カエノハブディティス・エレガンスを使用して組織特異的シャペロン相互作用をスクリーニングする

遺伝的に追跡可能なデザインである線虫Caenorhabditis elegansにおける次の実験の全体的な目標は、組織特異的なシャペロン相互作用を特定することです。この手法の主な利点は、Golan AIのフィッティングやビヘイビアリードアウトなどの使いやすいアッセイを組み合わせて、新しい組織特異的な相互作用を明らかにすることです。ストレスのない胚の同期のためには、ワームピックを使用して、非同期のワームプレートから新たに装着したNGMプレートに約100個の卵子を移動させ、適切な実験スケジュールに従って動物を培養します。

動物が産卵の初日に達したら、細菌の芝生から離れたプレートに1ミリリットルのM9バッファーをゆっくりと追加し、バッファーがプレートを完全に覆うようにプレートを回転させます。プレートを片側に傾けて液体を取り除き、プレートから動物を洗います。プレートからすべてのワームを洗い流したら、標準的なプラスチック製のピペットチップを使用して、卵が集中している周りの寒天を正方形に切り取り、新しく取り付けたNGMプレートに寒天のピースを置きます。

同じ培養条件下で卵を培養します。インキュベーションの終わりに、プレートは同期卵で覆われるべきです。先ほど示したようにプレートからすべての動物を洗い流した後、1ミリリットルの新鮮なM9バッファーを追加し、セルスクレーパーを使用してプレートから卵を放出します。

すべての卵が取り除かれたら、プレートから全量のバッファーを円錐形のチューブに移して遠心分離します。チューブを遠心分離し、上清を捨てます。上清を取り除いた後、プレートとピペットで最大1ミリリットルの新鮮なM9バッファーをプレートとピペットで追加して卵を再懸濁します。

先ほど示したように、卵をさらに5回洗います。最後の洗浄後、卵ペレットは白く見えるはずで、最後の200マイクロリットルの上澄みを除くすべてを取り除くことができます。実験のために同期線虫を培養するには、バクテリアの芝生と各干渉RNA着座プレートの近くに約30個の卵をドロップし、バクテリアを含む空のベクターを座らせたプレートに約30個の卵を置きます。

次に、実験プロトコルに従って適切な培養条件下で動物を栽培します。同期した動物の胚致死率を評価するには、動物が産卵を開始したら、約100個の卵を空のプレートに移し、卵を列に広げてカウントを簡素化します。24〜48時間後、孵化していない卵の割合を採点します。

参考までに、実験動物の卵子を空のベクターコントロール細菌で処理した動物の卵子と比較してください。麻痺アッセイを設定するには、年齢同期した動物を空のベクターコントロール細菌で培養し、動物が成体になるまで、ただし産卵が始まる前に培養します。通常のNGM寒天プレートの裏側に細いマーカーで線を引き、印のついた線に5〜10匹の動物を置きます。

タイマーを10分に設定し、麻痺したワームとしてラインに残っている動物の割合をスコアリングします。参考までに、このデータを空のベクターコントロール細菌で増殖した変異動物の割合と比較してください。タンパク質ノックダウンバリデーションでは、250〜300個の同期卵子を、関連する二本鎖RNA発現または空のベクターを含む細菌を装着した60mmのNGM干渉RNAプレートに置き、適切な実験期間で卵を培養します。

インキュベーションの終わりに、合計200匹の若い成体動物を、動物の培養温度に維持された200マイクロリットルのPBSTを含む1.5ミリリットルのチューブのキャップに移します。キャップを慎重に閉め、動物をGの1000倍で1分間遠心分離します。遠心分離の最後に、800マイクロリットルの新鮮なPBSTをチューブに加え、ワームを再度遠心分離します。

上清の上部900マイクロリットルを慎重に取り除き、示したように、線虫を新鮮なPBSTでさらに3回洗います。最後の洗浄後、上清の最後の100マイクロリットルを除くすべてを取り除き、25マイクロリットルの5Xサンプルバッファーを動物に加えます。サンプルを摂氏92度、毎分1000回転で10分間加熱してから、各サンプルの20マイクロリットルをSDSページゲルにロードします。

次に、適切な抗体を使用してウェスタンブロット解析を行い、目的のタンパク質の相対安定性を決定し、デンシトメトリーソフトウェアを使用してバンの強度を決定します。発生中にHSP6をノックダウンすると、野生型動物では強力な発生停止がもたらされます。同時に、野生型RDE1を発現する筋肉特異的干渉RNA株にHSP6をノックダウンしても、発生停止は起こらない。

一方、HSP6は、腸細胞で野生型RDE1を発現する腸特異的RNAI株をノックダウンすると、強力な発生停止と表現型をもたらします。したがって、軽度の成長遅延を引き起こすHSP6 MG585の変異は、その変異遺伝子を運ぶ株を腸内特異的干渉RNA株に交配し、シャペロン干渉RNAライブラリーをスクリーニングすることにより、シャペロン相互作用の悪化または緩和をスクリーニングするために使用できます。STI1、AHSA1、またはDAF41干渉RNAで処理されたミオシン組織およびUNC45変異動物は、第4幼虫期の野生型線虫のそれと類似している。

突然変異体は、成人期に達した後、混乱したサルコメアを示しますが。対照的に、エンプティベクターコントロールで処理されたUNC45変異動物と野生型動物はどちらも影響を受けないままである。遺伝的相互作用は、物理的な相互作用を示すものではありません。

したがって、遺伝的相互作用スクリーニングを用いた追跡実験を実施して、同定された相互作用の性質を検証し、直接調べる必要があります。