Name: 長期ナノ材料暴露後のインビトロ遺伝子毒性試験のための高度な3D肝モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 学ぶ3D肝スフェロイドモデルを用いたナノ材料の長期暴露による遺伝毒性評価法。Hep G2細胞を用いたこのインビトロ系は、マイクロ核試験でDNA損傷を検出し、動物実験の代替として有効です。

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著者らは、この研究が補助金契約No.760813の下で、欧州連合(EU)のHorizon 2020研究およびイノベーションプログラムから資金を受け取っていることを認めたいと思います

<ol><li>Geiser, M., Kreyling, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deposition+and+biokinetics+of+inhaled+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Particle+and+Fibre+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Deposition and biokinetics of inhaled nanoparticles.</a> Particle and Fibre Toxicology. 7, 2(2010).</li>
<li>Modrzynska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicological+effects+of+nanoparticle+deposition+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Kgs.+Lyngby%2C+Denmark%3A+Technical+University+of+Denmark%22%5BJournal%5D)">Toxicological effects of nanoparticle deposition in the liver.</a> Kgs. Lyngby, Denmark: Technical University of Denmark. , (2018).</li>
<li>Elje, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+applied+to+HepG2+liver+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The comet assay applied to HepG2 liver spheroids.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033(2019).</li>
<li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture%3A+the+missing+link+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).</li>
<li>Shah, U. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+in+vitro+HepG2+cells+liver+spheroid+model+for+genotoxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional in vitro HepG2 cells liver spheroid model for genotoxicity studies.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 51-58 (2018).</li>
<li>Lauschke, V. M., Hendriks, D. F. G., Bell, C. C., Andersson, T. B., Ingelman-Sundberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+3D+Culture+Systems+for+Studies+of+Human+Liver+Function+and+Assessments+of+the+Hepatotoxicity+of+Drugs+and+Drug+Candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Novel 3D Culture Systems for Studies of Human Liver Function and Assessments of the Hepatotoxicity of Drugs and Drug Candidates.</a> Chemical Research in Toxicology. 29, 1936-1955 (2016).</li>
<li>van Grunsven, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+in+vitro+models+of+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">3D in vitro models of liver fibrosis.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 121, 133-146 (2017).</li>
<li>Corvi, R., Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+genotoxicity+testing+-+can+the+performance+be+enhanced%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">In vitro genotoxicity testing - can the performance be enhanced.</a> Food and Chemical Toxicology. 106, 600-608 (2017).</li>
<li>Doak, S. H., Manshian, B., Jenkins, G. J. S., Singh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+genotoxicity+testing+strategy+for+nanomaterials+and+the+adaptation+of+current+OECD+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro genotoxicity testing strategy for nanomaterials and the adaptation of current OECD guidelines.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 745, 104-111 (2012).</li>
<li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).</li>
<li>OECD. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guidelines.+Test+489%3A+In+vivo+Mammalian+Alkaline+Comet+Assay%22">OECD Guidelines. Test 489: In vivo Mammalian Alkaline Comet Assay</a>. , (2016).</li>
<li>Gerets, H. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+human+hepatocytes%2C+HepG2+cells%2C+and+HepaRG+cells+at+the+mRNA+level+and+CYP+activity+in+response+to+inducers+and+their+predictivity+for+the+detection+of+human+hepatotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins.</a> Cell Biology and Toxicology. 28, 69-87 (2012).</li>
<li>Sison-Young, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicenter+assessment+of+single-cell+models+aligned+to+standard+measures+of+cell+health+for+prediction+of+acute+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">A multicenter assessment of single-cell models aligned to standard measures of cell health for prediction of acute hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. 91, 1385-1400 (2017).</li>
<li>European Guidelines 2019. European Agency for Safety and Health at Work. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines">https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines</a> (2019).</li>
<li>Jensen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NANOGENOTOX+Dispersion+Protocol+for+NANoREG%5BTitle%5D)+AND+%22European+Union+Grant+Agreement+n%C2%B0+2009%22%5BJournal%5D)">The NANOGENOTOX Dispersion Protocol for NANoREG.</a> European Union Grant Agreement n° 2009. 21, 01(2014).</li>
<li>Marchese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aflatoxin+B1+and+M1%3A+Biological+Properties+and+Their+Involvement+in+Cancer+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Aflatoxin B1 and M1: Biological Properties and Their Involvement in Cancer Development.</a> Toxins. 10, 214(2018).</li>
<li>Rushing, B. R., Selim, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aflatoxin+B1%3A+A+review+on+metabolism%2C+toxicity%2C+occurrence+in+food%2C+occupational+exposure%2C+and+detoxification+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Aflatoxin B1: A review on metabolism, toxicity, occurrence in food, occupational exposure, and detoxification methods.</a> Food and Chemical Toxicology. 124, 81-100 (2019).</li>
<li>Kermanizadeh, A., Brown, D. M., Moritz, W., Stone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+inter-individual+Kupffer+cell+variability+in+the+governance+of+hepatic+toxicity+in+a+3D+primary+human+liver+microtissue+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The importance of inter-individual Kupffer cell variability in the governance of hepatic toxicity in a 3D primary human liver microtissue model.</a> Scientific Reports. 9, 7295(2019).</li>
<li>Berger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Liver+Cell+Models+Using+the+Basel+Phenotyping+Cocktail%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Comparison of Liver Cell Models Using the Basel Phenotyping Cocktail.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 443(2016).</li>
<li>Ramaiahgari, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+in+vitro+model+of+differentiated+HepG2+cell+spheroids+with+improved+liver-like+properties+for+repeated+dose+high-throughput+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">A 3D in vitro model of differentiated HepG2 cell spheroids with improved liver-like properties for repeated dose high-throughput toxicity studies.</a> Archives of Toxicology. , (2014).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+in+vitro+micronucleus+assay+for+evaluation+of+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the in vitro micronucleus assay for evaluation of nanomaterials.</a> Mutagenesis. 32 (1), 151-159 (2016).</li>
<li>Kirkland, D., Reeve, L., Gatehouse, D., Vanparys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+core+in+vitro+genotoxicity+battery+comprising+the+Ames+test+plus+the+in+vitro+micronucleus+test+is+sufficient+to+detect+rodent+carcinogens+and+in+vivo+genotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">A core in vitro genotoxicity battery comprising the Ames test plus the in vitro micronucleus test is sufficient to detect rodent carcinogens and in vivo genotoxins.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 721 (1), 27-73 (2011).</li>
<li>Curcio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+transfer+and+metabolic+reactions+in+hepatocyte+spheroids+cultured+in+rotating+wall+gas-permeable+membrane+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system.</a> Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).</li>
<li>Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mass+transfer+in+hepatocyte+spheroids+via+cell+viability%2C+spheroid+size%2C+and+hepatocellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86, 672-680 (2004).</li>
<li>Asthana, A., Kisaalita, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtissue+size+and+hypoxia+in+HTS+with+3D+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Microtissue size and hypoxia in HTS with 3D cultures.</a> Drug Discovery Today. 17, 810-817 (2012).</li>
<li>Gaskell, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+functional+C3A+liver+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of a functional C3A liver spheroid model.</a> Toxicology Research. 5, 1053-1065 (2016).</li>
<li>Cho, E. C., Zhang, Q., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+sedimentation+and+diffusion+on+cellular+uptake+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">The effect of sedimentation and diffusion on cellular uptake of gold nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 6, 385-391 (2011).</li>
<li>Hinderliter, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISDD%3A+A+computational+model+of+particle+sedimentation%2C+diffusion+and+target+cell+dosimetry+for+in+vitro+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Particle+and+Fiber+Toxicology%22%5BJournal%5D)">ISDD: A computational model of particle sedimentation, diffusion and target cell dosimetry for in vitro toxicity studies.</a> Particle and Fiber Toxicology. 7, 36(2010).</li>
<li>Kramer, N. I., di Consiglio, E., Blaauboer, B. J., Testai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biokinetics+in+repeated-dosing+in+vitro+drug+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+vitro%22%5BJournal%5D)">Biokinetics in repeated-dosing in vitro drug toxicity studies.</a> Toxicology in vitro. 30, 217-224 (2015).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

3D肝モデルの適用は、標的にされる特定の生化学的エンドポイントまたは有害な結果経路によってかなり異なる。各モデルには、一次ヒト肝細胞(PHH)モデルのドナー間変動から細胞系モデルにおけるチトクロームp450活性の低下まで、その利点と限界があるが、すべて独自の権利6、12、18、19において価値がある。遺伝毒性を評価する場合、モデルには、能動増殖が必要なため、インビトロ小核アッセイなどの規制承認エンドポイントとの適合性が制限される。遺伝子毒性評価は、DNA修復が一過性の病変を矯正する機会がある場合に細胞分裂後に評価される固定DNA損傷の定量化を必要とするため、これが必要である。残念なことに、高度に分化した肝細胞(すなわち、hepaRG)ベースのスフェロイドまたはPHHマイクロ組織は、最も生理学的に関連する肝臓様特性を示すものと考えられるが、これは静的(不増殖)モデル12、19、20を形成する。その結果、ここで提示される3D HepG2スフェロイドモデルは、遺伝毒性試験をサポートできる適切な代替モデルを提供します。HepG2細胞系スフェロイドは、アルブミンや尿素産生などの基本的な肝臓様特性を維持しながら、スフェロイドの外表面に十分な積極的に細胞を分割し、CYP450活性5、12、19を有する。このインビトロ肝モデルは、この小核アッセイを補完するために開発されており、これは、遺伝毒性試験8、10、11、21の電池で推奨される2つのインビトロアッセイのうちの1つである。しかし、このモデルはDNAシーケンシング解析および遺伝子発現(RNA)技術に容易に適用することができ、彗星アッセイのような他のDNA損傷エンドポイントにさらに適応して利用される可能性がある。しかし、一部のエンドポイント解析において、ENM干渉が果たす役割を考慮することが重要です。例えば、フローサイトメトリーベースの解析は、特に粒子干渉22によるENM遺伝子毒性評価には適さない場合がある。
細胞分裂を活発に行うスフェロイドモデルの制限要因の1つは、その大きさです。シード密度の最適化は、モデルが増殖し続ける十分なセルが必要であるため、重要です。しかし、あまりにも高い細胞数, スフェロイドが過度にコンパクトになる結果, 壊死コアの増加につながります.この壊死の原因は、酸素および栄養拡散を制限していると考えられており、この拡散の限界は、組織23、24の約100〜150μmであると考えられている。しかし、これは細胞型、細胞数、足場相互作用および培養条件25に依存する。以来、直径約700μmがC3Aスフェロイドの中心における壊死の早期発症を避けるための限界であることを示されており、スフェロイド当たり4000HepG2細胞を播種すると、露光時のモデルの直径が≤500μm26であることを保証する。さらに、Shah et al. は、ヘプG2細胞が球状体1個当たり5000細胞を超える播種が培養7日後に生存率の25%減少を示したことを確立した。これを克服するために、本プロトコルで考案されたモデルは、スフェロイドの初期形成に続いて、吊り下げ低下がアガロース被覆井戸に移される重要なステップを経る。これにより、スフェロイド内で増え続ける細胞数を維持するために、より多くの培養培地が存在することを保証する。その結果、HepG2スフェロイドモデルは培養で10日後に70%以上生存し続け、インビトロでの長期ハザード評価に利用することができる。
HepG2スフェロイドモデルは急性および長期の曝露レジーレジーをサポートできるが、培地の完全な置換がスフェロイドの潜在的な損失のために推奨されないとして、培養期間中の細胞培養培地のリフレッシュは、このモデルに対して制限される。ENM露光では、均質なENM分散液が凝集・沈殿する傾向が高いと推測されます。しかし、ENM堆積物が粒子パラメータ(例えば、大きさ、形状および密度)に応じて変化し得る速度は、IN体外沈下、拡散および線量測定(ISDD)モデル、またはその最近の誘導体を使用して理論的に決定できることが注目に値する。この心を用いて、細胞培養液の50%のみが細胞培養の表面から慎重に除去されれば、ENM用量の破壊およびその後の除去は理論的には最小限に抑えられるべきである。しかし、ブラウン運動が遊びで、これは厳密にはそうではないかもしれないし、テストされる各特定のENMの堆積および沈下へのさらなる作業は、長期的な暴露体制27を通じて正しい量体測定が保持されることを確実にするために行われるべきである。主に、これは最終的な蓄積された濃度に不可欠である可能性があり、繰り返し投ずる体制を実行する際に考慮すべき潜在的な制限です。一方、化学物質ベースの暴露は、考慮すべき独自の制限がないわけではないが、化学物質が溶液中に残る傾向があり、新たに添加された濃度に加えて元の化学物質濃度を直接交換するという点でより単純なアプローチを提供し、メディアリフレッシュ中に失われた化学物質をそれに応じて29に置き換えることを保証する。将来の応用には、特定の臓器系が異種生物物質の生物蓄積によって誘発される副作用を改善または克服する能力を評価するために、長期培養期間にわたる反復暴露体制に対するモデルの適合性を評価することが含まれる。
結論として、この3Dインビトロ肝モデルは、現実的な暴露シナリオの範囲を評価するために利用される能力を有し、それによってENMと化学的ハザード評価の両方をより良くサポートするための将来のインビトロアプローチをルーチンで容易にアクセス可能な方法で提供する。

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section was updated.
Figure 6 in the Representative Results section was updated from:
<img alt="Cell culture analysis; graph of cell viability and bar charts of albumin, urea over time in days." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 6">
to:
<img alt="Cell viability, albumin, and urea levels over 14 days in culture; graphs of cell culture analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 6">
The fourth paragraph in the Representative Results section was updated from:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &gt;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the ≥14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be ≥0.06 mg/mL whilst urea production should be ≥0.4 ng/µL before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.
to:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &gt;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the ≥14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be ≥50.0 ng/μL whilst urea production should be ≥0.25 ng/µL before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.

Erratum: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

人間ベースのアプリケーション(食品、化粧品、衣料品、スポーツ用品、電子機器、輸送、医薬品など)を通じて、多様なエンジニアリングナノ材料(ENM)の急速な開発と実装により、人間が定期的にENMにさらされることは避けられません。これにより、これらの材料が多数の用途で有利であると考える新しいサイズ固有のフィジオ化学的特性が、人間の健康と環境に付随する悪影響を引き起こす可能性があるという懸念が高まっている。現在、多くの国際的な活動は、積極的にこれらのENMへのより生理学的に関連する暴露を反映し、急性、長期、および繰り返し低用量暴露シナリオにわたってこれらの材料の潜在的な毒性を評価するために実施されています。
肝毒性学は、ENM曝露を考慮する際に重要であり、肝臓が曝露後のENM蓄積の主要部位であることを広く知られている1,2。また、肝臓は全身循環に入る物質の代謝と解毒のための第一次臓器系である。2D肝細胞モデルは、複雑な多細胞相互作用の複雑さを正確に模倣しない、または生体内で観察される代謝活性を適切に表さないという受け入れられた理解に基づいて、生体内代替技術のための堅牢で生理学的に関連する3D肝モデルの開発に大きく焦点を当てて4,5が確立されている。高度な3D培養技術を利用することで、インビトロ肝モデルの寿命が向上し、長期にわたる反復暴露体制の調査が可能になります。さらに、この高度な培養フォーマットは、胆汁カナリキュリ、活性トランスポータープロセスおよび改良されたCYP450薬物代謝能力などの強化された生理学的、organotypicの特徴の形成を促進し、モデル6の予測性を向上させる。現在の3Dインビトロ肝モデルは、単一培養物(肝細胞のみ)または共培養(非パレンキサイト細胞を有する肝細胞)からなるいくつかの形式で存在し、 超低接着板のマイクロ組織またはスフェロイド、吊り下げドロップスフェロイド、マトリックスおよび/または足場および微小流体細胞培養プラットフォームに埋め込まれた細胞に及ぶ、それらのすべては、肝毒性評価6、7のための効果的な高度なインビトロモデルとみなされる。しかし、これらのモデルシステムの大半は、高いメンテナンス、特殊な機器を必要とし、高価です。さらに、これらのモデルは、固定DNA損傷を定量化する方法を用いた遺伝毒性試験などのハザードエンドポイントの評価における使用を妨げる静的(すなわち、非分割細胞モデル)であることが多い。遺伝毒性は、規制毒性学の中核的前提条件であり、任意の毒性物質のリスク評価の重要な構成要素である8.外因性物質への暴露後に生じる可能性のあるDNA損傷のすべての形態を定量化するために適用できる単一のアッセイはありません。しかし、インビトロ遺伝子毒性試験用電池のコア成分は、微小核アッセイであり、これは総染色体損傷9を測定する信頼性の高い多面的な技術である。これは、OECD試験ガイドライン487によって記述された金標準技術であり、インビトロDNA損傷および遺伝毒性を評価するための、および規制ハザード評価10、11のための試験電池要件の一部である。
ヒト肝細胞癌細胞株HepG2は、細胞が容易に入手可能であるように初期ハザード評価スクリーニングに広く使用され、比較的安価にソース化し、培養が容易で、高スループットスクリーニング12,13に適している。3D球形構造に培養した場合、それらは肝臓微小環境を良好に再現し、微小核アッセイ3を支持するのに十分な増殖能力を有する肝モデルを提供することが示されている。HepG2スフェロイドモデルのさらなる開発は、長期にわたる反復暴露体制(≤14日間)における遺伝毒性ハザード評価をサポートするために、モデルの長寿および肝臓様機能性を向上させるために確立された。したがって、動物実験を置き換え、低減、改良する3Rの原理に沿って、本プロトコルは、複数の毒物学的エンドポイント(例えば、肝臓機能、(炎症マーカー、細胞毒性および遺伝毒性)に続く、急性および反復的な化学的およびENM暴露を確実に評価することができる高度な3Dインビトロ肝モデルを提供するために確立された。
ここでは、急性または長期にわたるENM曝露後の遺伝毒性ハザード評価のためのインビトロモデルシステムに基づく生理的に関連する3D肝細胞細胞株を確立する方法を提示する。プロトコルは6つの重要な段階に分けることができます:凍結保存HepG2細胞を培養する。ヘプG2スフェロイド製剤;ヘプG2スフェロイド転写は、吊り下げからアガロース懸濁液へ。ヘプG2スフェロイド収穫;マイクロ核アッセイとスコアリング;データ分析を行います。

<table><tbody><tr><td>アフロトキシン B1</td><td>Σ Aldrich, UK</td><td>A6636-5MG</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>Σ Aldrich, 英</td><td>A9539-50G</td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブテープ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCG アルブミンアッセイ</td><td>Σ Aldrich, 英</td><td>MAK124</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン粉末</td><td>Σ Aldrich, 英</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>細胞凍結助剤</td><td>サーモフィッシャーScientific, UK</td><td>5100-0001 - Mr Frosty</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Merck, UK</td><td>250233</td><td></td></tr><tr><td>Cytology Metal Clips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 4 Centrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific, UK</td><td>CM00730202</td><td></td></tr><tr><td>DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, フェノールレッドフリー、4.5g/L D-グルコース、L-グルタミン、Hepes</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>DPX Mounting Medium</td><td>FisherScientific, UK</td><td>D/5330/05</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10048291</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytospin</td> <td>用フィルターカードFisherScientific、英国</td><td>15995742</td><td></td></tr><tr><td>曇りガラススライド</td><td>ThermoFisher Scientific、英国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa's Stain Improved R66 Solution、Gurr</td><td>VWR Chemicals、英国</td><td>MFCD00081642</td><td></td></tr><tr><td>ガラス カバースリップ (24 x 60)</td><td>Deckglaser、VWR</td><td>ECN631-1575</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤およびカバースリップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>浸漬油顕微鏡</td><td>ツァイス、英国</td><td>518F、ISO8034</td><td></td></tr><tr><td>層流クラスII組織培養フード</td><td>Scanlaf火星</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光顕微鏡</td><td>ツァイス、英国</td><td>アクシバート40C</td><td></td></tr><tr><td>液体窒素</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、英国</td><td>10284580</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ波</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ノンフィルター、滅菌 200&micro;lおよび1000&micro;l ピペットチップ</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NuncMicroWell 96-Well Microplates</td><td>ThermoFisher Scientific, Denmark</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>P1000 and P200 micropipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P300 and P50 multi-channel pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 1X, MgCl2 and CaCl2 Free</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase Buffer Tablets</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>10582-013</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Boy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges</td><td>FisherScientific, UK</td><td>11690581</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier SFX 550 240V CE 1/2- プローブ</td><td>ブランソン、米国</td><td>101-063-971R</td><td></td></tr><tr><td>T-25 および T-75 組織培養フラスコ</td><td>Greiner-Bio-One、英国</td><td>T-25 (690175) および T-75 (660175)</td><td></td></tr><tr><td>トリパン ブルー ソリューション</td><td>シグマ アルドリッチ、英国</td><td>T8154-100mL</td><td></td></tr><tr><td>尿素アッセイキット</td><td>シグマ アルドリッチ、英国</td><td>MAK006</td><td></td></tr><tr><td>Virkon 消毒剤</td><td>デュポン、英国</td><td>Rely+On Virkon</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス(37?C)</td><td>Grant JBNova 18</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weighing Balance</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10588070</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>5300-054</td><td></td></tr><tr><td>0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45&micro;m フィルターユニット</td><td>Millex HA, MF-Millipore, UK</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>1.0mL Syringe</td><td>BD Plastipak, FisherScientific, UK</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>20mL LS シンチレーションガラスバイアル, 22-400 ホイル裏地付き PP キャップ</td><td>DWK Life Sciences GmbH, Germany</td><td>WHEA986581</td><td></td></tr><tr><td>37?Cおよび5% CO2 ISOクラス5 Hepaフィルターインキュベーター</td><td>NUAIRE DHDオートフロー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3mL パスツールピペット</td><td>Greiner-Bio-One、英国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL コニカルファルコンチューブ</td><td>Greiner-Bio-One、英国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mLまたは100mL ガラス瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL スカート付きファルコンチューブ</td><td>Greiner-Bio-One、英国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5mL、10mL25mLピペット</td><td>Greiner-Bio-One、英国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9.4cm正方形、ペトリ皿</td><td>Greiner-Bio-One、英国</td><td>688161</td><td></td></tr></tbody></table>

長期ナノ材料暴露後のインビトロ遺伝子毒性試験のための高度な3d肝モデル

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

多様なエンジニアリングナノ材料(ENM)の急速な開発と実装により、ENMへの暴露は避けられず、堅牢で予測的なインビトロ試験システムの開発が不可欠です。肝臓は代謝性恒常性および解毒に重要な役割を果たすだけでなく、ENM蓄積後の暴露の主要な部位であるため、肝臓毒性学はENM曝露を考慮する際に重要である。このことと、2D肝細胞モデルが生体内で観察される複雑な多細胞相互作用および代謝活性の複雑さを正確に模倣していないという理解に基づいて、生体外でのENMハザード評価目的に合わせた生理学的に関連する3D肝モデルの開発に大きな焦点が当てられています。動物実験を置き換え、低減、改良する3Rの原理に沿って、3D HepG2細胞株ベースの肝臓モデルが開発され、拡張および繰り返しENM暴露体制(≤14日)の両方をサポートできるユーザーフレンドリーで費用対効果の高いシステムです。これらのスフェロイドモデル(直径500μm≥)は、増殖能力(すなわち、細胞モデルの分割)を保持し、体外での遺伝毒性を効果的に評価するために「ゴールドスタンダード」マイクロ核アッセイと結合することができます。毒性学的エンドポイントの範囲(例えば、肝機能、(プロ)炎症反応、細胞毒性および遺伝毒性)の両方にわたっていくつかのEnMを使用して、急性(24時間)および長期(120時間)曝露療法を報告する能力が特徴付けられている。この3D in vitro肝モデルは、より現実的なENM暴露を評価するために利用される能力を有し、それによってENMハザード評価をより適切にサポートするための将来のin vitroアプローチを提供し、ルーチン的かつ容易にアクセス可能な方法でENMハザード評価を提供する。

この細胞系ベースの3D肝スフェロイドモデルの長期培養および遺伝毒性ハザード評価の適合性を、ベースライン特性評価を行い、培養中の14日間のモデルの生存率および肝臓様機能性および微小核アッセイに対するその適用性を決定することによって評価した。
3D HepG2肝臓回転楕円体モデルのベースライン特性 インビトロ毒物学的評価の前に、アガロース転移または化学/ENM処理を行う前に、3D HepG2スフェロイドが正しく形成されていることを確認することが重要です。吊り下げ液法を用いて製造されたHepG2スフェロイドは、通常、図5 A-5Cに示すように、平均直径495.52 μmのHを有するコンパクトな球形の球状スフェロイドを形成するのに2〜3日の播種後(4000細胞/スフェロイド)を要する。正しく形成され、体外毒性評価に使用できるHepG2スフェロイドは、滑らかな表面と視覚的な投影のないコンパクトな球形の構造を持っている必要があります。図 5に、品質の良さと品質の悪さ (図 5G-I)スフェロイドの例を示します。後者は破棄する必要があります。通常、プレートごとに形成されたスフェロイドの90〜95%が正しく形成され、さらなる実験のために実行可能である。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig5.jpg"> 図5:吊り下げ液法を介して形成されたHepG2スフェロイドの自然形態を示す光顕微鏡画像。(A-C)ショー2日目と(D-I)4日目HepG2肝臓スフェロイドポストシード。(D-F) は良質 HepG2 スフェロイドの例であり、 (G-I) は形成不良のスフェロイドを示しています。すべての画像は、顕微鏡を使用してX20目的で撮影した。スケールバーは20 μmを表<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig5large.jpg" target="_blank">します</a>。
HepG2スフェロイド生存率をさらに確認するために、基本的な着色ブロモクレゾールグリーンアルブミン(BCG)アッセイまたはウレアアッセイを行い、肝臓様の機能性を評価することができる。肝臓様の機能性は、14日間の培養期間にわたってトリパンブルー排除アッセイを使用して生存率に沿って評価され、肝臓スフェロイドモデルの寿命を決定し、長期的または繰り返しENM/化学的ハザードアセスメントをサポートできるかどうかを確立した(図6)。アルブミン濃度は培養期間にわたって一貫した状態を保った。尿素生産は、7日目までに高原に到達する前に、培養で1週間にわたってスフェロイド当たりの尿素の濃度の増加を表示します。3D HepG2スフェロイドで産生されるアルブミンおよび尿素のレベルは、2D形式で培養された同じ細胞株で観察されたものよりも実質的に高い点に注意することが重要である。実際、HepG2細胞、ピークアルブミンおよび尿素レベルの2D培養は、それぞれ0.001mg/mLおよび0.010 ng/μLであった。さらに、ほぼ同一のHepG2スフェロイド系を用いてShahらが発表した以前の研究では、2D培養HepG2細胞5と比較した場合の3D HepG2インビトロモデル系における代謝活性(CYP1A1およびCYP1A2)の顕著な改善を強調した。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg"> 図6: HepG2肝スフェロイドの14日間ベースライン特性データ吊り下げからの移し換えの後、(A)は14日間にわたってHepG2スフェロイドモデルの生存率を強調し、(B)および(C)は肝臓のようなアルブミンおよび尿素の機能をそれぞれ強調する。SEM±提示された平均データ、n = 4。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
壊死性コアの必然的な発達に伴い、3D肝スフェロイド培養の既知の限界であり、このHepG2ベースのモデルの生存率は、微小核アッセイ5を支持するために必要な増殖能力を維持しながら、長期(5〜10日)の暴露レジームを維持できることを実証するために確立されなければならなかった。実際、この3D肝スフェロイドモデルは、培養で10日間にわたって70%の生存率を保持することが示されています。このことから、≥14日間の培養期間に観察された持続的な肝臓様の機能と組み合わせて、この3D肝スフェロイドモデルは、10日間の長さ(すなわち、スフェロイドの生存率が70%を下回る前)の長期にわたる反復ENM曝露レジームをサポートすることができる。参考までに、4000細胞/スフェロイドに播種されたHepG2スフェロイドのアルブミンレベルは≥20.0 ng/μL で、尿素生産は≥0.25 ng/μLであるべきである。
工学ナノ材料の遺伝毒性評価 遺伝毒性評価のために、微小核アッセイを用いて、急性(24時間)および長期(120時間)の両方のENM曝露に続く小核の存在を決定した。アフラトキシンB1は、既知の肝発がん性物質16、17であり、小核アッセイに推奨される陽性対照である。最適化実験では、0.1 μMのアルファトキシンB1が3D HepG2肝スフェロイドにおいて有意な陽性(≥2.0倍の増加)の遺伝毒性応答を誘導し、このモデルで行われるすべての微小核アッセイに使用することが示されています。HepG2スフェロイドモデルを用いたマイクロ核アッセイ結果の有効性を保証するために、この3Dインビトロモデルで使用されるHepG2細胞のバックグラウンドマイクロ核周波数は0.6%~1.2%の範囲内にある必要があります。その結果、アルファトキシンB1は、陰性対照で見られるものよりも少なくとも2倍高い遺伝子毒性応答を誘導すべきである。したがって、0.1 μMのアルファトキシン B1 は、1.5% ~ 3.0% の間のマイクロ核周波数を誘導する必要があります。これらの制御パラメータを用いて、ENMに関連する遺伝子毒性インビトロを、確実に評価することができる。OECD試験ガイドライン487に基づいて、ENMまたは化学薬品を試験する際に、選択された濃度が5%以上±5%以上の細胞傷害性を誘発してはならないことに注意することが重要である(負の対照に関連してCPBIまたはRVCC値の低下によって示される)11。図7は、アフラトキシンB1および2つのENM(二酸化チタン(TiO2)およびスライバー(Ag))がHepG2スフェロイドにおける急性および長期曝露の両方に続いて評価された場合に生成されたデータを示し、その後の遺伝子毒性電位をミクロ核アッセイを用いて分析した。評価された両方のENMは、急性(24時間)暴露および長期(120時間)曝露体制に対する非細胞毒性、低用量5.00μg/mLで試験された。TiO2およびAg Enmsの両方にわたって遺伝毒性の同様の傾向が観察され、それによって24時間暴露後に生じた遺伝毒性応答の上昇は、長期5日間の暴露後に明らかではなかった。これは、両方の時点でアフラトキシンB1陽性対照によって誘導された持続的な遺伝毒性にもかかわらずであった。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig7.jpg"> 図7: HepG2肝スフェロイドに対するTiO2およびAg ENM曝露に続く遺伝毒性評価微小核アッセイポスト(A)急性(24時間)および(B)を用いた遺伝毒性(微小核頻度)評価(A)および(B)TiO2およびAg ENMの5.00 μg/mLへの長期(120時間)曝露。ネガティブコントロールはメディアのみであり、正のコントロールはAflatoxin B1の0.1 μMです。平均データ(n=2)は、SD±提示され、負のコントロールに関連して示された有意性:* = p≤0.05。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig7large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

この手順は、急性または長期の反復用量レジーム上のナノ物質暴露に関連する遺伝子毒性有害性のより生理学的に関連する評価を提供することができるインビトロで高度な3D肝培養物を開発するために使用されるように確立された。

長期ナノ材料暴露後のインビトロ遺伝子毒性試験のための高度な3D肝モデル

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

このHep G2モデルは、動物での試験の必要性を最小限に抑えることを目的として、ナノマテリアルへの長期曝露後の固定DNA損傷の潜在的な誘導をより確実に評価するための、関連する代替のin vitro試験システムを提供します。Hep G2スフェロイドモデルは、14日間にわたって生存能力と機能性を維持する能力、および適切なレベルの増殖を維持する能力を備えています。これは、小核アッセイを含む、さまざまな生化学的および遺伝毒性エンドポイントの試験をサポートします。このプロトコルを試す前に、まずいくつかの練習を行うことをお勧めします。細胞の播種や培地の変更には繊細なアプローチが必要なため、注意してください。まず、100マイクロリットルの滅菌室温PBSを96ウェル培養プレートのウェルに加えます。プレートの蓋を裏返し、細胞懸濁液の20マイクロリットル滴を蓋の各ウェル溝の中央に慎重にピペットで入れます。マルチチャンネルピペットを使用し、一度に2〜4滴追加して、配置の精度を確保します。一度に4つのステロイドのみを播種し、開始する前にピペットの先端がすべて揃っていることを確認してください。マルチチャンネルを保持する角度によって、スフェロイドの形成方法に違いが生じます。液滴が蓋のウェルの溝の中央にあることを確認してから、プレート上部の蓋をそっと裏返して、液滴がPBSでウェルにぶら下がるようにします。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で3日間インキュベートしてから、スフェロイドをアガロースに移します。インキュベーション後、インキュベーターからプレートを取り外し、蓋を慎重に持ち上げてプレートから外し、PBSを廃棄し、プレートを軽くたたいて残留液体を取り除き、プレートを2〜3分間風乾させます。アガロースを溶かした後、ゆっくりと撫でて泡を取り除き、各ウェルの基部に50マイクロリットルを加えます。プレートを室温で2分間放置し、各ウェルの固体アガロース層の上に100マイクロリットルの予熱済みDMEMを加えます。このスフェロイド液滴をプレートの上に戻し、スフェロイドが再びぶら下がるように蓋をし、プレートを200倍Gで3分間遠心分離して、スフェロイドをプレートの個々のウェルに移します。プレートをさらに24時間インキュベートして、スフェロイドが沈殿するまで待ちます。人工ナノ材料(ENM)を分散させた後、予め加温したDMEMで最終的な所望の濃度に希釈します。各ウェルから50マイクロリットルの培地をスフェロイドで吸引し、それをENMで50マイクロリットルの培地と交換します。スフェロイドを回収するには、200マイクロリットルのピペットを使用して、アガロースとの接触を避けるように注意しながら、各ウェルからのスフェロイド組織で100マイクロリットルの細胞培養培地を吸引します。スフェロイドを滅菌済みの15ミリリットル遠心分離チューブに集めます。スフェロイド懸濁液をGの230倍で5分間遠心分離し、上清を取り除き、さらなる分析まで摂氏マイナス80度で保存します。スフェロイドのペレットを1ミリリットルの滅菌室温PBSで洗浄し、Gの230倍で3分間遠心分離し、上清を捨てます。スフェロイドを500マイクロリットルの0.05%トリプシン-EDTA溶液に再懸濁し、摂氏37度と二酸化炭素5%で6〜8分間インキュベートします。インキュベーション後、トリプシンZされたHep G2細胞を上下に静かにピペットで動かして完全に解離させ、再懸濁してから1ミリリットルのDMEMで中和します。細胞懸濁液をGの230倍で5分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを2ミリリットルのPBSに再懸濁します。キュベット漏斗のセットアップを作成するには、準備した顕微鏡スライドを金属製の支持体に置き、スライドの上にフィルターカードを置き、キュベット漏斗を上部に固定します。細胞遠心分離機にキュベットの漏斗を配置し、漏斗を上に向けて配置し、100マイクロリットルの細胞懸濁液を各液に直接加えることができます。次に、原稿の指示に従ってスライドの固定を進めます。ホスファターゼバッファーで希釈した20%Gemsa染色溶液を調製します。溶液を静かに上下にピペットで動かして混ぜ合わせ、折りたたんだ濾紙で漏斗でろ過します。パスツールピペットを使用して、各スライドのサイトドットにろ過したギムサ溶液を3〜5滴加え、室温で8〜10分間放置します。スライドを2回連続してホスファターゼバッファー洗浄液で洗浄します。次に、冷水で短時間すすぎ、余分な汚れを取り除き、自然乾燥させます。in vitroでの毒性評価を行う前に、3D HepG2スフェロイドが適切に形成されていることを確認することが重要です。播種後4日で、表面が滑らかで視覚的な突起がないコンパクトな球形の回転楕円体が形成されるはずです。ここでは、播種後4日間の良質なスフェロイドと質の悪いスフェロイドを示しています。通常、プレートごとに形成されるスフェロイドの90〜95%は正しく形成され、さらなる実験に有用です。生存率と肝臓様の機能性を14日間の培養期間にわたって評価し、肝臓スフェロイドモデルの寿命を決定し、長期的なENMまたは化学物質ベースのハザード評価をサポートできるかどうかを確認しました。アルブミン濃度は培養期間中一貫していましたが、スフェロイドあたりの尿素産生は増加し、14日目に低下し始めました。遺伝毒性評価のために、小核アッセイを使用して、急性および長期のENM曝露後の小核の存在を決定しました。スフェロイドは、二酸化チタンと銀の2つのENMに曝露されました。遺伝毒性の同様の傾向は、両方のENMへの急性曝露後に観察されましたが、長期の5日間の曝露後、遺伝毒性反応の上昇は明らかではありませんでした。.この方法に従うと、上清とスフェロイドの両方を採取して、多数の生化学的エンドポイントを得ることができます。これらには、細胞生存率、肝機能アッセイ、SID 450分析、炎症マーカーの低下、遺伝子発現が含まれます。この技術は現在、化学物質とナノ材料の両方の日常的な地球毒性試験に適用したいと考えている多くの受託研究機関で試験されています。これにより、in vivo試験アプローチへの依存を減らすことができます。

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