積単位に設定し、各励起波長のピクセル滞留時間を設定します。スキャン解像度を設定します。細菌などの小さな細胞の場合は、1024 x 1024のスキャン領域を使用します。関心領域がカバーされるようにZスキャン範囲を設定します。また、8〜10ナノメートルのスペクトルウィンドウを使用して、D-Scan検出器を可視波長範囲をキャプチャするように設定します。次に、マルチチャンネル共焦点顕微分光法画像を最長励起波長から最短励起波長の順に取得して、蛍光画像と共焦点反射顕微鏡画像のZスタックを作成し、画像を16ビットtiff形式で保存します。細胞セグメンテーションおよび単一細胞の自然蛍光シグネチャの再構築を行うには、適切な画像解析ソフトウェアプログラムを開き、提供されているスクリプトのいずれかをダブルクリックして開きます。エディタタブで、「実行」をクリックします。フォルダ選択ウィンドウが表示されます。Z-Stack イメージが保存されたディレクトリを選択し、[開く] をクリックします。セグメンテーションパラメータの入力を求めるダイアログボックスが自動的に表示されます。画像の二値化のしきい値を 0-1 に、画像の二値化を 0.45 に、セル領域の上限しきい値を 200 に、セル領域の下限しきい値を 10 に、検出器の数を 32 に設定します。励起波長の数の入力を求めるダイアログボックスが表示されます。画像取得に使用する波長の数を入力し、[OK]をクリックします。励起波長の入力を要求するダイアログボックスが表示されます。励起波長を最短から最長の順に入力し、[OK]をクリックします。共焦点反射顕微鏡画像を表示する新しい画像ウィンドウが表示されます。背景の減算に使用する任意の背景領域を選択し、共焦点反射顕微鏡画像内に長方形を描きます。選択した領域内をダブルクリックして選択を確認し、signatureという名前の新しいディレクトリを見つけます。次元削減手法を実行するには、空のディレクトリを作成し、ディレクトリに parent_directory という名前を付けます。2つの細胞集団のそれぞれの蛍光シグネチャを2つの別々のディレクトリに保存し、ワークステーションのコマンドラインインターフェースを開きます。コマンドを入力します。「対象ディレクトリの選択」が表示されたら、parent_directoryを選択します。次に、parent_directory フォルダーで PCA を見つけます。PNGファイル: これには、結果の主成分分析プロットが含まれます。ここでは、細菌細胞の典型的な単一細胞蛍光シグネチャを、従来のスペクトルプロットおよびヒートマップとして示しています。この図では、土壌細菌の集団の元の共焦点反射顕微鏡画像に重ね合わせた不正確な2D細胞セグメンテーションが観察できます。その結果、人口の自然蛍光シグネチャがヒートマップとして提示されます。細胞分節が成功した後、集団内の変動は比較的小さかったことに注意してください。ここでは、不正確な細胞分節の例を、前に示したのと同じP.putidaの集団に重ねて示しています。不正確な細胞分節が集団の自然蛍光シグネチャに与える影響は、対応するヒートマップで観察されたかなりの数の外れ値から容易に明らかです。不正確な細胞セグメンテーションは、正確な細胞セグメンテーション後に得られたタイプのクラスターと比較して、主成分分析後のクラスターが緩くなります。個々の細菌株内で観察される自然蛍光シグネチャのわずかな変動にもかかわらず、各集団は主成分分析プロット上で異なるクラスターを形成します。この図では、出芽酵母Saccharomyces cerevisiae YM4271の集団の元の共焦点反射顕微鏡画像に重ね合わせた不正確な3D細胞分節が観察できる。外れ値がなく、その結果として集団の生来の蛍光シグネチャーが見られることに注意してください。共焦点顕微鏡でできるだけクリーンな画像を取得し、ノイズがその後の分析の精度を損なう可能性があるため、信号強度の飽和を回避することが不可欠です。分類タスクや予測タスクで使用するために、生来の Western シグネチャ データセットを使用して機械学習モデルをトレーニングし、タグフリーの母集団分析と表現型予測を提供できます。

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JoVE Journal

Biology

生物学

私たちは、細胞内の複数の種類の蛍光標識分子を同時にイメージングするための蛍光光活性化局在化顕微鏡(FPALM)の使用を実証します。記載されている技術は、単一細胞内で数十ナノメートルの精度で、数千から数十万の個々の蛍光標識タンパク質の局在をもたらします。...

蛍光光活性化局在顕微鏡による生体構造の同時マルチカラーイメージング

造血幹細胞および前駆細胞のマーキングコンビナトリアル5蛍光タンパク質は、再生中に、骨髄の造血アーキテクチャへの洞察を提供し、共焦点および2光子顕微鏡を経由して、生体内のクローン追跡になります。この方法は、移植後の時間の大規模な期間、無傷の組織におけるスペクトル的にコード化されたHSPCs由来細胞の非侵襲的な運命のマッピングが可能になります。...

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

このプロトコルは、全反射蛍光顕微鏡を使用して、生細胞の表面上の単一の受容体を視覚化し、追跡し、それによって受容体の横方向の移動性、受容体複合体のサイズを分析し、一過性の受容体-受容体相互作用を視覚化する方法を説明しています。このプロトコールは、他の膜タンパク質に拡張することができます。...

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

生体内の生体分子の研究は、生物学的な文脈における分子機能を理解するために非常に重要です。ここでは、DNAやタンパク質などの蛍光生体分子を生きた微生物に取り込むことができる新しい方法について説明します。蛍光顕微鏡で記録されたin...

エレクトロポ生きた微生物で内在化および蛍光生体分子の観測

本稿では、可視化し、細胞内コンパートメントのローカライズされた翻訳イベントを定量化する方法について説明します。本稿で提案する手法は基本的な共焦点イメージング...

グローバルを測定する定量的蛍光ローカライズ翻訳

このプロトコルでは、蛍光共鳴エネルギー移動し、蛍光寿命イメージングに基づく SNARE...

蛍光寿命イメージングによる細胞内のスネアを可視化

ターゲット細胞表面受容体に結合する抗体は、コンフォメーションとクラスタ リングの変化を与えることができます。これらの動的な変更には、標的細胞で医薬品開発を特徴付けるための含意があります。このプロトコルは、共焦点顕微鏡、細胞表面の受容体の程度を定量化する...

共焦点顕微鏡を明らかに細胞表面受容体画像相関分光法による凝集

Efferocytosis、アポトーシス細胞の貪食除去は恒常性を維持するために必要な受容体と認識、キャニスター、アポトーシス細胞の内面化を可能にするシグナル伝達経路によって促進されます。ここで、efferocytosis の定量化と efferocytic シグナル伝達経路の活性の蛍光顕微鏡のプロトコルを提案する.

単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化

生細胞の形質膜におけるリガンド結合によって誘導されるmEGFPタグ付き受容体オリゴマーの平均オリゴマー状態の測定のためのイメージングアプローチについて説明する。このプロトコルは、数と明るさ(N&amp;B)分析と組み合わせた全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡に基づいています。...

数と明るさの分析と組み合わせた全内部反射蛍光顕微鏡による生細胞における細胞表面受容体のオリゴマー化ダイナミクス

スペクトル共焦点顕微鏡を使用したハイプレックスイメージングにより、非特異的組織蛍光を最小化

このプロトコルは、高解像度のセルラーおよびサブセルラー画像診断のための、多重アレイ検出器と統合されたレーザー走査共焦点顕微鏡システムの高度なイメージングアプリケーションおよび共有リソース管理について詳述しています。このワークフローにより、共焦点から超分解能(~120nm)までのマルチモーダルイメージングが単一のプラットフォーム内で可能となり、ナノスケールの可視化をより容易にします。...

超分解能イメージングと共有管理:多重検出を伴う共焦点顕微鏡のプロトコル

学ぶ共焦点顕微鏡を用いた単細胞自然蛍光シグネチャ再構築法。細菌・酵母・植物・動物細胞など多様な生体システムに適用可能な非侵襲的解析技術で、細胞集団の表現型異質性を解明し、微生物研究や医療・生態学分野への応用が期待されます。

共焦点顕微鏡による単細胞自然蛍光シグネチャの再構築

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