リアルタイム細胞解析を用いた宿主外でのインフルエンザウイルスの生存率のモニタリング

様々な粒子定量化のための方法は、ほとんどの生物学研究の重要な側面を表す。このプロトコルにより、リアルタイムでウイルスデータの正確な定量化が可能になります。この手法は、ウイルスデータの従来の測定に取って代わります。

客観的なリアルタイムデータにより、信頼区間を下回り、労働集約的なエンドポイントの評価を回避します。この方法は、細胞変性作用を誘導する全てのウイルスに用いることができる。手順を実演するのは、私たちの研究室の検査技師であるQuentin Grassinです。

H1N1ウイルスを増殖および増幅するには、標準的なプロトコールに従って、2つの75平方センチメートル組織培養フラスコに6個のMDCK細胞を10回7.5回シードし、90〜100%コンフルエントに達するまで摂氏37度で24時間インキュベートする。翌日、1回の洗浄につきフラスコ当たり5ミリリットルの滅菌PBSで細胞を2回洗浄し、1つのフラスコを対照としてラベル付けした。次に、A型インフルエンザウイルスストックの解凍バイアルを、新鮮なウイルス増殖培地を含む1.5ミリリットルのチューブで適切な実験濃度に希釈する。

希釈原液の1ミリリットルを使用して、10倍から陰性3まで、または10倍から陰性4プラーク形成単位までの感染の多重度でMDCK細胞に感染させ、1ミリリットルのウイルス増殖培地を対照フラスコに加える。室温で45分間、15分ごとに攪拌しながらウイルスを細胞に吸着させる。インキュベーションの最後に、接種物を除去し、ウイルス性ヘマグルチニンHA0のHA1およびHA2サブユニットへの切断を容易にするために、TPCKトリプシン1ミリリットル当たり1マイクログラムを添加した15ミリリットルのウイルス増殖培地と交換する。

その後、フラスコを摂氏35度のインキュベーターに3日間入れます。インキュベーションの最後に、光学顕微鏡で40倍の対物レンズ下で各培養物中の細胞を比較し、細胞に対する細胞変性効果を評価します。細胞変性効果が完了したら、細胞培養上清を15ミリメートルチューブに加え、遠心分離によって各培養物から細胞破片を回収する。

次いで、清澄化されたウイルス培養上清を15ミリリットルのチューブに移し、後代ウイルスをマイナス80°Cの保存のために使い捨ての滅菌極低温バイアルにアリコートする。細胞感染に適切な細胞量を決定するには、PBSで細胞を洗浄し、37°Cでフラスコあたり0.25%トリプシン-EDTAの3ミリリットルで45分間インキュベーションしてそれらを回収する前に、実証されているように、約80%コンフルエントMDCK細胞培養物を24時間調製する。細胞が剥離したら、フラスコあたり7ミリリットルの新鮮な培養液で反応を停止し、各培養物から細胞を計数した。

細胞を細胞培養培地1ミリリットル当たり10~5番目の細胞を4倍に希釈し、指示通りに細胞の2倍段階希釈を行う。Eプレートを室温で数分間置いてから、Eプレートの電極に触れることなく各ウェルに100マイクロリットルの細胞培養培地を添加する。クレードルのロックを解除し、プレートフロントエンドをインピーダンス測定器のクレードルポケットに挿入します。

インキュベーターのドアを閉じ、ソフトウェアを開きます。[既定の実験パターン設定] で、選択したクレードルを強調表示し、トップ ページをダブルクリックして実験の名前を入力します。「レイアウト」(Layout) をクリックし、プレートの選択した各ウェルに必要なサンプル情報を入力します。

[スケジュール]、[手順]、[手順の追加] をクリックします。ソフトウェアは自動的にバックグラウンドインピーダンスを測定するための1秒のステップを追加します 実行と開始、続行をクリックします。「プロット」および「追加」をクリックして適切なウェルを選択し、バックグラウンド・インピーダンスが負の 0.1 から 0.1 の間であることを確認してから次のステップに進みます。

次に、クレードルからプレートを取り出し、各細胞懸濁液100マイクロリットルを適切なウェルに二重に加える。Eプレートを層流フードに室温で30分間放置して、Eプレートをクレードルポケットにロードする前に、ウェルの底部に細胞を均一に分布させます。[スケジュール] と [ステップの追加] をクリックし、値を入力して 30 分ごとにセルを監視し、[開始]、[続行] の順に選択する前に、200 回の繰り返しを確認します。

細胞インピーダンスデータを確認してプロットするには、[プロット]をクリックし、播種後24時間で静止期の直前の細胞の濃度を選択して、ウイルス感染中にまだ増殖段階にある細胞を取得します。CIT50値と感染の多重度との相関関係を決定するために、電子マイクロタイタープレートの各ウェルに10~4個目の新たに分割したMDCK細胞を24時間3回培養した後、1ウェルあたり100マイクロリットルの新鮮なウイルス増殖培地で細胞を2回洗浄し、洗浄につき、シングルチャンネルピペットを用いて、各ウェルに100マイクロリットルのウイルス懸濁液を加えた。すべてのウイルス希釈液が加えられたら、プレートを摂氏35度で機器のクレードルポケットに静かにロードし、実証されているように、少なくとも100時間、15分ごとにセルインピーダンスの監視を開始します。

2サイクルの測定後、クリックして装置を一時停止し、Eプレートをクレードルから取り外します。TPCKトリプシンを添加したウイルス増殖培地100マイクロリットルを各ウェルに加え、Eプレートをクレードルポケットに戻す。次に、解析を開始します。

A型インフルエンザウイルスの生存動態を評価するために、蒸留水中に1リットル当たり35グラムの最終濃度に塩化ナトリウムを加え、得られた生理食塩水900マイクロリットルを2ミリリットルのクライオチューブに加える。各クライオチューブに100マイクロリットルのウイルスストックを加え、チューブを摂氏35度のインキュベーターに適切な実験期間置きます。インキュベーションの終了前日に、16ウェルマイクロタイタープレートに1ウェルあたり10〜4番目に分割されたMDCK細胞および100マイクロリットルのウイルス増殖培地を3回繰り返しステップでシードし、ウェルの底部への細胞のバックグラウンドインピーダンスおよび均一な分布の測定を可能にする。

その後、細胞を摂氏37度および5%の二酸化炭素で24時間増殖させる。翌日、細胞を2回洗浄し、次いで、実証したように、新鮮な培養培地で10倍に希釈した100マイクロリットルの生理食塩水蒸留ウイルスで細胞を感染させ、少なくとも100時間にわたって15分ごとに細胞インピーダンスを監視する。ここでは、異なる濃度のMDCK細胞で120時間後に得られた生データが示されている。

24時間後、細胞指数測定は、3倍の10〜4番目の細胞を播種したウェル内の細胞がまだ増殖の指数関数的な段階にあることを明らかにしたので、この細胞濃度をその後の実験に使用した。MDCK細胞培養物は、CIT50とインフルエンザウイルスによる感染の初期多重度との間に明確な線形関係を示す。典型的な生存速度論的実験の結果は、ウイルス誘発性細胞変性効果による細胞指数の低下を示す。

CIT50は、どのウイルスが研究環境において最大の安定性を有するかを決定するために、各条件における各ウイルスのウイルス不活性化勾配を計算するために使用することができる。ウイルスの安定性は間接的に不活化勾配と相関し、例えばA型インフルエンザウイルスに関与するヘマグルチニン糖タンパク質中のアミノ酸残基が同定される宿主外での生存を可能にする。この手法は、小さなバリエーションに非常に敏感です。

したがって、実験間で再現性のある結果を得るためには、自動セルカウンタを使用することが奨励されている。この方法は、異なるウイルスの複製を比較したり、一度に複数の細胞株のウイルス指向性を調査したり、ウイルスサイクルの特定のステップを研究したりするためにも使用できます。