Name: ワームアライメントとWorm_CP、カエノハブディティス・エレガンスから得られた蛍光画像データの矯正と定量化のための2つのオープンソースパイプライン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: 学ぶWorm-alignとWorm_CPを用いたC. elegans蛍光画像の矯正・定量化法。FIJIベースのオープンソースパイプラインで、重なったワームの解析を容易にし、CellProfilerとの連携により正確な蛍光強度の定量化を実現します。

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BIOCEV(プラハ、チェコ共和国)のクリスチャン・ランクトー博士に、固定ワームを取り付ける口マイクロピペット技術と、口のマイクロピペットの安全セットアップを共有してくれたファティマ・サントス博士とデビー・ドラゲ博士に感謝します。また、フランチェスカ・ホッジが原稿を編集してくれたことに感謝します, シャーリーン・マードックとバブラハム研究所の彼らのサポートのために.OC は、ERC 638426 および BBSRC [BBS/E/B000C0426]でサポートされています。

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著者らは開示するものは何もない。

ワームアライメントは、ユーザーが選択したワームのモンタージュを容易に生成するフィジーベースの画像処理パイプラインで、ワームを矯正し、視覚的な比較、分類、表現を支援します。この機能は、いくつかの既存のツール、特に CellProfiler7の WormToolbox モジュールでも提供されていますが、Worm-align は比較的少ない事前イメージ解析経験を必要とします: ユーザーはモンタージュ (および分析) に選択したいワームを追跡するだけで済みます。生画像データ上のワームのトレースは簡単なプロセスですが、特にタッチスクリーンコンピュータやタブレットが利用可能な場合は、ワームの縦軸に沿って線が正しく描画されるという最も重要です。不完全な行は、ワームの一部に続くもので、CellProfiler 分析中にモンタージュ (つまり、尾端の頭部が欠落しているワーム) に部分的なワームが生じ、部分的なセグメンテーション マスクが発生します。また、2つの個々のワームの線が交差する場合、ワームは、蛍光定量化のためだけでなく、ワームのアライメントモンタージュで正しく処理されません。品質管理のために、元の画像上のライン選択のオーバーレイ画像は、QCテーブルと一緒にデータフォルダに保存されます。これらのことから、誤ったセグメント化されたワームにつながる問題のあるラインを容易に識別し、モンタージュおよび/またはその後の分析から除外することができます。
実験者からの直接の入力は、おそらく少し時間がかかるように思えますが、異なる発達段階のワームが同じ画像に存在する実験では、他の人よりもワークフローの明確な利点を提示します: ワームは、正しい発達段階にあるワームのみを概説することによって、「トレースステップ」の間に選択することができます。また、ワームの長さ/サイズの両方の信頼性の高いインジケーターである、トレース ラインの長さ、またはセグメンテーション マスクの領域に基づいて、Worm_CPからの出力を使用して、ワームをフィルタリングすることもできます。間違いなく、機械学習アルゴリズムは、DIC画像のサイズと外観が非常に異なっているので、異なる発達段階からのワームを認識するのに苦労するかもしれません。
Worm-alignの出力は、フィジーの直接または他の画像解析ソフトウェアプラットフォームで、単一ワームにおける蛍光強度の後続の定量に使用できます。ワームアライメント出力を単純なCellProfilerパイプライン(Worm_CP)にインポートすることで、ワームアライメントパイプラインの実行中に選択された個々のワームのマルチチャネル蛍光強度を定量化できます。CellProfilerソフトウェアの柔軟性のためにこのアプローチを選択しました:個々のワームの追加機能(例えば、脂質滴、またはストレス顆粒、核、ミトコンドリアのサイズを測定する)を分析するために、パイプラインに追加のモジュールを組み込むのは簡単です。さらに、単一のワーム マスクを使用して、WormToolbox7の新しいモデルをトレーニングする可能性があります。
この方法の主な利点は、高速であり、簡単なワームマウントセットアップが必要です。この方法は、ソフトウェアの操作を学習したり、マシンアルゴリズム7を介してトレーニングセットを実行する時間を必要としないため、より高速です。さらに、この方法は、単に通常のアガロースパッドに取り付けられたライブまたは固定ワームのいずれかで動作します。他の方法5、6で開発された複雑なマイクロ流体室を使用する必要はありません。

比較的単純な生物である線虫C.エレガンスは、ヒトの病気を研究するのに非常に有用なモデルシステムです。C.エレガンスゲノム中の遺伝子の約38%はヒト1,2に機能的な対応を有する。C.エレガンスのユニークな特徴の1つは、光学的に透明であり、組織全体の蛍光レポーターの(サブ)細胞発現に関するin vivo情報に簡単にアクセスできる点です。これにより、C.エレガンスは、画像ベースのプラットフォーム3を使用して、コンテンツの多い画面のための主要なモデル生物になります。しかし、これらの研究を複雑にすることが多い問題の1つは、ワームの密集した集団をイメージングすると、交差してクラスター化する傾向があり、個々のワーム間の比較が困難になり、下流の画像分析と定量が曇るということです。
この問題を解決する既存のソリューションは、通常、マイクロ流体セットアップ4を使用するなど、培養およびイメージングプロトコルの最適化に依存しており、単一のワームを別々の画像5,6にキャプチャできるようにします。他の人は、束の集団であっても、単一のワームの認識を可能にする機械学習アルゴリズムを適用しています。後者の優れた例は、オープンソース画像解析プラットフォームCellProfiler7のモジュール拡張であるWormToolboxです。WormToolbox は、C. elegansの分析に高スループットと高コンテンツソリューションを提供し、追加の分析モジュールを簡単に含めることができるため、CellProfiler に含めることによって明らかにメリットを得ています。ワームツールボックスには事前にトレーニング済みのモデル (DefaultWormModel.xml が付属していますが、通常は新しいアプリケーションごとに機械学習アルゴリズムの再トレーニングが必要です。これを行う方法についてのオンラインチュートリアルは、Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/) で入手できます。それにもかかわらず、WormToolboxをインストールして使用するには、初心者のユーザーに多大な時間投資が必要です。
ここでは、文化に対するシンプルでコスト効果の高いプロトコル、および C.エレガンスの画像集団について説明します。取得した画像の個々のワームの評価を可能にするために、ワームアライメントという名前の単純なオープンソースのFIJIベースのワークフローを開発しました。ワームアラインは、矯正された、整列したワームのシングルまたはマルチチャネルモンタージュを生成するために使用することができます。まず、ユーザーは、ヘッドからテールに線を引くことによって、解析のために個々のワームを手動で選択する必要があります。ワームアライメントは、この選択を使用して、選択したワームを概要イメージから切り取り、選択したワームをまっすぐにして整列して、視覚的な比較とプレゼンテーションを容易にするモンタージュを生成します。
さらに、Worm-alignの出力は、フィジーの直接または他の画像解析ソフトウェアプラットフォームで、単一ワームにおける蛍光強度の後続の定量に使用することができます。このことを示す方法は、ワームアライン出力を、オープンソースの CellProfiler ソフトウェアを使用するパイプラインであるWorm_CPにインポートすることです。CellProfilerの柔軟性により、高コンテンツスクリーニング用の追加モジュールを組み込むことが可能です。Worm_CPパイプラインを使用して、高温8などのストレッサーによって誤って折り畳まれるタンパク質を再折する十分に保存された保護機構であるヒートショック応答を定量化しました。具体的には、ヒートショック誘導性遺伝子のプロモーターであるhsp-70(C12C8.1)が緑色蛍光タンパク質(GFP)9を駆動する、統合マルチコピートランスジーンを運ぶワームにパイプラインを適用した。また、C.エレガンス10の主な脂肪貯蔵小器官である脂質滴(LD)を視覚化する蛍光色素で標識された固定動物に対するWorm_CPパイプラインを使用した。このワークフローには WormToolBox が提供するスループットはありませんが、画像ベースのC. elegans実験の視覚的な表示と分析のためのユーザーフレンドリーで簡単な代替手段です。

<table><tbody><tr><td>アガロー</td>ス <td>MeLford Biolaboratories Ltd</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td>吸引器チューブ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td>口のマイクロピペットを作成 (プロトコルの手順を参照)</td></tr> <tr><td>ビーカー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BODIPY 493/593</td><td>Invitrogen</td><td>D3922</td><td>ストック溶液 DMSO で 1mg/mL</td></tr><tr><td>遠心分離</td>機 <td>MSE MISTRAL 1000</td><td></td><td></td></tr> <tr>で調製<td>円錐フラスコ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>VWR631-0120</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フィルター0.2&micro;シリンジ</td><td>Sartrius</td><td>16534-K</td>フィルターのためのm<td>は、口のマイクロピペットを作成するために(プロトコルのステップを参照)</td></tr>M9<tr><td>液体窒素</td><td></td><td></td>液体<td>窒素施設</td></tr>低保持のヒント1000&micro<tr><td>でレバミゾールを溶解することによって調製</td>されたイソプロパノール<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>レバミソール塩酸塩シグマアルドリッチBP212 3mM溶液<tr><td>;L</td><td>Starlab</td><td>S1182-1830</td><td></td></tr>メタ<tr><td>ノール</td><td>VWR化学薬品</td><td>20847.307</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド、MENZEL GLASSER</td><td>Thermo Scientific</td><td>BS7011/2</td><td></td></tr>顕微鏡ニ<tr><td></td><td>コン</td><td></td><td>エクリプスTi</td></tr>電子レンジ<tr><td></td><td>デロンギ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M9</td><td></td><td></td>は<td>、15< / supに従ってラボで準備されました></td></tr><tr><td>9cm NGMプレート</td><td></td><td></td> ラボで調製された<td>15</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr>に従ってラボで調製 <tr><td>Protein LoBind Tube 2ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>SIGMA</td><td>T9284-500ML</td><td></td></tr><tr><td>リングキャップ</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Z611247-250EA</td><td>口を作るためのガラス製マイクロキャピラリーチューブマイクロピペット(プロトコルのステップを参照)</td></tr><tr><td>ローテーター</td><td>スチュアートサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリコンチューブ半透明</td><td>の科学実験室サプライヤー</td><td>TSR0600200P</td><td>6.0ミリメートル×2.0ミリメートルの壁 - 口のマイクロピペットを作成するために(プロトコルのステップを参照)</td></tr><tr>滅菌<td>H2O</td><td></td><td></td><td>MilliQ水ラボ10&マイクロでオートクレーブ滅菌;</td></tr><tr><td>L Tips</td><td>Starlab</td><td>S1120-3810</td><td></td></tr><tr><td>200&micro;L Tips</td><td>Starlab</td><td>S1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>1000&micro;L Tips</td><td>Starlab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>15mL 遠心分離チューブ</td><td>CORNING</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>Vecta Shield</td><td>VECTOR</td><td>94010</td><td>色あせ防止封入剤 (H-1000) DAPIなし</td></tr></tbody></table>

ワームアライメントとworm_cp、カエノハブディティス・エレガンスから得られた蛍光画像データの矯正と定量化のための2つのオープンソースパイプライン

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

固定または麻酔付き C. elegans から画像データを取得する際に頻繁に発生する問題は、ワームが近隣のワームと交差してクラスター化することです。この問題は、ワームの密度の増加に伴って悪化し、イメージングと定量化の課題を生み出します。私たちは 、C.エレガン スの生画像データからユーザーが選択した、まっすぐに整えられた、整列したワームの単一または複数チャネルのモンタージュを生成するために使用できるFIJIベースのワークフロー、ワームアライメントを開発しました。ワームアラインは、ユーザーまたは解析アルゴリズムの事前トレーニングを必要としない、シンプルでユーザーフレンドリーなワークフローです。ワームアライメントで生成されたモンタージュは、ワームの目視検査、分類および表現を支援することができます。さらに、Worm-alignの出力は、フィジーの直接または他の画像解析ソフトウェアプラットフォームで、単一ワームにおける蛍光強度の後続の定量に使用することができます。このことを示す方法は、ワームアライン出力を、オープンソースの CellProfiler ソフトウェアを使用するパイプラインであるWorm_CPにインポートすることです。CellProfilerの柔軟性により、高コンテンツスクリーニング用の追加モジュールを組み込むことが可能です。実際の例として、2つのデータセットにパイプラインを使用しました:最初のデータセットは、熱ショック誘導可能な遺伝子 hsp-70のプロモーターの制御下にある緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するヒートショックレポーターワームの画像であり、2番目のデータセットは、蛍光色素を有する脂肪店に染色された固定ワームから得られた画像である。

ワームアライン/Worm_CPは 、Caenorhabditis elegans サンプルをまっすぐにして整列させ、事前のトレーニング手順を必要とせずにワーム画像ベースのアッセイを採点するために使用できるシンプルなFIJI /CellProfilerワークフローです。生きた動物の熱ショック誘発発現や固定試料中の脂質滴の定量化に、ワームアライメント/Worm_CPを適用しました。

ワームアライメントとWorm_CP、カエノハブディティス・エレガンスから得られた蛍光画像データの矯正と定量化のための2つのオープンソースパイプライン

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...

ここでは、ワームアライメントという名前の単純なオープンソースフィジーベースのワークフローを説明し、これを使用して、生の顕微鏡画像から関心のある矯正ワームの単一または複数チャネルのモンタージュを生成することができます。このワークフローはユーザーが選択した対象の動物に依存するため、ワームがすべて正しい段階または条件でない C.elegans の画像を分析する場合に特に便利です。ワームアライメントの出力は、フィジーまたは他の画像解析ソフトウェアを用いた蛍光のその後の定量に使用できることに留意すべきである。ここでは、CellProfiler パイプラインWorm_CPを使用した蛍光定量を示します。 ブンゼンバーナーの炎の中に薄いガラス毛管を伸ばして口マイクロピペットを作成します。炎の延長後、延長後に毛細血管を2つに分割しなかった場合は、2つに分割します。2つに分けた場合は、最も長い端を切ります。長い部分を選択し、水を吸引しようとすることによって毛細血管が開いているかどうかをテストします。アダプターを 3 ミリメートルシリコンチューブから取り外します。ガラスキャピラリーを6ミリメートルのシリコンチューブに接続されたキャピラリーアダプターに差し込みます。その後、6ミリメートル管のもう一方の端を0.2マイクロメートルのフィルターに差し込み、もう一方の端に3ミリメートルのシリコーンチューブを差し込みます。3ミリメートルシリコンチューブの自由端に1ミリメートルのフィルターチップを差し込み、液体を吸引します。解剖顕微鏡の下で、口マイクロピペットで固定ワームのペレットの周りにできるだけ多くの液体を取り除きます。10マイクロリットルの取り付け媒体をチューブの底部に素早く加えます。PBSで10マイクロリットルのチップを洗浄剤の痕跡で洗い、ワームがプラスチックピペットチップの側面に付着するのを防ぎます。その後、先端の端をハサミで切ります。前に準備されたアガロースパッドにワームと取り付け媒体の8マイクロリットルを移します。顕微鏡下でスライドを観察しながら、ワームの重なりを避けるために穏やかに攪拌します。その後、アガロースパッド上の取り付け媒体の落下を18 x 18ミリメートルのカバースリップで覆います。生きたワームをマウントするには、3ミリモルレバミソールのピペット3〜4マイクロリットルをM9に溶解し、アガロースパッドに取り付けます。レバミソールのドロップに条件ごとに30〜50ワームを選びます。その後、18 x 18ミリメートルのカバースリップでドロップをカバーし、1時間以内にワームを画像化します。オープンソースイメージ分析ソフトウェアパッケージFijiをImageJからインストールするか、既にコンピュータにインストールされている場合は、バージョン1.52A以降であることを確認してから、Worm-alignリポジトリをGitHubからダウンロードしてコンピュータに保存します。すべてのパイプラインコンポーネントがダウンロードされ、インストールされたら、フィジーを開き、プラグイン、マクロをクリックしてワームアライメントマクロを実行し、メインメニューバーで実行します。ワーム位置合わせを見つけます。ijm スクリプトをクリックし、[開く] をクリックします。解析対象の画像が含まれる入力フォルダに移動し、[select]をクリックして、選択したフォルダに画像ファイルのみが含まれていることを確認します。マクロは、すべての結果が保存される出力フォルダーを自動的に生成します。フォルダーの名前は、ポストフィックスとして出力を持つ入力フォルダーと同じになります。入力フォルダー内の最初の画像を開き、それを代表画像として使用して、ワームの幅、明るさ、コントラストなど、モンタージュの生成に必要な設定を抽出します。直線描画ツールを使用して、ワームの幅を横切って線を引き、[OK]をクリックします。この行の長さを使用して、単一ワームのトリミング領域の高さを決定します。各チャネルに対して、名前、参照テーブル、およびモンタージュに含めるかどうかを指定し、[OK] をクリックします。次に、スライダーを使用してチャンネルの明るさとコントラストの設定を調整します。残りのチャネルに対してこのプロセスを繰り返します。すべての設定を構成すると、設定テーブルに記録され、出力フォルダーの CellProfiler サブフォルダーに保存されます。設定の適用後にすべての画像がどのようなものになるかを示すために、画像が生成されます。画像が満足のいく場合は、トップボックスにチェックを入れます。チェックの 2 番目と 3 番目のボックスすべての設定パネルは、モンタージュの生成のオプションを指定します。両方のボックスにチェックを入れたまま、[OK] をクリックしてマクロの残りの部分を実行します。トップ ボックスにチェックを付けられなかった場合、マクロはセットアップを再実行します。次に、マクロは入力フォルダ内のすべての画像を開きます。各画像について、セグメント化された線ツールまたはフリーハンドラインツールを使用して、モンタージュに含まれるすべてのワームの縦軸に線を描画します。ワームの全長に沿って頭から尾まで、またはその逆に一貫して線を引き、必要なすべてのワームが追加されたら、[OK]をクリックして[コントロール]をクリックしてROIマネージャに各線を追加します。その後、ワームアライメントによって、選択した 1 つのワームのトリミングされたイメージが生成され、出力フォルダの単一のワーム サブフォルダに保存されます。選択したすべてのワームのモンタージュは、整列されたフォルダに保存されます。ダウンロード ページで以前の CellProfiler リリースのリンクをクリックし、必要なオペレーティング システムを選択して、CellProfiler 2.2.0 をダウンロードしてインストールします。Worm_CPパイプラインを開始する前に、期待されるすべての出力イメージが Worm-align 出力フォルダーの CellProfiler サブフォルダーに存在することを確認します。元の画像の処理済みコピー、ワーム集団のバイナリ画像マスク、選択したワームに線が引かれている場合はマスクを整列し、元の画像の各チャンネルを表す画像を1つ揃える必要があります。CellProfilerを開き、画像入力モジュールをクリックし、ここにファイルとフォルダをドロップすると言うウィンドウにCellProfilerモジュールフォルダをドラッグします。以前の分析から画像のリストが表示されている場合は、まずウィンドウ内で右クリックして [ファイルリストのクリア] を選択して、これらを削除します。メタデータ入力モジュールをクリックし、2 番目の抽出方法で黄色のフォルダーをクリックし、ワーム位置合わせ出力フォルダーの CellProfiler サブフォルダーに移動します。設定ファイルを選択し、[更新]をクリックします。次に、名前と型の入力モジュールをクリックし、パイプラインに必要なすべてのイメージが存在することを確認します。パイプラインを実行する前に、出力モジュールで出力結果の出力先を選択します。テスト モードを使用して、[テスト開始] モードをクリックしてパイプラインのパフォーマンスを確認し、フォルダー内の最初のイメージを実行できるようにします。パイプラインのパフォーマンスに満足したら、[テスト モードの終了] をクリックしてイメージを分析します。分析を開始する前に、解析モジュールの前のすべての目が閉じられていることを確認します。分析が完了したら、2 つの CSV ファイル、ワーム CSV と行 CSV で構成される Worm_CP出力フォルダーを開きます。このプロトコルに記載された方法に従ってC.elegansを培養およびイメージングすると、ワーム集団の大規模な概観画像が生成される。パイプラインの出力は、画像の上に描画される線の品質に大きく依存します。ここでは、いくつかの行の例と、ワームアラインからの出力を示します。ワームアライメントスクリプトを使用する場合、データサブフォルダにあるオーバーレイ画像やモンタージュ内の個々のワームのパネルから、交差するワームの視覚的な識別が可能です。QCテーブルは、重複するワームを識別するためにも使用できます。ただし、交差する線はWorm_CPパイプラインでは問題になります。これは、Worm_CPが個々のワームを識別するために、対象地域ではなくライン マスクを使用するためです。したがって、CellProfiler はワームの 1 つを 2 つのオブジェクトとしてセグメント化します。Worm_CPパイプラインは、脂質滴に組み込まれた蛍光色素で標識された固定動物からの蛍光強度を定量化するために使用されています。脂質滴の含有量は手動定量を使用して野生型と変異型DBL1動物の間で17%減少し、Worm_CPパイプラインを使用して12%減少する。Worm_CPは、熱ショック誘導性遺伝子の制御下でGFPを発現する生きたワームの熱ショック応答を定量化するためにも使用された。熱ストレスがない場合、ワームはGFP発現を誘発しなかった。ワームが短い熱ショックとして暴露されると、GFP発現が誘発される。Worm_CPの出力は、ワームアライメントを使用して描画する線の品質に大きく依存します。線が接触または重ならないようにして、すべての線を同じ方向に描画します。QC テーブルをチェックすると、接触またはオーバーラップしているラインを識別し、解析からそれらのケースを除外することができます。ワームアラインの出力は、フィジーまたはその他の画像解析ソフトウェアパッケージで、後続の定量に使用できます。ここでは、脂質滴の数をカウントしたり、ワーム内の個々の液滴の強度を定量化したりするなど、他の分析モジュールを非常に簡単に組み込むことができる非常に基本的なCellProfilerパイプラインを示しました。この技術の利点の1つは、個々のワームからの蛍光を迅速に定量する可能性である。私たちの研究室では、蛍光レポーターを使用して個々の生存率に関心を持っており、この目的のためにワームアライメントとWorm_CPを日常的に使用しています。

worm-align-wormcp-two-open-source-pipelines-for-straightening

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生物学

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