Name: リアルタイム細胞解析を用いた宿主外でのインフルエンザウイルスの生存率のモニタリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 学ぶリアルタイム細胞インピーダンス解析によるインフルエンザウイルス生存率の定量法。MDCK細胞を用いた電気インピーダンスモニタリングで、環境条件下でのウイルス動態を正確に評価できます。

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すべてのインフルエンザウイルスを適切なバイオセーフティレベルの要件(サブタイプに応じてBSL-2以上)に従って処理します。継代履歴が低いIAV株(MDCK細胞では5倍未満)を使用して、実験間の変動が少ないことを保証します。
1. 試薬および出発物質の調製
<ol><li>MDCK細胞及び滅菌細胞培養培地の調製<ol>
<li>10%熱不活化ウシ胎児血清(FCS)および抗生物質(100単位/mLペニシリン、100mg/mLストレプトマイシン)を添加した改変イーグル培地(MEM)でマディン・ダービー犬腎臓(MDCK)細胞を培養する。</li>
		<li>解凍後、MDCK細胞に感染する前に少なくとも2倍の継代を行い、完全な回復を確実にする(ただし、細胞表現型のドリフトを避けるために30回未満の継代)。</li>
		<li>7.5 x 106 MDCK細胞を含む滅菌1x MEMの30 mLを含む種子75 cm2組織培養フラスコを、加湿した5%CO2インキュベーター内で37°Cでインキュベートする。</li>
	</ol>
</li>
	<li>インピーダンス監視装置の準備<ol>
<li>器具を35°Cのインキュベーターに入れ、少なくとも2時間ウォームアップさせます。</li>
		<li>インキュベーターの外側に配置されたコントロールユニットに接続します。</li>
		<li>実験の残りの部分を開始する前に、製造元の推奨に従ってクリーニング手順に進みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>MDCK細胞におけるIAVストックの生産<ol>
<li>H1N1ウイルスを増殖および増幅するには、75 cm2組織培養フラスコに7.5 x 106 MDCK細胞をシードし、37°Cで24時間インキュベートして90%~100%のコンフルエントに達する。</li>
		<li>細胞培養培地を細胞単層から75cm2フラスコにデカントする。5mLの滅菌1x PBSで細胞を洗浄する。</li>
		<li>PBSを除去し、5mLの1x PBSを加えて細胞を再び洗浄する。</li>
		<li>1つのフラスコにコントロールとしてラベルを付け、PBSを除去してから、15mLのウイルス伝播培地(0%FCSで1x MEM)を単層に注意深く加える。このフラスコを、5%CO2で35°Cに維持したインキュベーター内でインキュベートする。伝播の3日後の比較に使用します。</li>
		<li>IAVストックのバイアル1本をRTで解凍し、ウイルス伝播培地(0%FCSで1x MEM)を含む1.5mLチューブでウイルスを適切な濃度に希釈します。</li>
		<li>75 cm2 フラスコから 1x PBS を取り出し、希釈したウイルスを細胞単層に 1 mL 添加して、細胞あたり 1 x 10-3 または 1 x 10-4 プラーク形成単位 (pfu/細胞) の感染多重度 (MOI) で MDCK 細胞に感染させます。</li>
		<li>フラスコ内を15分毎に定期的に撹拌することにより、RTで45分間MDCK細胞にウイルスを吸着させる。</li>
		<li>接種物を静かに除去し、1μg/mLのTPCK-トリプシン(トリプシン/L-1-トシルアミド-2-フェニルエチルクロロメチルケトン)を含むフラスコあたり15mLのウイルス増殖培地を添加し、ウイルスヘマグルチニンHA0をHA1およびHA2サブユニットに切断する(エンドソーム膜とのHA融合およびウイルスゲノムの放出に必要な事象)22。</li>
		<li>フラスコを35°Cおよび5%CO2 で少なくとも3日間インキュベートして、ウイルスを複製する。</li>
		<li>MDCK細胞を顕微鏡下で40倍の倍率で観察し、細胞に対する細胞変性効果(CPE)を探す(細胞対照フラスコと比較することによって)。CPEが完全でない場合(すなわち、細胞の約80%が基質から剥離している場合)、フラスコをさらに24時間インキュベーターに戻します。</li>
		<li>CPEが完了したら、細胞培養上清をデカントし、300 x g で10分間遠心分離して細胞破片をペレット化する。</li>
		<li>清澄化した上清を15mLチューブに移し、アリコート後代ウイルスを使い捨ての滅菌極低温バイアルに移す。直ちにクライオチューブを-80°Cに置き、ウイルスを凍結させてストックする。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 細胞感染に適した細胞量の決定
注:すべての実験中、プレートは、パッケージの紙ラップなど、常に非静電的な面に保管してください。以下のセクション2に従って、電子マイクロタイタープレート(E-Plateとして設計)に播種する細胞の最も適切な濃度を決定します。
<ol><li>MDCK細胞を75cm2フラスコに調製し、実験の24時間前に新たに分裂した細胞(約80%コンフルエント)を得た。</li>
	<li>5 mL の 1x PBS で細胞を洗浄し、3 mL の 0.25% トリプシン-EDTA 溶液を加えて細胞を剥離します。</li>
	<li>7 mLの新鮮な細胞培養培地を加え、トリパンブルー染色による自動細胞カウンターを用いて細胞を計数する。</li>
	<li>細胞培養培地で細胞濃度を400,000細胞/mLに調整します。追加のチューブで2倍の段階希釈を行い、200,000の細胞密度を得る。100,000;50,000;25,000;12,500;6,250細胞/mLを有する。細胞の種類や増殖挙動に応じて細胞の希釈範囲を調整します。</li>
	<li>Eプレート(材料表)をRTで数分間放置し、マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルに100μLの細胞培養培地を加えます。Eプレートの電極には触れないでください。</li>
	<li>クレードルのロックを解除し、プレートフロントエンドをインピーダンス測定器のクレードルポケットに挿入します(材料表)。インキュベーターのドアを閉めます。</li>
	<li>ソフトウェアを開きます。<ol>
<li>「実験パターンのデフォルト設定」で、選択したクレードルを選択し、トップページをダブルクリックし、実験名を入力します。「レイアウト」をクリックし、プレートの選択した各ウェルに必要なサンプル情報を入力します。終了したら、「適用」をクリックします。「スケジュール」 | をクリックします。「ステップ」 | 「ステップを追加」。ソフトウェアは、バックグラウンドインピーダンス(CI)を測定するために1秒のステップを自動的に追加します。</li>
		<li>「実行」タブの「開始/続行」をクリックします。「プロット」をクリックし、適切なウェルを選択してすべてのサンプルを追加し、次のステップに進む前にCIが-0.1~0.1であることを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>クレードルからプレートを取り外します。</li>
	<li>ステップ2.4の各細胞懸濁液を100 μLを重複して適切なウェルに加え、コントロールとして使用したウェルに100 μLの細胞培地を加える。E プレートを層流フードに RT で 30 分間放置して、ウェルの底部での細胞の均一な分布を可能にします。</li>
	<li>Eプレートをクレードルポケットに挿入します。「スケジュール」 | をクリックします。ソフトウェアに「ステップを追加」し、30分ごとに200回の繰り返しでセルを監視する値を入力します。次に、「開始/続行」を選択します。</li>
	<li>ソフトウェアの「プロット」ボタンをクリックして、CIデータを確認してプロットします。ウイルス感染中にまだ成長期にある細胞を得るために、プレート上に播種後24時間で静止期直前にある細胞の濃度を選択する。静止位相は、CIが最大になったときに達する。</li>
</ol>3. CIT50 値と感染多重度の相関
<ol><li>Eプレートの各ウェルに滅菌1x MEM培養培地100 μLを加える。Eプレートを35°Cで機器のクレードルポケットに挿入します。 手順 2.7 で説明したように背景を測定します。</li>
	<li>E プレートをクレードルから取り外します。</li>
	<li>電子マイクロタイタープレートの各ウェルに新たに分割されたMDCK 細胞を3 x 104個シードし、IAV感染中に複製段階になるように、5%CO2で35°Cで24 時間増殖させる。</li>
	<li>MDCK細胞に、既知の6 log10 TCID50/mLの力価のH1N1ウイルスの異なる10倍希釈液を感染させ、再現性のために逆ピペッティングを使用して、以下の手順に従います。<ol>
<li>MDCK細胞2xをFCS(ウイルス増殖培地)を含まない100μLのMEMですすいでください。接種剤のさらなる希釈を避けるために、2回目の洗浄後にすべての培地を除去することに注意してください。</li>
		<li>シングルチャンネルピペットを使用して各ウェルに100 μLのウイルス懸濁液を追加します。汚染を避けるために、プレート内の左から右へ、そして上から下へ、残りのウェルを蓋で覆いながら進めます。</li>
		<li>プレートを35°Cで器具のクレードルポケットに挿入します。 汚染につながる可能性のある突然の動きを避けるために、優しくしてください。</li>
		<li>ステップ 2.10 で説明したように、少なくとも 100 時間の間、15 分ごとにセルのインピーダンスの監視を開始します。</li>
		<li>測定の2サイクル(すなわち、30分)の後、「実行」タブの「一時停止」をクリックして装置を一時停止し、クレードルからEプレートを取り外します。</li>
		<li>1 μg/mL の TPCK-トリプシンをウイルス増殖培地に加え、ウイルス性ヘマグルチニンを切断します。</li>
		<li>TPCK-トリプシンを含むウイルス増殖培地100 μLを各ウェルに加え、Eプレートをクレードルポケットに挿入します。</li>
		<li>「実行」タブの「開始/続行」をクリックします。 注:ウイルス懸濁液をウイルス増殖培地に置き換えて、偽感染細胞に対応する陰性対照を作成することを忘れないでください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. IAV生存動態
<ol><li>IAVを35°Cの生理食塩水蒸留水にさらし、細胞インピーダンス低下を測定することによって経時的な感染価を試験する。<ol>
<li>蒸留水にNaClを終濃度35g/Lとなるように添加して蒸留水を調製する。900 μL の生理食塩水を 2 mL のクライオチューブに加えます。</li>
		<li>生理食塩水に100 μLのウイルスストックを加え、クライオチューブをインキュベーター(35°C、5%CO2)に1時間、24時間、または48時間置きます。</li>
		<li>16ウェルマイクロタイタープレート上に新たに分割したMDCK細胞100 μL(3 x 104を含む)をシードし、37°Cおよび5%CO2で24時間増殖させる。</li>
		<li>逆ピペッティング法を用いて、100 μLの暴露されたウイルス(予め培養培地で10倍に希釈した)で細胞に感染させ、セクション3.4を繰り返して再現性を高める。</li>
	</ol>
</li>
	<li>セルインピーダンスを15分ごとに少なくとも100時間監視します。</li>
</ol>5. 感染力低下の評価
<ol><li>CIT50値の決定は、CIT50 値を有するウイルス誘発性細胞変性効果に起因するCI減少を定量化する。<ol>
<li>「プロット」をクリックし、「すべて追加」をクリックしてすべてのサンプルを追加します。「実験情報のエクスポート」をクリックして、結果をスプレッドシートにエクスポートします。初期CIを、ばく露されたウイルスによる細胞感染の5時間後(すなわち、マイクロタイターEプレート上のMDCK細胞の播種後24時間)に測定された細胞インピーダンス値として考える。</li>
		<li>初期CIからの50 %の減少を測定するのに必要な時間に対応するCIT50値を計算する。CIT50値 を計算するには、各サンプルの5hpiのCI値に注意してください。次に、スプレッドシートのインデックス関数と一致関数を使用して、CI 値が 5 hpi の CI 値の半分に等しい時点を見つけます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>平均不活性化傾きの計算<ol>
<li>各曝露ウイルス懸濁液のCIT50 値を、異なる曝露時間(日数)で決定する。</li>
		<li>CIT50プロット値から線形回帰勾配を計算し、不活性化勾配と呼ばれ、CIT50.day-1で表します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もありません。

RTCAはインピーダンスベースの技術で、細胞の接着、増殖、遊走、細胞毒性などの細胞特性のリアルタイムモニタリングにますます使用されています。本研究では、宿主外でのIAV生存率を評価するこの技術の能力は、ウイルスの不活化勾配を測定することによって実証される。TCID50やプラークアッセイなどの厳格な技術は、細胞生存率の客観的なリアルタイム評価に置き換えられ、ウイルスによって誘導される細胞変性効果を反映します。TCID50またはプラーク形成ユニット(pfu)と同様に、CIT50も感染の多重度と直線的に相関しています(図2)。このアプローチの限界の中で、この方法は、非細胞病原性ウイルスに感染した細胞を正確に監視することができない。
一例として、ウイルスゲノムへの新しい変異の導入は、ウイルスを強く減弱させ、その細胞病原性を低下させる可能性がある。対照的に、ここで計算された不活化の傾きは、ウイルス複製および潜在的なウイルス減衰とは無関係であり、この傾きは、同じウイルス...

ウイルスの伝播は、いくつかの要因の組み合わせに依存します。環境内で分泌されるウイルスの場合、その感染は、宿主外の条件下で持続する能力にも依存します。したがって、ウイルスの不活性化全般を研究することは、国家保健当局や政策立案者が管理およびバイオセーフティ対策を実施するのに役立つ重要なステップです。
自然環境および実験室環境におけるウイルスの持続性に関する知識は、過去10年間で大幅に増加しました。インフルエンザA型ウイルス(IAV)の場合、その感染経路はウイルス粒子を広範囲の環境条件に服従させる。具体的には、それらは、1)水(すなわち、鳥ウイルス)を通る糞便 - 経口経路、または2)汚染されたフォマイト、ならびにエアロゾルおよび呼吸飛沫(すなわち、家禽および哺乳動物ウイルス)による直接的または間接的な接触を介して伝達され得る1。いずれにせよ、IAVは様々な物理化学的パラメータ(すなわち、pH、塩分濃度、温度、湿度)に服従し、それらは多かれ少なかれそれらの感染力に急速に影響する2、3、4、5、6、7、8、9。特に人獣共通感染症ウイルスやパンデミックウイルスに関しては、ウイルスの動態に影響を与える環境要因の可能性、曝露および種間伝播のリスクを評価することが非常に重要です。
これまでのところ、従来のウイルス学技術(すなわち、プラークアッセイまたは50%組織培養感染用量推定によるウイルス力価決定)は、IAV感染力を経時的に評価するために使用されてきた。しかし、これらの技術は時間がかかり、多くの消耗品を必要とします10,11,12。微小電極を用いて感染細胞のインピーダンスを経時的に測定することは、さまざまな環境条件下でのIAV生存、および一般的なウイルス不活性化を監視するための有用なツールとして役立ちます。この方法は、細胞変性効果の主観的なヒト観察に代わる客観的でリアルタイムのデータを提供する。ウイルス滴定の決定に使用できるため、従来の測定を低い信頼区間に置き換え、労働集約的なエンドポイントアッセイを回避できます。
細胞インピーダンスの測定と古典的なプラークアッセイまたはTCID50法によって得られた滴定結果との間には線形相関が存在する。したがって、インピーダンスベースの滴定法で得られたデータは、ウイルスの段階希釈による標準曲線を作成することでTCID50またはpfu値に容易に変換することができます13,14,15,16,17。血清サンプル中に存在する中和抗体の検出、定量、および有効性も、この実験的アプローチを用いて達成することができる18,19。最近では、インピーダンスベースの細胞アッセイが、Equid alphaherpesvirus20に対する抗ウイルス化合物のスクリーニングおよび評価に使用されています。
この技術は、異なる温度での生理食塩水中のIAVの持続性を評価し、環境中のIAVの持続性を増減させるIAVのヘマグルチニンの変異を特定するために使用されてきました21。このようなスクリーニングは、従来の滴定法を使用する場合、広範な作業を必要とするであろう。しかし、この方法論は、細胞形態、細胞数、および細胞表面付着強度に影響を与える任意のウイルスに使用することができる。また、さまざまな環境条件(空気中、水中、または表面)での持続性を監視するためにも使用できます。
ここで説明するプロトコルは、例として水中でのIAV生存を適用します。ヒトインフルエンザウイルスは、長期間にわたって異なる物理化学的パラメータに曝露される。35°Cの生理食塩水(35g/L NaCl)を環境モデルとして選定した9。暴露されたウイルスの残留感染力は、細胞感染を介して異なる時点で定量化される。IAV増幅の基準細胞型であるMDCK細胞を、マイクロ電極センサーでコーティングした16ウェルマイクロタイタープレート上に播種し、24時間後に暴露されたウイルスに感染させた。セルインピーダンスは15分ごとに測定され、セルインデックス(CI)と呼ばれる任意の単位として表されます。インフルエンザウイルスによって誘導される細胞変性効果は、その発症速度が細胞培養物に接種された感染性ウイルス粒子の数に直接依存し、CI減少をもたらし、続いてCIT50値として定量化される。この値は、初期CIからの50%の減少を測定するのに必要な時間(すなわち、ウイルス添加前)に対応する。いくつかの環境暴露時間について計算されたCIT50値は、CIT50値の線形回帰後のウイルスの不活性化傾きの控除を可能にする。

<table><tbody><tr><td>0.25%トリプシン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2組織培養フラスコ</td><td>ファルコン</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>E-プレート 16 (6 プレート)</td><td>ACEA Biosciences, Inc</td><td>5469830001</td><td>E プレートは、さまざまなパッケージで利用できます</td></tr><tr><td>FCS</td><td>ライフ テクノロジーズ (gibco)</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>MEM 1X</td><td>ライフ テクノロジーズ (gibco)</td><td>31095029</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Life technologies (gibco)</td><td>14040091</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life technologies (gibco)</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>TPCK-Trypsin</td><td>Worthington</td><td>LS003740</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16</td><td>ACEA Biosciences, Inc</td><td>380601310</td><td>xCELLigence RTCA S16 装置には、さまざまな形式 (16 ウェル、96 ウェル、シングルプレート、マルチプレート) があります</td></tr></tbody></table>

リアルタイム細胞解析を用いた宿主外でのインフルエンザウイルスの生存率のモニタリング

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

ウイルス粒子定量のための方法は、多くのウイルス学研究の重要な側面を表しています。いくつかの信頼できる手法が存在しますが、時間がかかるか、小さな変動を検出できません。ここでは、感染細胞の電気インピーダンス変動をリアルタイムで分析することにより、ウイルス力価を正確に定量化するためのプロトコルを紹介します。細胞インピーダンスは、マイクロプレートの細胞の下に位置する金の微小電極バイオセンサを介して測定され、その大きさは細胞の数およびそのサイズおよび形状に依存する。このプロトコルにより、細胞増殖、生存率、形態、および遊走のリアルタイム分析が高感度で可能になります。また、ウイルス感染力に経時的に影響を与える様々な物理化学的パラメータ(すなわち、温度、塩分濃度、pH)に服従するインフルエンザA型ウイルス(IAV)の崩壊を定量化することによって、実用化の例を提供する。このようなアプリケーションの場合、このプロトコルは必要な作業負荷を軽減しながら、感染性ウイルス粒子の正確な定量データを生成します。これにより、異なるIAV間の不活性化スロープの比較が可能になり、特定の環境で持続する能力が反映されます。このプロトコルは、実行が容易であり、再現性が高く、細胞培養において細胞変性効果を産生するあらゆるウイルスに適用することができる。

異なる濃度のMDCK細胞を用いて120時間後に得られた生データを、ウェル当たり15,000〜120,000細胞から、 図1に示す。24時間後、CI測定は、30,000個の細胞を播種したウェル内の細胞がまだ増殖の指数関数的な段階にあり、この細胞濃度をさらなる実験に使用したことを示している。 図2 は、CIT50 値と感染の初期多重度との間の線形相関を示す。MDCK細胞を24時間培養し、その後、A/Paris/2590/2009 H1N1ウイルス株に異なる感染倍数で感染させる。初期CIは、感染の5時間後に測定される。
図3 は、我々の実験で用いた実験手順を示す(パネルA)。ウイルス誘発性細胞変性効果によるCI減少を示す典型的な結果をパネルBに示す。これらは、ソフトウェアによって処理された後に取得される生データです。CIT50値は 、データのエクスポート後にスプレッド...

ここで報告されるのは、感染細胞の電気インピーダンスのリアルタイムモニタリングを用いた感染性ウイルス粒子の定量化のためのプロトコルである。この方法の実用的な応用は、環境条件を模倣する異なる物理化学的パラメータ下でのインフルエンザA型ウイルス崩壊を定量化することによって提示される。

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

様々な粒子定量化のための方法は、ほとんどの生物学研究の重要な側面を表す。このプロトコルにより、リアルタイムでウイルスデータの正確な定量化が可能になります。この手法は、ウイルスデータの従来の測定に取って代わります。客観的なリアルタイムデータにより、信頼区間を下回り、労働集約的なエンドポイントの評価を回避します。この方法は、細胞変性作用を誘導する全てのウイルスに用いることができる。手順を実演するのは、私たちの研究室の検査技師であるQuentin Grassinです。H1N1ウイルスを増殖および増幅するには、標準的なプロトコールに従って、2つの75平方センチメートル組織培養フラスコに6個のMDCK細胞を10回7.5回シードし、90〜100%コンフルエントに達するまで摂氏37度で24時間インキュベートする。翌日、1回の洗浄につきフラスコ当たり5ミリリットルの滅菌PBSで細胞を2回洗浄し、1つのフラスコを対照としてラベル付けした。次に、A型インフルエンザウイルスストックの解凍バイアルを、新鮮なウイルス増殖培地を含む1.5ミリリットルのチューブで適切な実験濃度に希釈する。希釈原液の1ミリリットルを使用して、10倍から陰性3まで、または10倍から陰性4プラーク形成単位までの感染の多重度でMDCK細胞に感染させ、1ミリリットルのウイルス増殖培地を対照フラスコに加える。室温で45分間、15分ごとに攪拌しながらウイルスを細胞に吸着させる。インキュベーションの最後に、接種物を除去し、ウイルス性ヘマグルチニンHA0のHA1およびHA2サブユニットへの切断を容易にするために、TPCKトリプシン1ミリリットル当たり1マイクログラムを添加した15ミリリットルのウイルス増殖培地と交換する。その後、フラスコを摂氏35度のインキュベーターに3日間入れます。インキュベーションの最後に、光学顕微鏡で40倍の対物レンズ下で各培養物中の細胞を比較し、細胞に対する細胞変性効果を評価します。細胞変性効果が完了したら、細胞培養上清を15ミリメートルチューブに加え、遠心分離によって各培養物から細胞破片を回収する。次いで、清澄化されたウイルス培養上清を15ミリリットルのチューブに移し、後代ウイルスをマイナス80°Cの保存のために使い捨ての滅菌極低温バイアルにアリコートする。細胞感染に適切な細胞量を決定するには、PBSで細胞を洗浄し、37°Cでフラスコあたり0.25%トリプシン-EDTAの3ミリリットルで45分間インキュベーションしてそれらを回収する前に、実証されているように、約80%コンフルエントMDCK細胞培養物を24時間調製する。細胞が剥離したら、フラスコあたり7ミリリットルの新鮮な培養液で反応を停止し、各培養物から細胞を計数した。細胞を細胞培養培地1ミリリットル当たり10~5番目の細胞を4倍に希釈し、指示通りに細胞の2倍段階希釈を行う。Eプレートを室温で数分間置いてから、Eプレートの電極に触れることなく各ウェルに100マイクロリットルの細胞培養培地を添加する。クレードルのロックを解除し、プレートフロントエンドをインピーダンス測定器のクレードルポケットに挿入します。インキュベーターのドアを閉じ、ソフトウェアを開きます。[既定の実験パターン設定] で、選択したクレードルを強調表示し、トップ ページをダブルクリックして実験の名前を入力します。「レイアウト」(Layout) をクリックし、プレートの選択した各ウェルに必要なサンプル情報を入力します。[スケジュール]、[手順]、[手順の追加] をクリックします。ソフトウェアは自動的にバックグラウンドインピーダンスを測定するための1秒のステップを追加します 実行と開始、続行をクリックします。「プロット」および「追加」をクリックして適切なウェルを選択し、バックグラウンド・インピーダンスが負の 0.1 から 0.1 の間であることを確認してから次のステップに進みます。次に、クレードルからプレートを取り出し、各細胞懸濁液100マイクロリットルを適切なウェルに二重に加える。Eプレートを層流フードに室温で30分間放置して、Eプレートをクレードルポケットにロードする前に、ウェルの底部に細胞を均一に分布させます。[スケジュール] と [ステップの追加] をクリックし、値を入力して 30 分ごとにセルを監視し、[開始]、[続行] の順に選択する前に、200 回の繰り返しを確認します。細胞インピーダンスデータを確認してプロットするには、[プロット]をクリックし、播種後24時間で静止期の直前の細胞の濃度を選択して、ウイルス感染中にまだ増殖段階にある細胞を取得します。CIT50値と感染の多重度との相関関係を決定するために、電子マイクロタイタープレートの各ウェルに10~4個目の新たに分割したMDCK細胞を24時間3回培養した後、1ウェルあたり100マイクロリットルの新鮮なウイルス増殖培地で細胞を2回洗浄し、洗浄につき、シングルチャンネルピペットを用いて、各ウェルに100マイクロリットルのウイルス懸濁液を加えた。すべてのウイルス希釈液が加えられたら、プレートを摂氏35度で機器のクレードルポケットに静かにロードし、実証されているように、少なくとも100時間、15分ごとにセルインピーダンスの監視を開始します。2サイクルの測定後、クリックして装置を一時停止し、Eプレートをクレードルから取り外します。TPCKトリプシンを添加したウイルス増殖培地100マイクロリットルを各ウェルに加え、Eプレートをクレードルポケットに戻す。次に、解析を開始します。A型インフルエンザウイルスの生存動態を評価するために、蒸留水中に1リットル当たり35グラムの最終濃度に塩化ナトリウムを加え、得られた生理食塩水900マイクロリットルを2ミリリットルのクライオチューブに加える。各クライオチューブに100マイクロリットルのウイルスストックを加え、チューブを摂氏35度のインキュベーターに適切な実験期間置きます。インキュベーションの終了前日に、16ウェルマイクロタイタープレートに1ウェルあたり10〜4番目に分割されたMDCK細胞および100マイクロリットルのウイルス増殖培地を3回繰り返しステップでシードし、ウェルの底部への細胞のバックグラウンドインピーダンスおよび均一な分布の測定を可能にする。その後、細胞を摂氏37度および5%の二酸化炭素で24時間増殖させる。翌日、細胞を2回洗浄し、次いで、実証したように、新鮮な培養培地で10倍に希釈した100マイクロリットルの生理食塩水蒸留ウイルスで細胞を感染させ、少なくとも100時間にわたって15分ごとに細胞インピーダンスを監視する。ここでは、異なる濃度のMDCK細胞で120時間後に得られた生データが示されている。24時間後、細胞指数測定は、3倍の10〜4番目の細胞を播種したウェル内の細胞がまだ増殖の指数関数的な段階にあることを明らかにしたので、この細胞濃度をその後の実験に使用した。MDCK細胞培養物は、CIT50とインフルエンザウイルスによる感染の初期多重度との間に明確な線形関係を示す。典型的な生存速度論的実験の結果は、ウイルス誘発性細胞変性効果による細胞指数の低下を示す。CIT50は、どのウイルスが研究環境において最大の安定性を有するかを決定するために、各条件における各ウイルスのウイルス不活性化勾配を計算するために使用することができる。ウイルスの安定性は間接的に不活化勾配と相関し、例えばA型インフルエンザウイルスに関与するヘマグルチニン糖タンパク質中のアミノ酸残基が同定される宿主外での生存を可能にする。この手法は、小さなバリエーションに非常に敏感です。したがって、実験間で再現性のある結果を得るためには、自動セルカウンタを使用することが奨励されている。この方法は、異なるウイルスの複製を比較したり、一度に複数の細胞株のウイルス指向性を調査したり、ウイルスサイクルの特定のステップを研究したりするためにも使用できます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

このビデオでは、細胞インピーダンスアッセイを介して、接着細胞の増殖を含む細胞イベントのリアルタイムモニタリングのプロセスを実演します。ここでは、接着細胞が絶縁体として機能し、電極間の電流の流れを制限し、インピーダンスを増加させます。...

細胞プロセスをリアルタイムでモニタリングするための細胞インピーダンスベースの解析

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ウイルス感染のライブイメージングと定量化のためのルシフェラーゼ蛍光レポーターインフルエンザウイルス

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ウイルスの核酸とタンパク質を視覚化し、HIV、HTLV、HBV、HCV、ジカウイルス、インフルエンザ感染を監視するためのシングルセルマルチプレックス蛍光イメージング

現在の研究では、リアルタイム細胞解析(RTCA)システムを使用して、ウイルス感染中のヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の変化を監視するプロトコルについて説明します。...

インピーダンスに基づくリアルタイム細胞解析を用いたウイルス感染時のヒト臍帯静脈内皮細胞の変化のモニタリング

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インピーダンスを用いた自動ウイルスタイター定量のための、軽量でラベルフリーのリアルタイム50%組織培養感染線量(TCID50)アッセイ

学ぶリアルタイム細胞インピーダンス解析によるインフルエンザウイルス生存率の定量法。MDCK細胞を用いた電気インピーダンスモニタリングで、環境条件下でのウイルス動態を正確に評価できます。

リアルタイム細胞解析を用いた宿主外でのインフルエンザウイルスの生存率のモニタリング

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