長期ナノ材料暴露後のインビトロ遺伝子毒性試験のための高度な3D肝モデル

このHep G2モデルは、動物での試験の必要性を最小限に抑えることを目的として、ナノマテリアルへの長期曝露後の固定DNA損傷の潜在的な誘導をより確実に評価するための、関連する代替のin vitro試験システムを提供します。Hep G2スフェロイドモデルは、14日間にわたって生存能力と機能性を維持する能力、および適切なレベルの増殖を維持する能力を備えています。これは、小核アッセイを含む、さまざまな生化学的および遺伝毒性エンドポイントの試験をサポートします。

このプロトコルを試す前に、まずいくつかの練習を行うことをお勧めします。細胞の播種や培地の変更には繊細なアプローチが必要なため、注意してください。まず、100マイクロリットルの滅菌室温PBSを96ウェル培養プレートのウェルに加えます。

プレートの蓋を裏返し、細胞懸濁液の20マイクロリットル滴を蓋の各ウェル溝の中央に慎重にピペットで入れます。マルチチャンネルピペットを使用し、一度に2〜4滴追加して、配置の精度を確保します。一度に4つのステロイドのみを播種し、開始する前にピペットの先端がすべて揃っていることを確認してください。

マルチチャンネルを保持する角度によって、スフェロイドの形成方法に違いが生じます。液滴が蓋のウェルの溝の中央にあることを確認してから、プレート上部の蓋をそっと裏返して、液滴がPBSでウェルにぶら下がるようにします。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で3日間インキュベートしてから、スフェロイドをアガロースに移します。

インキュベーション後、インキュベーターからプレートを取り外し、蓋を慎重に持ち上げてプレートから外し、PBSを廃棄し、プレートを軽くたたいて残留液体を取り除き、プレートを2〜3分間風乾させます。アガロースを溶かした後、ゆっくりと撫でて泡を取り除き、各ウェルの基部に50マイクロリットルを加えます。プレートを室温で2分間放置し、各ウェルの固体アガロース層の上に100マイクロリットルの予熱済みDMEMを加えます。

このスフェロイド液滴をプレートの上に戻し、スフェロイドが再びぶら下がるように蓋をし、プレートを200倍Gで3分間遠心分離して、スフェロイドをプレートの個々のウェルに移します。プレートをさらに24時間インキュベートして、スフェロイドが沈殿するまで待ちます。人工ナノ材料(ENM)を分散させた後、予め加温したDMEMで最終的な所望の濃度に希釈します。

各ウェルから50マイクロリットルの培地をスフェロイドで吸引し、それをENMで50マイクロリットルの培地と交換します。スフェロイドを回収するには、200マイクロリットルのピペットを使用して、アガロースとの接触を避けるように注意しながら、各ウェルからのスフェロイド組織で100マイクロリットルの細胞培養培地を吸引します。スフェロイドを滅菌済みの15ミリリットル遠心分離チューブに集めます。

スフェロイド懸濁液をGの230倍で5分間遠心分離し、上清を取り除き、さらなる分析まで摂氏マイナス80度で保存します。スフェロイドのペレットを1ミリリットルの滅菌室温PBSで洗浄し、Gの230倍で3分間遠心分離し、上清を捨てます。スフェロイドを500マイクロリットルの0.05%トリプシン-EDTA溶液に再懸濁し、摂氏37度と二酸化炭素5%で6〜8分間インキュベートします。

インキュベーション後、トリプシンZされたHep G2細胞を上下に静かにピペットで動かして完全に解離させ、再懸濁してから1ミリリットルのDMEMで中和します。細胞懸濁液をGの230倍で5分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを2ミリリットルのPBSに再懸濁します。キュベット漏斗のセットアップを作成するには、準備した顕微鏡スライドを金属製の支持体に置き、スライドの上にフィルターカードを置き、キュベット漏斗を上部に固定します。

細胞遠心分離機にキュベットの漏斗を配置し、漏斗を上に向けて配置し、100マイクロリットルの細胞懸濁液を各液に直接加えることができます。次に、原稿の指示に従ってスライドの固定を進めます。ホスファターゼバッファーで希釈した20%Gemsa染色溶液を調製します。

溶液を静かに上下にピペットで動かして混ぜ合わせ、折りたたんだ濾紙で漏斗でろ過します。パスツールピペットを使用して、各スライドのサイトドットにろ過したギムサ溶液を3〜5滴加え、室温で8〜10分間放置します。スライドを2回連続してホスファターゼバッファー洗浄液で洗浄します。

次に、冷水で短時間すすぎ、余分な汚れを取り除き、自然乾燥させます。in vitroでの毒性評価を行う前に、3D HepG2スフェロイドが適切に形成されていることを確認することが重要です。播種後4日で、表面が滑らかで視覚的な突起がないコンパクトな球形の回転楕円体が形成されるはずです。

ここでは、播種後4日間の良質なスフェロイドと質の悪いスフェロイドを示しています。通常、プレートごとに形成されるスフェロイドの90〜95%は正しく形成され、さらなる実験に有用です。生存率と肝臓様の機能性を14日間の培養期間にわたって評価し、肝臓スフェロイドモデルの寿命を決定し、長期的なENMまたは化学物質ベースのハザード評価をサポートできるかどうかを確認しました。

アルブミン濃度は培養期間中一貫していましたが、スフェロイドあたりの尿素産生は増加し、14日目に低下し始めました。遺伝毒性評価のために、小核アッセイを使用して、急性および長期のENM曝露後の小核の存在を決定しました。スフェロイドは、二酸化チタンと銀の2つのENMに曝露されました。

遺伝毒性の同様の傾向は、両方のENMへの急性曝露後に観察されましたが、長期の5日間の曝露後、遺伝毒性反応の上昇は明らかではありませんでした。.この方法に従うと、上清とスフェロイドの両方を採取して、多数の生化学的エンドポイントを得ることができます。これらには、細胞生存率、肝機能アッセイ、SID 450分析、炎症マーカーの低下、遺伝子発現が含まれます。

この技術は現在、化学物質とナノ材料の両方の日常的な地球毒性試験に適用したいと考えている多くの受託研究機関で試験されています。これにより、in vivo試験アプローチへの依存を減らすことができます。