Name: カエノハブディティス・エレガンスを使用して組織特異的シャペロン相互作用をスクリーニングする (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 学ぶ組織特異的シャペロン相互作用のスクリーニング法。Caenorhabditis elegansを用いた合成相互作用スクリーンとRNA干渉により、組織レベルでのタンパク質機能不全を評価し、新たな相互作用を同定します。

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私たちは、線虫株の一部のために、NIH国立研究資源センター(NCRR)が資金を提供するカエネルハブディティス遺伝学センターに感謝します。H.F. エプスタインによって開発されたモノクローナル抗体は、NICHDの後援の下で開発され、アイオワ大学生物学部によって維持された開発研究ハイブリドーマ銀行から得られました。本研究は、イスラエル科学財団(278/18)、イスラエル科学技術省、外務省、イタリア共和国国振興総局(助成金第3-14337)からの助成金によって支援されました。この原稿の作成に協力を寄せられるよう、Ben-Zvi研究室のメンバーに感謝します。

1. RNAi用線虫増殖培地プレートの製造
<ol><li>1 Lボトルに、NaClの3g、バクトペプトンの2.5g、寒天17g、蒸留水1Lとオートクレーブを加えます。</li>
	<li>55°Cに冷却ボトル。</li>
	<li>25 mLの1 M KH2PO4、pH6.0、1 M CaCl2の1 mL、1 M MgSO4の1 mL、コレステロール溶液1 mL(表1)を加え、線虫増殖培地(NGM)を作る。</li>
	<li>1 mL のアンピシリン (100 mg/mL) と 0.5 mL の 1 M IPTG (表 1) を加えて NGM-RNAi 溶液を作ります。 注:一般的に使用されるHT115(DE3) 大腸菌 は、dsRNAコードプラスミドを発現するために使用されるIPTG誘導性T7 DNAポリメラーゼを含んでいます。これらのプラスミドはまた、アンピシリン耐性をコードする。</li>
	<li>ボトルを渦巻いて温かい溶液を混ぜます。</li>
	<li>ボンネット内または滅菌手順を使用して、NGM溶液をプレートに注ぐか、蠕動ポンプを使用して、溶液をプレートに分配します。この画面には、6ウェル、12ウェル、40 mmまたは60mmプレートを使用してください。寒天は、プレートの深さの約2/3を埋める必要があります。</li>
	<li>プレートを室温でベンチで一晩乾燥させ、プレートを覆い続けます。RNAi用のNGMプレートは、最大1ヶ月間4°Cで保存することができます。</li>
</ol>2. RNAi菌の増殖とプレートの播種
<ol><li>ボンネットまたは滅菌手順を使用して、LB溶液のオートクレーブ1 Lにアンピシリン(100 mg/mL)1 mLとテトラサイクリン2.5 mL(表1)を加えて混合します。 注:一般的に使用されるHT115(DE3) 大腸菌 はテトラサイクリン耐性です。</li>
	<li>フード内または無菌手順を使用して、2 mL-深さ96ウェル滅菌プレートの各ウェルに600 μLのLB溶液を追加します。メディアを分配するには、マルチチャネル パイプを使用するのが最適です。</li>
	<li>無菌の手順を使用して、HT115(DE3)大腸菌を有する接種ウェルは、対象遺伝子または空のプラスミドを標的とするdsRNAコードプラスミドで形質転換した。プレートを覆い、一晩で37°Cでインキュベートします。dsRNAを発現する細菌クローンからなるライブラリーは、予測されたC.エレガンス遺伝子の約94%に相当し、以前に22、23に構築され、市販されている。ここで使用されるシャペロン図書館は、リチャード・モリモト研究所26によって建設されました。</li>
	<li>滅菌手順を使用して、種子75、150または250μLの細菌をそれぞれ12ウェル、40mmおよび6ウェルまたは60mmNGM RNAiプレートに入れ。プレート上の標的遺伝子の名前を明確にマークする。細菌は寒天表面の30〜50%をカバーする必要があり、プレートの端に触れるべきではありません。</li>
	<li>プレートを室温でベンチで少なくとも2日間乾燥させ、プレートを覆った状態に保ちます。 注:プレートは一晩で37°Cでインキュベートすることができます。プレートを使用または保管する前に、内側の井戸が乾燥していることを確認してください。すべての長期目的(すなわち、乾燥または貯蔵)のために、プレートを暗闇の中に保ちます。乾燥した、種のプレートは、4 °Cで最大1ヶ月間保存することができます。</li>
</ol>3. 胚の非ストレスな同期
<ol><li>ワームピックを使用して、同期していないワームプレートから新しく播種されたNGMプレートに約100個の卵を移動させます。</li>
	<li>動物を15°Cで5日間、20°Cで3.5日、25°Cで2.5日栽培します。 動物は産卵の最初の日に達する必要があります。 注:ワームは一般的に20°Cで栽培されています。 しかし、異なるシャペロン変異株は、特定の栽培温度を必要としてもよい。例えば、多くの温度感受性株は15°Cで栽培されているが、その表現型を露出させるために25°Cにシフトする。</li>
	<li>1 mLのM9バッファー(表1)をゆっくりと加え、細菌の芝生から離します。バッファーがプレートを完全に覆う状態になるように、プレートを回転させます。その後、片側に傾け、プレートから液体を取り除き、プレートから動物を洗い流します。 注:温度感受性動物やシャペロン変異体を使用する場合は、プロトコルで使用されるバッファを動物の栽培温度で維持するのが最善です。</li>
	<li>ステップ3.3を3回、またはすべての動物がプレートから洗い流されるまで繰り返します。</li>
	<li>標準的なプラスチックチップを使用して、卵が濃縮された洗浄プレートから寒天の正方形をカットし、新しく播種されたNGMプレートの上に寒天の部分を置きます。 注:〜200個の卵は十分な産卵動物を生産するために必要とされます。あまりにも多くの動物があまりにも速く細菌を消費します。低い食品レベルは、プロテオスタシス27に影響を与えることができます。</li>
	<li>動物を15°Cで5日間、20°Cで3.5日、または25°Cで2.5日栽培する。 この時点で、プレートは同期卵で覆われるべきです。 注:動物は、より厳格な同期のために、短期間、新しいプレートにシフトすることができます。しかし、動物は子宮内の卵を保持して同期に影響を与えることができるので、産卵の初期段階でのみ成人を使用することが重要です。</li>
	<li>1 mL の M9 バッファーをゆっくりと加え、細菌の芝生から離します。</li>
	<li>バッファーがプレートを完全に覆う状態になるように、プレートを回転させます。その後、片側に傾け、プレートから液体を取り除き、プレートから動物を洗い流します。</li>
	<li>ステップ3.7を3回、またはすべての動物がプレートから洗い流されるまで繰り返します。</li>
	<li>M9バッファーの1 mLを追加し、プレートから卵を解放するためにセルスクレーパーを使用しています。</li>
	<li>プレートから卵を含むM9バッファーを収集します。</li>
	<li>3,000 x g で卵を含むM9緩衝液を2分間遠心分離する。</li>
	<li>上清を取り出し、M9バッファを追加して1mLのボリュームに到達します。</li>
	<li>卵や細菌の塊を混乱させるために卵を再中断します。</li>
	<li>ステップ3.11-3.13に記載の洗浄手順を5回繰り返します。卵ペレットは白く表示されます。黄色/茶色のままの場合は、白いペレットが得られるまで洗浄を繰り返します。 注:卵に残っている細菌は、dsRNA発現細菌を汚染する可能性があります。</li>
	<li>上清の大部分を取り除き、約200 μLを残します。</li>
</ol>4. 一般的な表現法アッセイ
<ol><li>実験中の動物の栽培<ol>
<li>各RNAiシードプレートの細菌の芝生の近くに〜30個の卵を1滴置きます。参考までに、空のベクター含有(L4440)細菌を播種したプレートに30個の卵を置く。</li>
		<li>NGM RNAiシードプレートで年齢同期性動物を栽培します。実験の期間は、動物が監視される段階と栽培の温度に依存します。温度感受性変異動物を使用する場合は、栽培温度を調整します。発達遅滞動物を使用する場合の栽培期間を調整する。 注意:タイミングはさまざまですが、動物が成人に達すると、産卵(および結果として生じる急速な食物消費)、ならびに年齢依存性プロテオスタシス崩壊28が結果に影響を与える可能性があります。したがって、産卵の開始前に動物を採点することをお勧めします (成人の1日目).野生型動物は、15°Cで4.5日後、20°Cで3日または25°Cで2日後にこの段階に達する。</li>
		<li>繰り返しの回数は、調べた遺伝子セットのサイズによって異なります。シャペロンライブラリー(97遺伝子)については、実験を少なくとも4回繰り返す。母集団の大きさは、使用するアッセイによって異なる。ここで説明した行動アッセイでは、各繰り返しにおいて実験条件ごとに>15匹の動物を採点する。データおよび統計分析も、使用するアッセイの種類によっても大きく左右されます。ここで説明するアッセイのデータは、SEM±手段として提示することができる。</li>
		<li>RNAiと空のベクターコントロール処理動物を独立集団と比較します。P値は、一方向または双方向のANOVAを使用して計算することができ、検査された変化、すなわち単独または両方を悪化または緩和する。単一のRNAi治療と対照を調べる場合、P値は一方向または双方向のマン・ホイットニーランク合計検定を使用して計算することができます。統計的有意性以外に、表現型への影響度に基づいてヒットの閾値を考慮する。</li>
	</ol></li>
	<li>発達停止/遅延<ol>
<li>空のベクター含有対照細菌で成長した動物が成人に達するまで、産卵が始まる前に、ステップ4.1のように年齢同期動物を栽培する。</li>
		<li>体型顕微鏡を用いて動物を監視し、幼虫と成人の数を数え、発達遅延動物の割合を計算する。参考として、空のベクター含有対照菌上で増殖した変異動物と比較する。 hsp-1 または hsp-90 RNAi治療は、野生型動物の発達停止をもたらし、陽性対照として使用することができる。</li>
		<li>発達遅延動物の割合を時間の経過とともにスコアするには、ステップ4.2.2を繰り返します。 注:プレート上に産卵成人がいる場合は、子孫との混乱を避けるために、発達遅延動物を同じ標的遺伝子に対して標識された新しいNGM-RNAiプレートに移します。</li>
	</ol></li>
	<li>無菌または産卵不良<ol>
<li>空のベクターコントロール細菌で成長した動物が卵を産み始めるまで、ステップ4.1のように年齢同期性の動物を栽培する。</li>
		<li>実体顕微鏡を使って動物を監視し、子宮に目に見える卵を持たない動物の割合をスコア付けします。参考として、空のベクターコントロール細菌で増殖した変異動物と比較する。</li>
		<li>あるいは、体型顕微鏡を用いて動物を監視し、卵を満載した子宮で動物の割合をスコア付けし、EGg産損物(Egl-d)表現型29と定義する。</li>
	</ol></li>
	<li>胚性致死性<ol>
<li>動物が卵を産み始めるまで、ステップ4.1のように年齢同期性の動物を栽培する。</li>
		<li>空のプレートに〜100個の卵を移します。カウントを簡素化するために行に卵を広げます。</li>
		<li>24-48時間後にプレート上の孵化していない卵の割合をスコア。参考として、空のベクターコントロール細菌で処理された動物の卵と比較する。</li>
	</ol></li>
	<li>麻痺アッセイ<ol>
<li>1日目の成人の場合、空のベクターコントロール細菌で成長した動物が成人期に達するまで、産卵が始まる前に、ステップ4.1のように年齢同期動物を栽培する。</li>
		<li>細かいマーカーを使用して、通常のNGM寒天プレートの背面に線を引きます。</li>
		<li>マークされたラインに5〜10匹の動物を配置します。</li>
		<li>タイマーを設定し、10分待ちます。</li>
		<li>麻痺したワームとしてラインに残っている動物の割合をスコア。参考として、空のベクターコントロール細菌で増殖した変異動物と比較する。 非全45 型RNAiで処理された野生型動物は、重度の麻痺表現型を示し、陽性対照として使用することができる。 注:このアッセイは、中程度から重度の麻痺を示す動物を強調しています。このような動物は、通常、共通の湾曲した形状を提示するのではなく、プレート上にまっすぐに横たわります。さらに、細菌を取り除いたパッチが麻痺したワームの頭部の周りに見える。</li>
	</ol></li>
	<li>スラッシングアッセイ<ol>
<li>空のベクターコントロール細菌で成長した動物が成人に達するまで、卵子の産卵が始まる前に、ステップ4.1のように年齢同期動物を栽培する。</li>
		<li>96ウェルプレートに動物の栽培温度でM9バッファの100 μLをピペット。</li>
		<li>M9バッファー含有ウェルに、ウェルごとに15個のワームを入れます。</li>
		<li>動物は5分間調整しましょう。</li>
		<li>実体顕微鏡下で各動物を調べ、15sをカウントダウンするタイマーを開始し、その期間内に各動物が行う体の曲げ数をカウントする。カウントされた値は、1 分あたりのボディ ベンドに正規化できます。参考として、空のベクターコントロール細菌で増殖した変異動物と比較する。 注:この運動性アッセイは非常に敏感であり、治療間の非常に穏やかな違いを検出することができます。しかし、液体の運動性と寒天の運動性は異なる場合があります。</li>
	</ol></li>
</ol>5. タンパク質ノックダウンの検証
<ol><li>関連するdsRNA発現または空のベクター含有(L4440)細菌を播種した60mmNGM-RNAiプレートに250〜300個の同期卵を置きます。 注:RNAiノックダウンは、胚の不足や遺伝子発現に影響を与える可能性のある発達停止において、胚の異常な蓄積をもたらす可能性があります。これは、検査する動物の年齢を決定する際に考慮されるべきである。</li>
	<li>1日目の成人の場合、15°Cで4.5日間、20°Cで3日間、または25°Cで2日間栽培する。</li>
	<li>200 μL の PBS-T で充填された 1.5 mL チューブのキャップに合計 200 匹の若い成虫動物を選んで移します。 注:温度感受性動物やシャペロン変異体を使用する場合は、プロトコルで使用されるバッファを動物の栽培温度で維持するのが最善です。</li>
	<li>キャップを慎重に閉じ、1,000 x g で遠心分離機を 1 分間閉じます。</li>
	<li>800 μLのPBS-T (表1)と遠心分離機を1,000 x g で1分間加えます。</li>
	<li>上の900 μLを慎重に取り外します。</li>
	<li>手順 5.4 ~ 5.6 を 3 回繰り返します。</li>
	<li>900 μL を取り除き、200 個のワームを含む溶液を 100 μL残します。</li>
	<li>25 μLの 5x サンプルバッファーを追加します (表 1)。</li>
	<li>1000 rpmで振りながら、92°Cで10分間サンプルを加熱します。その後、サンプルを凍結し、-20°Cに保つことができます。</li>
	<li>各サンプルの20 μLをロードし、SDS-PAGEゲルで実行します。</li>
	<li>適切な抗体を用いてウェスタンブロット分析を行い、タンパク質の相対的安定性を決定する。</li>
	<li>自由に利用できる ImageJ ゲル モジュールのような密度のソフトウェアを使用してバンドの強度を決定します。すべての値をコントロールサンプルで測定したものに正規化します。 注:私たちのスクリーンでRNAiノックダウンの目的は、特定のシャペロン/コシャペロンのタンパク質レベルを下げることです。したがって、RNAiノックダウンの効率を評価する最良の方法は、ウェスタンブロット分析によるものである。これには特定の抗体が必要です。代わりに、qPCRを使用してmRNAレベルを定量化することもできます。</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

プロテオスタシスネットワークの統合画像は、それがどのように組織化され、異なるメタゾアン細胞および組織で機能するかを反映しています。この欠点に対処するためには、開発や老化の過程で、分子シャペロンなどのこのネットワークの様々な構成要素の相互作用に関する具体的な情報が必要です。ここでは、組織特異的摂動を使用して、特定の組織におけるシャペロンネットワークを調べることがどのように可能であるかを示した。組織特異的シャペロン遺伝的相互作用を探求するために、3つの異なるアプローチが検討された。第1のアプローチでは、筋肉細胞において高発現されるシャペロンであるUNC-45を、摂食RNAi25を介してシャペロン相互作用をスクリーニングするために使用した。特殊なシャペロンの使用は、識別組織特異性を可能にするが、それはそれが貢献するその非常に焦点を当てたサブネットワーク上でのみ報告することができます。ほとんどのC.エレガンスニューロンは、摂食ベースのRNAi送達50に耐性であり、したがって、ニューロン細胞における遺伝的相互作用を同定するためにこのア...

細胞は、損傷したタンパク質1,2を修復、隔離、除去する品質管理機械を採用することで、タンパク質の損傷に対処する。タンパク質複合体の折りたたみおよび組立は、分子シャペロンによって支持され、損傷したタンパク質3、4、5、6、7を修復または隔離することができる高度に保存されたタンパク質の多様なグループである。損傷したタンパク質の除去は、ユビキチンプロテアソーム系(UPS)8またはオートファジー機械9によってシャペロン10、11、12との協調で媒介される。タンパク質ホメオスタシス(プロテオスタシス)は、従って、折りたたみおよび分解機3,13からなる品質管理ネットワークによって維持される。しかし、生体内のプロテオスタシスネットワークの様々な成分間の相互作用を理解することは大きな課題です。タンパク質とタンパク質の相互作用スクリーンは、物理的相互作用とシャペロン複合体14,15に関する重要な情報を提供する一方で、生体内の組織特異的シャペロンネットワーク内の組織および補償機構を理解することは欠けている。
遺伝的相互作用は、一般的なまたは代償的な生物学的経路16、17、18に関与する遺伝子のペア間の関係を調べるための強力なツールとしてしばしば使用される。このような関係は、2番目の遺伝子16の突然変異によって引き起こされる表向きの重症度に対する1つの遺伝子における突然変異の一対を組み合わせることによって測定することができる。そのような組み合わせのほとんどは表現型の面で効果を示さないが、いくつかの遺伝的相互作用は、測定された表現型の重症度を悪化させるか、または緩和することができる。二重欠失変異体の表現型が単一欠失変異体を組み合わせた際に見られる予想より重篤な場合に、悪化する変異が観察され、2つの遺伝子が並列経路で機能し、一緒に特定の機能に影響を与える。これに対し、二重欠失変異体の表現型が単一欠失変異体に見られる表現型よりも重症でない場合に緩和突然変異が観察され、2つの遺伝子が複合体として作用するか、あるいは同じ経路16,18に関与することを示唆する。したがって、致死性、増殖速度およびブロードサイズなどの広範な表現型、ならびに転写レポーターなどの特定の表現型を含む、定量化できる多様な表現型が、遺伝的相互作用を同定するために使用されてきた。例えば、Jonikasらの研究は、ペアワイズ遺伝子欠失解析を用いて、サッカロマイセスCErevisiae ER展開タンパク質応答プロテオスタシスネットワークの相互作用を調べるためにERストレスレポーターに依存していた19。
遺伝的相互作用画面は、二重変異体20の包括的なセットを生成するために体系的にペアワイズ欠失突然変異を交差することを含む。しかし、動物モデル、特にC.エレガンスでは、この大規模なアプローチは実現不可能です。代わりに、変異株は、RNA干渉(RNAi)21を用いて遺伝子発現を下方調節することによって、それらの遺伝的相互作用パターンについて試験することができる。C. エレガンスは RNAi22、23に基づくスクリーンのための強力なシステムです。C.エレガンスでは、二本鎖RNA(dsRNA)の送達は細菌の供給によって達成され、dsRNA分子が多数の組織に広がった。このようにして、導入されたdsRNA分子は、迅速かつ簡単な手順21を介して動物に影響を与える。したがって、RNAiを用いた遺伝的相互作用スクリーンは、RNAiライブラリ24を用いて遺伝子またはほとんどのC.エレガンスコード遺伝子の一組をダウンレギュリングすることの影響を明らかにすることができる。このような画面では、対象の変異体の挙動に影響を与えるが、野生型株は影響しないヒットは、監視されている表現型の潜在的な修飾子である25.ここでは、変異とRNAiスクリーニングの組み合わせを適用して、C.エレガンスにおける組織特異的シャペロン相互作用を体系的にマッピングする。

<table><tbody><tr><td>12ウェルプレート</td><td>SPL</td><td>BA3D16B</td><td></td></tr><tr><td>40 mm プレート</td><td>Greiner Bio-one</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>60 mm プレート</td><td>Greiner Bio-one</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>96 well 2 mL 128.0/85mm</td><td>Greiner Bio-one</td><td>780278</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Formedium</td><td>AGA03</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>フォーミディアム</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノール ブルー</td><td>シグマ</td><td>BO126-25G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>1.02382.0500</td><td></td></tr><tr><td>カメラ</td><td>Qimaging</td><td>q30548</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>Amresco</td><td>0433-250G</td><td></td></tr><tr><td>共焦点</td><td>ライカ</td><td>DM5500</td><td></td></tr><tr><td>フィルター(0.22 &micro;m)</td><td>シグマ</td><td>SCGPUO2RE</td><td></td></tr><tr><td>蛍光体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>MZ165FC</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フルタロム</td><td>2355519000024</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>フォーミディアム</td><td>367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>メルク</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>1.04873.1000</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Bio-Lab</td><td>001649029100</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</</td><td>sub>Fisher</td><td>22189-08-8</td><td>森本研究室からの贈り物</td></tr><tr><td>ミオシン MHC A (MYO-3) 抗体</td><td>ハイブリドーマ バンク</td><td>5-6</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot;7H2O</td><td>Sigma</td><td>s-0751</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio-Lab</td><td>001903029100</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Merck</td><td>61930705001730</td><td></td></tr><tr><td>プレート注湯ポンプ</td><td>Integra</td><td>does it p920</td><td></td></tr><tr><td>RNAi シャペロン ライブラリ</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>VWR Life Science</td><td>0837-500</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-メルカプトエタノール</td>バイオ<td>ワールド</td><td>41300000-1</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td>ライ<td>カ</td><td>MZ6</td><td></td></tr>テ<tr><td>トラサイクリン</td><td>デュチェファバイオケミー64-75-5</td><td></td><td></td></tr>トリ<tr><td>ス</td><td>バイオラボ</td><td></td>002009239100 <td></td></tr><tr><td>Tween-20</td>フィ<td>ッシャーBP337-500</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

カエノハブディティス・エレガンスを使用して組織特異的シャペロン相互作用をスクリーニングする

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

細胞機能には、タンパク質およびタンパク質複合体の正しい折り畳みと組み立てが不可欠です。細胞は、損傷したタンパク質を正し、隔離し、または排除する品質管理経路を採用して、健康なプロテオームを維持し、細胞プロテオスタシスを確保し、さらなるタンパク質損傷を防ぎます。プロテオスタシスネットワーク内の冗長な機能のため、多細胞生物 カエノルハブディティス・エレガン スにおけるノックダウンまたはシャペロンコード遺伝子の変異を用いて検出可能な表現型のスクリーニングは、ほとんどの場合、マイナーまたは全く表現型の検出をもたらす。特定の機能に必要なシャペロンを同定し、表現型と機能のギャップを埋める目的でスクリーニング戦略を策定しました。具体的には、RNAi合成相互作用スクリーンを用いた新規シャペロン相互作用、ノックダウンシャペロン発現、一度に1つのシャペロン発現、シャペロンコード遺伝子の変異を運ぶ動物、または目的のシャペロンを過剰発現する動物を監視する。個々にグロス表現型を呈しない2つのシャペロンを破壊することによって、我々は両方が摂動したときに特定の表現型を悪化させるか、または暴露するシャペロンを同定することができる。我々は、このアプローチが、特定の表現型に関連するタンパク質またはタンパク質複合体の折り畳みを調節するために一緒に機能するシャペロンの特定のセットを同定できることを実証する。

UNC-45の温度感受性変異を使用して、許容的または制限的な条件下での相互作用を悪化または緩和するためのスクリーニング 筋肉のアセンブリとメンテナンスは、組織特異的なシャペロン相互作用を研究する効果的なシステムを提供します。収縮性筋肉の機能的単位であるサルコメアは、構造タンパク質と調節タンパク質の結晶状の配置を示す。運動タンパク質ミオシンの安定性と収縮性筋サルコメアの厚いフィラメントへの組み込みは、シャペロンおよびUPS成分30の協力に依存する。そのようなシャペロンの一つの例は、主に体壁筋肉31、32、33、34、35で発現される保存および専門化ミオシンシャペロンUNC-45である。UNC-45の変異は、Cにお...

シャペロン-シャペロンとシャペロン基質相互作用を研究するために、我々は、軽度の突然変異またはシャペロンの過剰発現と組み合わせてRNA干渉を使用して カエノハブディティス・エレガンス の合成相互作用スクリーンを行い、組織レベルで組織特異的タンパク質機能不全を監視する。

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

遺伝的に追跡可能なデザインである線虫Caenorhabditis elegansにおける次の実験の全体的な目標は、組織特異的なシャペロン相互作用を特定することです。この手法の主な利点は、Golan AIのフィッティングやビヘイビアリードアウトなどの使いやすいアッセイを組み合わせて、新しい組織特異的な相互作用を明らかにすることです。ストレスのない胚の同期のためには、ワームピックを使用して、非同期のワームプレートから新たに装着したNGMプレートに約100個の卵子を移動させ、適切な実験スケジュールに従って動物を培養します。動物が産卵の初日に達したら、細菌の芝生から離れたプレートに1ミリリットルのM9バッファーをゆっくりと追加し、バッファーがプレートを完全に覆うようにプレートを回転させます。プレートを片側に傾けて液体を取り除き、プレートから動物を洗います。プレートからすべてのワームを洗い流したら、標準的なプラスチック製のピペットチップを使用して、卵が集中している周りの寒天を正方形に切り取り、新しく取り付けたNGMプレートに寒天のピースを置きます。同じ培養条件下で卵を培養します。インキュベーションの終わりに、プレートは同期卵で覆われるべきです。先ほど示したようにプレートからすべての動物を洗い流した後、1ミリリットルの新鮮なM9バッファーを追加し、セルスクレーパーを使用してプレートから卵を放出します。すべての卵が取り除かれたら、プレートから全量のバッファーを円錐形のチューブに移して遠心分離します。チューブを遠心分離し、上清を捨てます。上清を取り除いた後、プレートとピペットで最大1ミリリットルの新鮮なM9バッファーをプレートとピペットで追加して卵を再懸濁します。先ほど示したように、卵をさらに5回洗います。最後の洗浄後、卵ペレットは白く見えるはずで、最後の200マイクロリットルの上澄みを除くすべてを取り除くことができます。実験のために同期線虫を培養するには、バクテリアの芝生と各干渉RNA着座プレートの近くに約30個の卵をドロップし、バクテリアを含む空のベクターを座らせたプレートに約30個の卵を置きます。次に、実験プロトコルに従って適切な培養条件下で動物を栽培します。同期した動物の胚致死率を評価するには、動物が産卵を開始したら、約100個の卵を空のプレートに移し、卵を列に広げてカウントを簡素化します。24〜48時間後、孵化していない卵の割合を採点します。参考までに、実験動物の卵子を空のベクターコントロール細菌で処理した動物の卵子と比較してください。麻痺アッセイを設定するには、年齢同期した動物を空のベクターコントロール細菌で培養し、動物が成体になるまで、ただし産卵が始まる前に培養します。通常のNGM寒天プレートの裏側に細いマーカーで線を引き、印のついた線に5〜10匹の動物を置きます。タイマーを10分に設定し、麻痺したワームとしてラインに残っている動物の割合をスコアリングします。参考までに、このデータを空のベクターコントロール細菌で増殖した変異動物の割合と比較してください。タンパク質ノックダウンバリデーションでは、250〜300個の同期卵子を、関連する二本鎖RNA発現または空のベクターを含む細菌を装着した60mmのNGM干渉RNAプレートに置き、適切な実験期間で卵を培養します。インキュベーションの終わりに、合計200匹の若い成体動物を、動物の培養温度に維持された200マイクロリットルのPBSTを含む1.5ミリリットルのチューブのキャップに移します。キャップを慎重に閉め、動物をGの1000倍で1分間遠心分離します。遠心分離の最後に、800マイクロリットルの新鮮なPBSTをチューブに加え、ワームを再度遠心分離します。上清の上部900マイクロリットルを慎重に取り除き、示したように、線虫を新鮮なPBSTでさらに3回洗います。最後の洗浄後、上清の最後の100マイクロリットルを除くすべてを取り除き、25マイクロリットルの5Xサンプルバッファーを動物に加えます。サンプルを摂氏92度、毎分1000回転で10分間加熱してから、各サンプルの20マイクロリットルをSDSページゲルにロードします。次に、適切な抗体を使用してウェスタンブロット解析を行い、目的のタンパク質の相対安定性を決定し、デンシトメトリーソフトウェアを使用してバンの強度を決定します。発生中にHSP6をノックダウンすると、野生型動物では強力な発生停止がもたらされます。同時に、野生型RDE1を発現する筋肉特異的干渉RNA株にHSP6をノックダウンしても、発生停止は起こらない。一方、HSP6は、腸細胞で野生型RDE1を発現する腸特異的RNAI株をノックダウンすると、強力な発生停止と表現型をもたらします。したがって、軽度の成長遅延を引き起こすHSP6 MG585の変異は、その変異遺伝子を運ぶ株を腸内特異的干渉RNA株に交配し、シャペロン干渉RNAライブラリーをスクリーニングすることにより、シャペロン相互作用の悪化または緩和をスクリーニングするために使用できます。STI1、AHSA1、またはDAF41干渉RNAで処理されたミオシン組織およびUNC45変異動物は、第4幼虫期の野生型線虫のそれと類似している。突然変異体は、成人期に達した後、混乱したサルコメアを示しますが。対照的に、エンプティベクターコントロールで処理されたUNC45変異動物と野生型動物はどちらも影響を受けないままである。遺伝的相互作用は、物理的な相互作用を示すものではありません。したがって、遺伝的相互作用スクリーニングを用いた追跡実験を実施して、同定された相互作用の性質を検証し、直接調べる必要があります。

using-caenorhabditis-elegans-to-screen-for-tissue-specific-chaperone

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生物学

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学ぶ組織特異的シャペロン相互作用のスクリーニング法。Caenorhabditis elegansを用いた合成相互作用スクリーンとRNA干渉により、組織レベルでのタンパク質機能不全を評価し、新たな相互作用を同定します。

カエノハブディティス・エレガンスを使用して組織特異的シャペロン相互作用をスクリーニングする

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