チオバルビツール酸反応性物質アッセイを用いた生体試料における酸化ストレスの評価
2020年5月12日
チオバルビト尿酸反応性物質アッセイの目的は、532nmの可視波長分光光度測定を用いて、脂質過酸化生成物、主にマロンジアルデヒドの生産を測定することによって生体試料中の酸化ストレスを評価することです。ここで説明する方法は、ヒト血清、細胞ライセート、および低密度リポタンパク質に適用することができる。
したがって、TBARSアッセイは、生物学的サンプルの酸化ストレスの実験室内での一般的な評価に最適であり、保存および処理されたサンプル間で相対的なTBARSレベルを直接比較します。これらのアッセイは、市販のキットが約400サンプルであるのに対し、96サンプルの試験に約3コストと非常に安価で、1バッチのサンプルしか分析できません。ここで説明する方法は、生物試料の安定性研究、および分析前に酸化防止剤または他の種類のサンプル保存剤を添加することが適切または義務付けられているものを含む特定のアプリケーションにさらに適合させることができます。
結果が大きく変動することを避けるために、新しい試薬を準備し、カラー試薬のpHが4を超えていないことを確認し、吸光度を測定する前にニデーゼ膨潤プレートの気泡を取り除きます。チオバルビツール酸の0.8%水溶液を調製することから始めます。4グラムの水酸化ナトリウムビーズを20ミリリットルの水に溶解することにより、5モルの水酸化ナトリウム溶液を調製します。
溶液をプラスチック容器に保管します。バッチごとに作りたてのものでなければなりません。450ミリリットルの脱イオン水に4グラムのチオバルビツール酸を加え、マグネティックスターバーを使用して穏やかに溶解します。
約4ミリリットルの水酸化ナトリウム溶液を100マイクロリットル刻みでゆっくりと加え、チオバルビツール酸粒子が溶解するpHを確認します。.すべての粒子が溶解するまで、水酸化ナトリウムを加え続けます。溶液のpHがpHストリップで4以下であることを確認し、次に脱イオン水で最終容量を500ミリリットルにし、チオバルビツール酸水溶液を室温で保存します。
MDA ビスジメチルアセタール標準曲線溶液を 2 ミリリットルのスナップキャップポリプロピレンチューブで調製します。テキスト原稿に記載されているように、200マイクロモルのストック溶液を水で希釈します。サンプルをボルテックスします。
分析するサンプルのガラス管にラベルを付け、準備したサンプルを各チューブに100マイクロリットル追加します。各サンプルに200マイクロリットルの8.1%SDSを加え、ガラス管を円を描くように静かに渦巻いて混合します。各サンプルに1.5ミリリットルの3.5モル酢酸ナトリウム緩衝液を加え、次に1.5ミリリットルの0.8%チオバルビツール酸水溶液を追加します。
700マイクロリットルの脱イオン水を追加して、各チューブのファイナルを4ミリリットルにします。ガラス管をしっかりと蓋をし、摂氏95度に設定された加熱ブロックで1時間インキュベートします。結露を防ぐためにチューブをアルミホイルで覆い、ブロックからチューブを取り外して氷上で30分間インキュベー
トします。インキュベーション後、サンプルと標準試料を1,500倍Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。各チューブから150マイクロリットルの上清を96ウェルプレートのウェルに移し、ピペットチップで気泡を取り除きます。532ナノメートルでサンプルの吸光度を測定し、他のすべての吸収剤の読み取り値からブランクサンプルの平均吸収剤の読み取り値を差し引きます。
標準曲線を作成し、それを使用して未知のサンプル濃度を計算します。MDA bis ジメチルアセトール標準曲線を作製し、3 つの異なる生体サンプルにおけるアッセイの検出限界と感度、および酸化レベルを決定しました。合計9つのTBARSアッセイを3つのサンプルで異なる日に実施しました。
検出限界を決定するために、ブランクサンプルの吸光度を3つの異なる日に測定しました。検出可能な非ノイズ吸収性シグナルを出すために必要なTBARS物質の最小濃度は1.1マイクロモルです。また、アッセイの感度は、濃度の増加マイクロモルあたり約0.0016吸収剤単位です。
TBARSアッセイは、さまざまな生物学的マトリックスの脂質過酸化の変化を検出するために使用できます。この2つの塩化銅を実証するために、ヒト血清HEPG2細胞ライセートおよび低密度リポタンパク質のinvitro酸化を誘導するために使用しました。EDTAを含むLDLサンプルに対してTBARSアッセイを実施し、銅、処理済み、未処理のLDLサンプル間でTBARSのレベルは変化しませんでした。
しかし、スピンろ過によりEDTAを除去した後、LDLは銅2媒介酸化を受けました。ヒト血清中のTBARSアッセイのダイナミックレンジを示すために、2ミリモル銅2イオンの濃度をサンプルに添加したところ、TBARSが6〜7倍に増加しました。このプロトコールを試みるときは、サンプルを氷上に10分以上放置せず、遠心分離後は室温で放置してください。
もともと収集、処理、および一緒に保存されなかった生物試料のバッチまたはサブセットについては、バッチ効果のデータを統計的に評価して、人工的な酸化が結果に寄与しなかったことを確認する必要があります。低密度リポタンパク質からの意図的な定量化可能な体外酸化により、酸化がその機能生物学にどのように影響するかを理解することができます。
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概要
チオバルビツール酸反応性物質（TBARS）アッセイは、生物学的サンプルの脂質過酸化物を測定することで酸化ストレスを評価する費用対効果の高い方法です。この方法は、一緒に処理されたサンプルの相対的なTBARSレベルを比較するのに特に有用です。
主要な研究要素
科学の分野
- 生化学
- 酸化ストレス評価
- 分析化学
背景
- TBARSアッセイは、酸化ストレスの指標としてマロンジアルデヒドを測定します。
- 人間の血清や細胞溶解物を含む様々な生物学的サンプルに適用できます。
- このアッセイは市販キットに比べて低コストです。
- 新鮮な試薬と特定のpH条件は正確な結果に不可欠です。
研究目的
- 酸化ストレスを評価する信頼性の高い方法を提供すること。
- 同様の条件下で処理されたサンプル間のTBARSレベルの比較を可能にすること。
- 安定性研究を含む特定の応用のために方法を適応させること。
使用される方法
- チオバルビツール酸の0.8%水溶液の調製。
- 5モル塩化ナトリウム水溶液の調製。
- 可視光波長分光光度法を用いた532 nmでの吸光度の測定。
- 試薬が新鮮であることとpHが4以下であることを確認。
主な結果
- TBARSアッセイは酸化ストレスレベルの直接的な比較を提供します。
- 費用対効果の高いテストにより、複数のサンプルの分析が可能。
- 様々な生物学的応用に適応可能。
- 新鮮な試薬は結果の変動を最小限に抑えます。
結論
- TBARSアッセイは酸化ストレスを評価する価値あるツールです。
- 市販の代替品に比べて大幅なコスト削減を提供します。
- 適切な準備と取り扱いは信頼できる結果に不可欠です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
The TBARS assay provides a cost-effective, intra-laboratory method for relative oxidative stress assessment in biological samples, supporting early discovery workflows where comparative lipid peroxidation data informs target validation and mechanistic de-risking. Its low cost and adaptability enable reproducible screening of compound effects across sample sets, reducing false positives in lead identification. Proper reagent handling and pH control ensure data reliability for go/no-go decisions in preclinical prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying lipid peroxidation changes in response to compound treatment.
- Operational Value: Supports pathway clarification through comparative TBARS levels in disease-relevant systems like human serum and cell lysates.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking by identifying compounds that modulate oxidative stress pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation by establishing baseline oxidative stress metrics.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through fresh reagent preparation and pH ≤4 control.
- Scalability Value: Enables high-throughput screening readiness with 96-sample processing at ~$3 per batch.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease relevance through detectable TBARS changes in LDL oxidation models upon EDTA removal.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment by quantifying invitro oxidation effects on lipoprotein function.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions via dose-responsive TBARS increases (e.g., 6-7 fold with 2 mM Cu²⁺ in serum).
Pipeline & Workflow Integration
The TBARS assay fits within the discovery continuum from early hypothesis testing to lead identification, providing oxidative stress readouts that help prioritize compounds before preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring lipid peroxidation as a functional readout of pathway modulation.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, low-cost processing of biospecimens stored and processed together.
- Analytics: Generates quantitative absorbance measurements at 532 nm, enabling LOD of 1.1 µM and sensitivity of 0.0016 AU/µM for condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling LDL oxidation to understand functional biological impacts.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for batch-wise oxidative stress assessment across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct comparison of oxidative stress levels.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via fresh reagent preparation and controlled incubation (95°C, 1 hr).
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in lipid peroxidation pathways.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization via detection of concentration-dependent TBARS changes in biological matrices.
Implementation Considerations
- Requires expertise in reagent preparation, pH control, and spectrophotometric measurement.
- Needs heating block (95°C), centrifuge, and visible wavelength spectrophotometer.
- Demands cross-team standardization of sample storage and processing to avoid batch effects.
- Requires adaptation considerations for biospecimens with antioxidants or preservatives.
- Limited to relative comparisons; absolute quantification requires MDA-bis-acetal standard curves.
