Name: クロマチン免疫沈降-エキソヌクレアーゼ(ChIP-Exo)を用いたマウス幹細胞由来ニューロンにおけるタンパク質-DNA相互作用の高分解能マッピング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 学ぶChIP-Exo法によるマウス幹細胞由来ニューロンのタンパク質-DNA相互作用の高分解能マッピング。エキソヌクレアーゼ処理と高通量シーケンスにより、塩基対レベルの分解能で遺伝子制御メカニズムを解明する手法です。

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未発表のデータや貴重な議論を共有してくれたRhee研究所のメンバーに感謝します。この研究は、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)がRGPIN-2018-06404(H.R.)を助成金で支えました。

<ol><li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
<li>Patten, D. K., Corleone, G., Magnani, L. Epigenome Editing: Methods and Protocols. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPatten%2C+DK+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. A, J. eltsch, Rots, M. G. 1767, 271-288 (2018).</li>
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<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-exo+method+for+identifying+genomic+location+of+DNA-binding+proteins+with+near-single-nucleotide+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy.</a> Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 21, 21-24 (2012).</li>
<li>Starick, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-exo+signal+associated+with+DNA-binding+motifs+provides+insight+into+the+genomic+binding+of+the+glucocorticoid+receptor+and+cooperating+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-exo signal associated with DNA-binding motifs provides insight into the genomic binding of the glucocorticoid receptor and cooperating transcription factors.</a> Genome Research. 25 (6), 825-835 (2015).</li>
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<li>Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L. Y., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnucleosomal+Structures+and+Nucleosome+Asymmetry+across+a+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subnucleosomal Structures and Nucleosome Asymmetry across a Genome.</a> Cell. 159 (6), 1377-1388 (2014).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+structure+and+organization+of+eukaryotic+pre-initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes.</a> Nature. 483 (7389), 295-301 (2012).</li>
<li>Zhou, X. F., Yan, Q., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+regulon+of+a+GntR+family+regulator+via+transcriptome+and+ChIP-exo+analyses+and+its+contribution+to+virulence+in+Xanthomonas+citri%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the regulon of a GntR family regulator via transcriptome and ChIP-exo analyses and its contribution to virulence in Xanthomonas citri.</a> Molecular Plant Pathology. 18 (2), 249-262 (2017).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+assessment+of+transcriptional+regulation+on+central+carbon+metabolism+by+Cra+and+CRP%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Systems assessment of transcriptional regulation on central carbon metabolism by Cra and CRP.</a> Nucleic Acids Research. 46 (6), 2901-2917 (2018).</li>
<li>Niu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+binding+interactions+of+mouse+and+human+constitutive+androstane+receptors+reveal+novel+gene+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide binding interactions of mouse and human constitutive androstane receptors reveal novel gene targets.</a> Nucleic Acids Research. 46 (16), 8385-8403 (2018).</li>
<li>Uuskula-Reimand, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+II+beta+interacts+with+cohesin+and+CTCF+at+topological+domain+borders%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase II beta interacts with cohesin and CTCF at topological domain borders.</a> Genome Biology. 17, (2016).</li>
<li>Rhee, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Terminal+Effector+Genes+in+Mammalian+Neurons+Is+Maintained+by+a+Dynamic+Relay+of+Transient+Enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Expression of Terminal Effector Genes in Mammalian Neurons Is Maintained by a Dynamic Relay of Transient Enhancers.</a> Neuron. 92 (6), 1252-1265 (2016).</li>
<li>Pugh, B. F., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Organization+of+Human+Transcription+Initiation+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes.</a> Plos One. 11 (2), (2016).</li>
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<li>McHaourab, Z. F., Perreault, A. A., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+and+ChIP-exo+profiling+of+Pol+II%2C+H2A.Z%2C+and+H3K4me3+in+human+K562+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq and ChIP-exo profiling of Pol II, H2A.Z, and H3K4me3 in human K562 cells.</a> Scientific Data. 5, 180030(2018).</li>
<li>Perreault, A. A., Sprunger, D. M., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+and+transcriptional+profiling+of+triple+negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Epigenetic and transcriptional profiling of triple negative breast cancer.</a> Scientific Data. 6, 190033(2019).</li>
<li>Rossi, M. J., Lai, W. K. M., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+ChIP-exo+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Simplified ChIP-exo assays.</a> Nature Communications. 9 (1), 2842(2018).</li>
<li>Perreault, A. A., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ChIP-exo+Method%3A+Identifying+Protein-DNA+Interactions+with+Near+Base+Pair+Precision%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li>
<li>Jezek, M., Jacques, A., Jaiswal, D., Green, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Immunoprecipitation+%28ChIP%29+of+Histone+Modifications+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).</li>
<li>Terranova, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Integrated+Platform+for+Genome-wide+Mapping+of+Chromatin+States+Using+High-throughput+ChIP-sequencing+in+Tumor+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).</li>
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<li>Yamada, N., Lai, W. K. M., Farrell, N., Pugh, B. F., Mahony, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+protein-DNA+binding+event+subtypes+in+ChIP-exo+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Characterizing protein-DNA binding event subtypes in ChIP-exo data.</a> Bioinformatics. 35 (6), 903-913 (2019).</li>
<li>Yen, K., Vinayachandran, V., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWR-C+and+INO80+chromatin+remodelers+recognize+nucleosome-free+regions+near+%2B1+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SWR-C and INO80 chromatin remodelers recognize nucleosome-free regions near +1 nucleosomes.</a> Cell. 154 (6), 1246-1256 (2013).</li>
<li>Vinayachandran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+and+precise+reprogramming+of+yeast+protein-genome+interactions+in+response+to+heat+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Widespread and precise reprogramming of yeast protein-genome interactions in response to heat shock.</a> Genome Research. , (2018).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルでは、ChIPに続いてエキソヌクレアーゼ消化を行い、超高マッピング解像度で哺乳類細胞におけるタンパク質とDNA相互作用を同定するためのDNAライブラリーを取得する。多くの変数は、ChIP-exo実験の品質に寄与します。重要な実験パラメータには、抗体の品質、超音波処理の最適化、およびLM-PCRサイクルの数が含まれます。これらの重要な実験パラメータは、ChIP-exo実験を制限する可能性もあり、以下で説明する。
どのChIPプロトコルでも、抗体の品質は最も重要な考慮事項の1つです。ChIP-exoには、ChIPグレードの抗体を使用することを推奨します。抗体の品質は、ChIP-exo プロトコルを実施する前に確認できます。ChIP-seqまたはChIP-qPCRは、対象となるタンパク質の特異的DNA結合位置を確認することによって、ChIPグレードの抗体を検証するために使用することができる。続いて、ビーズに添加する抗体の濃度を最適化することは、タンパク質−DNA複合体が免疫沈降22,23<sup clas...

タンパク質とDNA相互作用の場所は、遺伝子調節のメカニズムに関する洞察を提供します。クロマチン免疫沈降とハイスループットシーケンシング(ChIP-seq)を組み合わせると、1,2の生細胞におけるゲノム全体のタンパク質とDNAの相互作用を調べるために10年間使用されてきた。しかし、ChIP-seq法は、低マッピング分解能、誤検出、不在着信、および非特異的バックグラウンド信号につながるDNA断片化および非結合DNA汚染における不均一性によって制限されています。ChIPとエキソヌクレアーゼ消化(ChIP-exo)の組み合わせは、ChIP DNAをタンパク質-DNA架橋点にトリミングすることにより、ChIP-seq法を改善し、ベースペアの分解能に近い分解能と低バックグラウンド信号3、4、5を提供する。ChIP-exoによって提供される大幅に改善されたマッピング分解能および低い背景はゲノム全体で決定される正確で、広範囲な蛋白質DNA結合の場所を可能にする。ChIP-exoは、機能的に異なるDNA結合モチーフ、転写因子(TF)との協調的相互作用、および特定のゲノム結合位置における複数のタンパク質−DNA架橋部位を明らかにすることができ、他のゲノムマッピング方法3、4、6、7では検出できない。
ChIP-exoは、最初は出芽酵母で使用され、TFの配列特異的DNA結合を調べ、転写開始前複合体の正確な組織を研究し、またゲノム4、8、9を横切る個々のヒストンの核下構造を研究した。2011年4月に導入されて以来、細菌、マウス、ヒト細胞7、10、11、12、13、14、15、16、17など、他の多くの生物に利用されています。2016年、Rhee et al.14は哺乳類ニューロンで初めてChIP-exoを使用して、別のプログラミングTF Isl1とヘテロダイマー複合体を形成するプログラミングTF Lhx3のダウンレギュレーション後にニューロン遺伝子発現がどのように維持されたかを理解した。この研究は、Lhx3がない場合、Isl1がニューロンエフェクター遺伝子の遺伝子発現を維持するためにOnecut1 TFによって結合された新しいニューロンエンハンサーに募集されることを示した。本研究では、複数のTFが、ほぼヌクレオチドマッピング分解能で、細胞型および細胞ステージ特異的DNA調節要素を組み合わせで動的に認識する方法を明らかにした。他の研究はまた、他の哺乳類細胞株におけるタンパク質とDNAの相互作用を理解するためにChIP-exo法を使用した。Han et al.7は、ChIP-exo を使用して、マウスエリスロイド細胞における GATA1 および TAL1 TF のゲノムワイド組織を調べるために、ChIP-exo を用いた。この研究では、TAL1はエリスロイド分化を通じてGATA1とタンパク質タンパク質相互作用を介して間接的ではなくDNAに直接リクルートされることを発見した。最近の研究はまた、ヒト細胞株18、19におけるエピゲノムおよび転写機構を研究するためにCTCF、RNAポリメラーゼII、およびヒストンマークのゲノムワイド結合位置をプロファイリングするためにChIP-exoを用いた。
ChIP-exoプロトコルには、3、5、20のバージョンが用意されています。しかし、これらのChIP-exoプロトコルは、次世代シーケンシングライブラリの準備に精通していない研究では従うのが難しいです。ChIP-exo プロトコルの優れたバージョンは、簡単に従う手順とビデオ21で公開されましたが、完了するまでにかなりの時間を要する多くの酵素的ステップが含まれていました。ここでは、酵素ステップとインキュベーション時間を削減したChIP-exoプロトコルの新しいバージョンと、各酵素ステップ21の説明を報告します。エンドリペアとdA-テーリング反応は、エンドプレップ酵素を用いた一回のステップで組み合わされます。インデックスおよびユニバーサルアダプターライゲーションステップのインキュベーション時間は、ライゲーションエンハンサーを使用して2時間から15分に短縮されます。キナーゼ反応は、上記のChIP-exoプロトコルに記載されたインデックスアダプタライゲーションステップ後に除去される。代わりに、オリゴDNA合成中にリン酸基が、ラムダエキソヌクレアーゼ消化ステップに使用されるインデックスアダプタの5'末端(表1)のいずれかに添加される。以前のChIP-exoプロトコルはRecJfエキソヌクレアーゼ消化を使用して一本鎖DNA汚染物質を排除しましたが、この消化ステップはChIP-exoライブラリの品質にとって重要ではないので、ここで取り除かれます。また、ChIP溶出後に逆架橋DNAを精製するために、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(PCIA)抽出法の代わりに磁気ビーズ精製法が用いられます。これにより、DNA抽出のインキュベーション時間が短縮されます。重要なことに、インデックスアダプタライゲーション中に形成されるアダプタダイマーの大部分を除去し、結紮媒介PCRの効率に影響を与える可能性があります。
ここで紹介するChIP-exoプロトコルは、マウス胚性幹細胞(ES)細胞と区別される哺乳類ニューロンにおける正確なタンパク質とDNA相互作用の検出に最適化されています。簡単に言えば、採取および架橋された神経細胞が溶解され、クロマチンが超音波処理にさらされることを可能にし、次に適切なサイズのDNA断片が得られるように超音波処理する(図1)。抗体被覆ビーズは、その後、目的のタンパク質に断片化した可溶性クロマチンを選択的に免疫沈降させるために使用されます。免疫沈降DNAがビーズ上に残っている間、エンドリペア、シーケンシングアダプターの結紮、フィルイン反応および5'〜3'ラムダエキソヌクレアーゼ消化ステップが行われる。エキソヌクレアーゼ消化ステップは、ChIP-exoに超高分解能と高い信号対雑音比を与えるものです。ラムダエキソヌクレアーゼは、免疫沈降DNAを架橋部位から数塩基対(bp)でトリミングし、汚染DNAを分解させる。エキソヌクレアーゼ処理のChIP DNAは、抗体被覆ビーズから溶出し、タンパク質-DNA架橋が逆転し、タンパク質が分解される。DNAを抽出し、一本鎖のChIP DNAに変性させ、続いてプライマーアニーリングおよび拡張して二本鎖DNA(dsDNA)を作る。次に、エキソヌクレアーゼ処理末端へのユニバーサルアダプターの結紮が行われる。得られたDNAを精製し、次いでPCR増幅し、精製し、次期シーケンシングを行う。
ChIP-exo プロトコルは ChIP-seq プロトコルよりも長いですが、技術的にはそれほど困難ではありません。正常に免疫沈降したChIP DNAは、いくつかの追加の酵素ステップで、ChIP-exoに供することができる。極度の高いマッピング解像度、背景信号の減少、ゲノム結合部位に関する偽陽性および陰性の減少などのChIP-exoの顕著な利点は、時間コストを上回る。

<table><tbody><tr><td>アガロース、UltraPure</td><td>Invitrogen</td><td>16500</td><td>LM-PCR増幅DNAの超音波処理(セクション4.3.6)およびゲル精製の確認(セクション19.1)</td></tr><tr><td>アルブミン、ウシ血清(BSA)、プロテアーゼフリー、ヒートショックアイソレーション、最小98%</td><td>BioShop</td><td>ALB003</td><td></td></tr><tr><td>Isl1</td><td>DSHB</td><td>39.3F7</td>に対する抗体のビーズ<td>による抗体注入(セクション5.6)</td></tr><tr><td>Bioruptor Pico&nbsp;</td><td>Diagenode</td><td>B01060010</td><td>Sonicating Chromatin (Section 3.3)</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)、分子生物学グレード</td><td>New England BioLabs</td><td>B9000S</td><td>ビーズへの充填反応 (セクション 10.2) および変性、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長 (セクション 14.2)</td></tr><tr><td>遠心分離機 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000138</td><td>クロマチンの超音波処理 (セクション 3.5)、超音波処理のチェック (セクション 4.3.1、4.3.3、4.3.4)</td></tr><tr><td>Centrifuge 5804 R</td><td>Eppendorf</td><td>22623508</td><td>収穫、細胞の架橋および凍結 (セクション 1.3)、細胞溶解 (セクション 2.2 および 2.3)、超音波処理クロマチン (セクション 3.1)</td></tr><tr><td>cOmplete、Mini、EDTA-free Protease Inhibitor</td> カクテル <td>ロシュ</td><td>4693159001</td><td>プロテイナーゼ K バッファーと ChIP 溶出バッファーを除くすべてのバッファーに添加</td></tr><tr><td>dATP 溶液</td><td>New England BioLabs</td><td>N0440S</td><td>dA-Tailing 反応 (セクション 15.1)</td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウムソル</td><td>トフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP349</td><td>溶解バッファー3、高塩ウォッシュバッファーおよびLiClウォッシュ</td></tr><tr><td>バッファーdNTPミックス、分子生物学グレード</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td>ビーズへのフィルイン反応(セクション10.2)および変性、プライマーアニーリングおよびプライマーエクステンション(セクション14.2)</td></tr><tr><td>DreamTaqグリーンPCRマスターミックス、2x&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1081</td><td>ライゲーション媒介PCR(セクション18.1)</td></tr><tr><td>EDTA、0.5 m、滅菌溶液、pH 8.0</td><td>BioShop</td><td>EDT111</td>溶解<td>バッファー1-3、超音波処理のチェック(セクション4.1)、高塩洗浄バッファー、LiCl洗浄バッファーおよびChIP溶出バッファー</td></tr><tr><td>エチルアルコール無水、100%</td>超音波処理のチェック<td>P006EAAN</td><td>市販アルコール(</td><td>セクション4.3.3)</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド、36.5-38%、10-15%を含むメタノール</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>細胞の採取、架橋および凍結 (セクション 1.1)</td></tr><tr><td>グリセロール、試薬グレード、最小 99.5%</td><td>BioShop</td><td>GLY002</td><td>溶解バッファー 1</td></tr><tr><td>グリシン、バイオテクノロジーグレード、最小 99%</td><td>BioShop</td><td>GLN001</td><td>細胞の採取、架橋および凍結 (セクション 1.2)</td></tr><tr><td>グリコーゲン、RNA グレード</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0551</td><td>超音波処理のチェック (セクション 4.3.3)</td></tr><tr><td>HEPES、1 M 滅菌ろ過溶液、pH 7.3&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>HEP003</td><td>Lysis Buffer 1, High Salt Wash</td></tr><tr><td>Buffer Klenow Fragment (3->5 exo-)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0212S</td><td>dA-テーリング反応 (セクション 15.1)</td></tr><tr><td>ラムダ エキソヌクレアーゼ</td><td>New England BioLabs</td><td>M0262S</td><td>ラムダ エキソヌクレアーゼ ビーズの消化 (セクション 11.2)</td></tr><tr><td>リガーゼエンハンサー</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645S</td><td>NEBNext Ultra II DNAライブラリーキット。インデックスアダプターライゲーション on ビーズ (セクション 9.1) およびユニバーサルアダプターライゲーション (セクション 16.1)</td></tr><tr><td>Ligase Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645S</td><td>NEBNext Ultra II DNA Library Kit.ビーズ上のインデックスアダプターライゲーション(セクション9.1)およびユニバーサルアダプターライゲーション(セクション16.1)</td></tr><tr><td>塩化リチウム(LiCl)、試薬グレード</td><td>Bioshop</td><td>LIT704</td><td>LiCl Wash Buffer</td></tr><tr><td>ChIP用磁気ビーズ(Dynabeads Protein G)</td><td>Dynabeads Protein G(ChIP用磁気ビーズ)</td><td>Dynabeads Protein G(ChIP用磁気ビーズ)</td><td>ビーズによる抗体インキュベーション(セクション5)</td></tr><tr><td>DNA精製用磁気ビーズ(AMPure XP Beads)</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63880</td><td>DNA 抽出 (セクション 13.3) および DNA クリーンアップ (セクション 17.1)</td></tr><tr><td>磁気ラック (DynaMag-2 マグネット)</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>セクションの多くのステップで使用されます: 5 - 11, 13</td></tr><tr><td>MinElute ゲル抽出キット</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>28604</td><td>PCR増幅DNAのゲル精製(セクション19.2)</td></tr><tr><td>N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩溶液、30%水溶液、&ge;97.0% (HPLC)</td><td>Sigma</td><td>61747</td><td>溶解バッファー 3</td></tr><tr><td>オクチルフェノール エトキシレート (IGEPAL CA630)</td><td>BioShop</td><td>NON999</td><td>溶解バッファー 1 および LiCl 洗浄バッファー</td></tr><tr><td>フェノール:クロロホルム:イソアミル アルコール、バイオテクノロジー グレード (25:24:1)</td><td>BioShop</td><td>PHE512</td><td>超音波処理の確認 (セクション 4.3.1)</td></tr><tr><td>phi29 DNA ポリメラーゼ</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0269L</td><td>ビーズへの充填反応(セクション10.2)および変性、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長(セクション14.3および14.4)</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、1x&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td>細胞の収穫、架橋および凍結 (セクション 1.3) および超音波処理クロマチン (セクション 3.1)、ビーズによる抗体注入 (セクション 5.1)</td></tr><tr><td>PowerPac 基本電源</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td>超音波処理 (セクション 4.3.6) および LM-PCR 増幅 DNA のゲル精製 (セクション 19.1)</td></tr><tr><td>ProFlex PCR システム</td><td>Applied Biosystems</td><td>ProFlex PCR システム</td><td>セクションで使用:14.2、14.4、15.2、16.2、18.2</td></tr>タンパク質<tr><td>LoBindチューブ、2.0 mL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td>Antibody Incubation with Beads (Section 5.2) and Chromatin Immunoprecipitation (Section 6.3)</td></tr><tr><td>Proteinase K Solution, RNA Grade</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td>Checking Sonication (Section 4.2) and Elution and Reverse Crosslinking (Section 12.3)Qubit</td></tr> <tr><td>4.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q33226</td><td>Gel Purification of PCR Amplified DNA (Section 19.3)</td></tr><tr><td>Quibit dsDNA BR assayキット</td><td>Invitrogen</td><td>Q32853</td><td>PCR 増幅 DNA のゲル精製 (セクション 19.3)</td></tr><tr><td>Rnase A、Dnase およびプロテアーゼフリー</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td>超音波処理 (セクション 4.3.2) および DNA 抽出 (セクション 13.2)</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)、BioReagent&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5886</td>溶解<td>バッファー1-3、高塩洗浄バッファード</td></tr><tr><td>デシル硫酸ナトリウム(SDS)、電気泳動グレード</td><td>BioShop</td><td>SDS001</td><td>超音波処理(セクション4.1)、高塩洗浄バッファーおよびChIP溶出バッファー</td></tr><tr><td>超音波処理ビーズおよび15mLバイオラプターチューブジ</td><td>アゲノード</td><td>C01020031</td><td>クロマチン超音波処理(セクション3.1および3.2)</td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>5384000020</td><td>セクション 4.2、4.3.2、4.3.5、8.2、9.2、10.3、11.2、12.2、12.3、13.2、16.2</td></tr><tr><td>Trizma 塩酸塩溶液 (Tris-HCl)、BioPerformance 認証済み、1 M、pH 7.4</td><td>Sigma</td><td>T2194</td><td>10 mM Tris-HCl バッファー</td></tr><tr><td>Trizma 塩酸塩溶液 (Tris-HCl)、BioPerformance 認証済み、1 M、pH 8.0</td><td>Sigma</td><td>T2694</td><td>Lysis Buffer 2、Lysis Buffer 3、Checking Sonication (Section 4.1)、LiCl Wash Buffer and ChIP Elution Buffer</td></tr><tr><td>Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn)</td><td>New England BioLabs</td><td>E7546S</td><td>End Prep Reaction mix および End Prep Enzyme Mix です。ビーズのエンドリペアおよびdA-テーリング反応(セクション8.2)</td></tr><tr><td>VWRミニチューブロッカー、可変速</td><td>VWR</td><td>10159-752</td>セクションの<td>多くのステップで使用されます:1、2、5、6および7</td></tr><tr><td>2-[4-(2,4,4-トリメチルペンタン-2-イル)フェノキシ]エタノール、トリトンX-100、試薬グレード</td><td>BioShop</td><td>TRX506</td><td>溶解バッファー1、超音波クロマチン(セクション3.4)および高塩洗浄バッファー</td></tr></tbody></table>

クロマチン免疫沈降-エキソヌクレアーゼ(chip-exo)を用いたマウス幹細胞由来ニューロンにおけるタンパク質-dna相互作用の高分解能マッピング

High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

ゲノム上の特異的タンパク質とDNA相互作用の同定は、遺伝子調節を理解するために重要である。ハイスループットシーケンシング(ChIP-seq)と組み合わせたクロマチン免疫沈降法は、DNA結合タンパク質のゲノム全体の結合場所を同定するために広く使用されています。しかし、ChIP-seq法は、超音波処理されたDNA断片および非特異的バックグラウンドDNAの長さの不均一性によって制限され、DNA結合部位におけるマッピング分解能と不確実性が低い結果となる。これらの制限を克服するために、ChIPとエキソヌクレアーゼ消化(ChIP-exo)の組み合わせは、5'〜3'エキソヌクレアーゼ消化を利用して、タンパク質-DNA架橋部位に異種サイズの免疫沈降DNAをトリミングする。エキソヌクレアーゼ処理は、非特異的なバックグラウンドDNAも除去する。ライブラリー調製およびエキソヌクレアーゼ消化 DNA は、ハイスループットシーケンシングのために送ることができます。ChIP-exo法は、より大きな検出感度と背景信号の低減を伴うニアペアマッピング分解能を可能にします。哺乳類細胞および次世代シーケンシング用に最適化されたChIP-exoプロトコルを以下に説明する。

図2Aは、マウスES細胞から分化した運動ニューロン細胞の様々なサイクルを有する、細胞のリシスおよび超音波処理後の超音波処理結果を示す。超音波処理サイクルの最適な数(例えば、 図2Aの12サイクル)は、100-400 bp DNA断片に強いDNA強度を生成しました。高品質のChIP-exoライブラリは、断片化したクロマチンDNAのサイズと量に基づいています。したがって、ChIP-exoを開始する前に、各細胞タイプと細胞のバッチに対して超音波処理の最適化が推奨されます。
図2B は、18-21回のPCRサイクルで増幅されたChIP-exo DNAサンプルのライゲーション媒介PCR(LM-PCR)産物を示しています。LM-PCR は次世代シーケンシング用に DNA アダプターと連結された ChIP-exo DNA フラグメントを増幅します。PCRプライマーはDNAアダプタ配列の一部である。超音波処理されたDNA...

ゲノム全体のタンパク質結合位置の正確な決定は、遺伝子調節を理解するために重要です。ここでは、クロマチン免疫沈降DNAをエキソヌクレアーゼ消化(ChIP-exo)に続けてハイスループットシーケンシングで処理するゲノムマッピング方法について説明します。この方法は、哺乳類ニューロンにおける近接塩基対マッピング分解能および高いシグナル対雑音比を用いてタンパク質とDNAの相互作用を検出する。

クロマチン免疫沈降-エキソヌクレアーゼ(ChIP-Exo)を用いたマウス幹細胞由来ニューロンにおけるタンパク質-DNA相互作用の高分解能マッピング

Identification of specific protein-DNA interactions on the genome is important for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation coupled ...

当社のChIP-exo法の主な利点は、従来のクロマチン免疫沈降法と比較して、細胞内のタンパク質DNA相互作用のマッピング分解能が向上することです。ChIP用のプロテインG磁気ビーズを調製するには、磁気ビーズを均一になるまで混合します。次に、25マイクロリットルの磁気ビーズを2ミリリットルのタンパク質低結合チューブに加えます。ビーズに1ミリリットルのブロッキング溶液を追加します。ピペッティングでよく混合し、チューブを磁気ラックに1分間置きます。上清が透明になったら、取り除きます。次に、ビーズに1ミリリットルのブロッキング溶液を追加します。チューブを摂氏4度のロッキングプラットフォームに置き、10分間揺さぶった後、チューブを短時間回転させます。チューブを磁気ラックに置き、上清を取り除きます。磁気ビーズに500マイクロリットルのブロッキング溶液を追加します。Islet-1に対する抗体を短時間遠心し、磁気ビーズを含むチューブに4 μgの抗体を加えます。磁気ビーズとIslet-1抗体が入ったチューブを摂氏4度のロッキングプラットフォームに置き、6〜24時間揺さぶります。クロマチン免疫沈降を開始するには、抗体でコーティングしたビーズを1ミリリットルのブロッキング溶液で洗浄します。抗体でコーティングしたビーズの入ったチューブを、摂氏4度のロッキングプラットフォームに5分間置きます。短時間回転させた後、チューブを磁気ラックに置き、上清を取り除きます。抗体でコーティングしたビーズを50マイクロリットルのブロッキング溶液に再懸濁します。1ミリリットルの超音波処理したライセートを抗体コーティングビーズに加え、次いで4°Cのロッキングプラットフォーム上でサンプルを一晩インキュベートする。サンプルを一晩インキュベートした後、チューブを短時間回転させてキャップから液体を回収し、チューブを磁気ラックに置きます。そして1分後、ピペットで上清を慎重に取り除きます。次に、次のように一連の洗浄を行います。CPIを含む1ミリリットルのコールドウォッシュバッファーをサンプルに加えます。サンプルを摂氏4度のロッキングプラットフォームで5分間混合します。サンプルチューブを短時間回転させてから、磁気ラックに置きます。1分後、ピペットで上清を取り除きます。最初の酵素反応と修復、およびDAテーリングでは、38マイクロリットルのオートクレーブ二重蒸留水をサンプルに加え、次にエンドプレップ反応ミックスとエンドプレップ酵素ミックスを加えます。チューブの内容物をピペッティングで混合し、サンプルを摂氏20度で30分間インキュベートします。次に、前述のように、サンプルビーズを高塩洗浄バッファー、塩化リチウム洗浄バッファー、および10ミリモルトリス塩化水素バッファーで洗浄します。インデックスアダプターライゲーションを行うには、27マイクロリットルの冷たく10ミリモルのTris塩化水素緩衝液をサンプルに加えます。次に、インデックスアダプター、ライゲーションエンハンサー、およびリガーゼマスターミックスを追加します。サンプルを摂氏20度で15分間インキュベートします。再度、サンプルビーズを高塩分洗浄バッファー、塩化リチウム洗浄バッファー、および 10 ミリモルの Tris 塩化水素バッファーで洗浄します。次に、47マイクロリットルの冷たい10ミリモルトリス塩化水素緩衝液をサンプルに加えます。ホスホジエステル結合の欠落に起因するDNAの傷を修復するには、11.1マイクロリットルの充填混合物をサンプルに加えます。サンプルを摂氏30度で20分間インキュベートします。一連の洗浄の後、50マイクロリットルの冷たいオートクレーブ二重蒸留水をサンプルに加えます。ChIP DNAをファイブプライムからスリープライムの方向に消化するには、ラムダエキソヌクレアーゼバッファーとラムダエキソヌクレアーゼを添加し、ピペッティングでサンプルを混合します。サンプルを摂氏37度で30分間インキュベートします。消化が完了したら、最後に3回の洗浄を繰り返します。ビーズからChIPサンプルを溶出するには、サンプルを75マイクロリットルのChIP溶出バッファーおよびインキュベーターに再懸濁し、摂氏65度で15分間、130倍G.サンプルに20ミリグラム/ミリグラムのプロテイナーゼKを2.5マイクロリットル加えます。サンプルを短時間ボルテックスし、摂氏65度で一晩インキュベートします。サンプルを短時間回転させ、磁気ラックに置きます。1分後、上清を新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。DNAを精製して溶出します。溶出したDNAを精製した後、抽出したDNAサンプル16マイクロリットルをPCRチューブに移します。1.2マイクロリットルの変性およびプライマーアニーリング混合物をサンプルに加えます。原稿の表6に記載されているプログラムを使用して、テンプレートDNAのプライマーを変性およびアニールします。3マイクロリットルのプライマーエクステンションミックスをサンプルに加え、原稿の表7に記載されているPCRプログラムを実行します。4.1マイクロリットルのDAテーリングミックスをサンプルに加え、原稿の表8のPCRプログラムを使用してサンプルを分析します。次に、21.5マイクロリットルのユニバーサルアダプターライゲーションミックスをサンプルに加え、摂氏20度で15分間インキュベートします。29マイクロリットルのLM-PCRミックスをサンプルに加え、原稿の表10のプログラムを使用してサンプルを実行します。LM-PCRを18サイクル行った後、マウス運動ニューロン由来のChIP-exoサンプルを1.5%アガロースゲル上で電気泳動しました。ChIP-exo Islet-1の結果は、約200〜400塩基対の増幅されたDNAライブラリを示し、ChIP-exoライブラリがLM-PCRによって正常に増幅されたことを示しています。約100塩基対のバンドは、アダプターとPCRプライマーからのアーティファクトを表しています。抗体なしコントロールは、ラムダエキソヌクレアーゼ処理によって非特異的なバックグラウンドDNAが消化されたことを示しています。ChIP-exoおよびChIP-seqを用いて、Islet-1の結合位置を同定した。ChIP-exoシグナルは、Islet-1結合部位に高度に焦点を合わせ、複数のクラスター化されたIslet-1転写因子結合パターンを検出しました。ChIP-seq信号は、Islet-1のChIP-exoがChIP-seqよりも高いマッピング分解能を示したことを示す、より広範な信号を示しました。複数の転写因子は、タンパク質-DNA複合体としてDNAを隣り合って結合することがよくあります。ChIP-exoは、複数の転写因子が標的DNAをどのように認識し、制御するかを研究することを可能にします。

high-resolution-mapping-protein-dna-interactions-mouse-stem-cell

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

このビデオは、標的タンパク質特異的抗体被覆磁気ビーズを使用して、幹細胞由来の運動ニューロンライセートから標的タンパク質と架橋されたDNA断片の免疫沈降を示しています。...

運動ニューロンライセートからの標的タンパク質-DNA複合体の免疫沈降

出典:Mendez, F. M. et al., Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres. J. Vis. Exp.

ニューロスフェア細胞のネイティブクロマチン免疫沈降

生体内でゲノムにどのような影響を与えるかクロマチン制御因子とクロマチンの状態の問題は、細胞運命決定が発生中の胚になっている様子を、早期の我々の理解の鍵である。 ChIPの-SEQ-グローバルレベル-さアフリカツメガエル胚のためにここで概説でクロマチンの機能を調査するための最も一般的なアプローチ。...

クロマチンレギュレータと米国でのゲノムワイドスナップショット<em&gt;アフリカツメガエル</emChIPの-配列によって&gt;胚

ここでは、タンパク質-DNA相互作用の近塩基対分解能を達成するためのプロトコルを提示します。これは、クロマチン免疫沈降(ChIP-exo)によって選択的に濃縮されたDNA断片のエキソヌクレアーゼ処理と、それに続くハイスループットシーケンシングによって得られます。...

ChIP-エキソ方法：近く塩基対の精度でタンパク質 -  DNA相互作用を同定します

ミクロコッカスヌクレアーゼ（MNase）融合タンパク質でゲノムワイドのタンパク質結合部位をマッピングするためのクロマチン免疫沈降（ChIP） - 直交方法であるハイスループット配列決定（ChEC-seq）と結合したクロマチン内在性切断について記載する。...

ChEC-seqとのタンパク質 - DNA相互作用のゲノムワイドマッピング<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

この研究は、成熟マウスT細胞株を用いたクロマチン免疫沈降（ChIP）のためのプロトコールを記載している。このプロトコルは、特定のプロモーター部位またはゲノムワイドにおける特定のヒストンマークの分布を調べるのに適しています。...

マウスT細胞株におけるクロマチン免疫沈降（ChIP）

ヒストン 3 リジン 79 ジメチル化 (H3K79me2) - 内にあるヒストン マークのクロマチン免疫沈降 (チップ) の胎生期および生後の脳組織から神経前駆細胞の培養を特定し効果的かつ再現可能な手法を提案しますヒストン 3...

3 ヒストンのリジン 79 ジメチル化マークのクロマチン免疫沈降に続いて神経前駆細胞の分離と培養

ここでは、チップ Seq を実行する方法について記述して ES 細胞の CARIP-Seq、次世代シーケンシング ライブラリ準備も含めて世界的なエピゲノムとクロマチン関連 RNA...

CARIP Seq とチップ Seq: クロマチン結合 Rna および胚性幹細胞における蛋白質 DNA 相互作用を識別する方法

タンデム クロマチンのステップバイ ステップ プロトコルについて述べる免疫沈降配列 (tChIP-Seq)...

TChIP-Seq: 細胞型特異エピゲノムのプロファイリング

このプロトコルは、トポロジー的会合ドメイン(TAD)の境界や、調節と他のDNA配列要素との間の長距離クロマチン相互作用など、メガベースサイズの標的ゲノム領域の3D組織を高解像度で特徴付けるために使用されるCapture Hi-C法について説明しています。...

キャプチャHi-C による 高分解能3Dクロマチン構成の解読

ゲノムワイド染色体コンフォメーションキャプチャー法Micro-C-XLを使用して、ヌクレオソーム分解能で三次元ゲノム構成をマッピングするためのプロトコルがここに示されます。...

Micro-C-XLによる哺乳類3Dゲノム相互作用のマッピング

学ぶChIP-Exo法によるマウス幹細胞由来ニューロンのタンパク質-DNA相互作用の高分解能マッピング。エキソヌクレアーゼ処理と高通量シーケンスにより、塩基対レベルの分解能で遺伝子制御メカニズムを解明する手法です。

クロマチン免疫沈降-エキソヌクレアーゼ(ChIP-Exo)を用いたマウス幹細胞由来ニューロンにおけるタンパク質-DNA相互作用の高分解能マッピング

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