酵素特性評価からハイスループットスクリーニングまでのアポリポタンパク質N-アシルトランスフェラーゼのクリックケミストリーベースの蛍光アッセイ(英語)

このプロトコルは、必須の一体型膜である細菌のアポリポタンパク質アシルトランスフェラーゼの特性評価と、酵素の阻害剤をスクリーニングするためのHDS形式でのアッセイの開発という2つの重要な側面に対応しています。この方法は非常に感度が高く、スクリーニング目的に適しています。これは、潜在的な新規抗生物質の開発に貢献することができます。

このビデオは、不均質な脂質や界面活性剤を含む懸濁液を扱いながら、混合、ボルテックス、超音波処理など、このプロトコルの重要なステップを強調するのに役立ちます。手順を実演するのは、Karine Nozeret、Aurelia Pernin、どちらも私のグループのフェローです。まず、アポリポタンパク質とアシルトランスフェラーゼまたはLNTアッセイ用の試薬混合物を調製します。

アルキンPOPEとFSL-1-ビオチンをLNT反応緩衝液とLNT反応緩衝液と混合し、最終容量18μLにします。すべての試験条件に対して三重試薬混合物を調製します。試薬混合物を超音波水浴で3分間超音波処理し、摂氏37度で5分間インキュベートします。

次に、活性LNTまたは不活性LNTを最終濃度1マイクロリットルあたり1ナノグラムまで添加し、ピペットで上下に動かして混合します。反応を37°Cで16時間インキュベートし、加熱した蓋付きのサーマルミキサーで加熱します。その間、ストレプタビジン1ミリリットルあたり2ミリグラムの原液を調製します。

そして、それをミリリットルあたり10マイクログラムに希釈して、実用的な溶液を作成します。100マイクロリットルの溶液を96ウェルプレートの各ウェルに加えます。次に、蓋をせずにプレートを摂氏37度でインキュベートすることにより、ウェルを一晩風乾します。

翌日、5ミリモルのアジド-FAM、50ミリモルのTCEP、2ミリモルのTBTA、および50ミリモルの硫酸銅五水和物のストック溶液を準備します。1.5 mL LNT 反応チューブに 0.2 μL の Azido-FAM、0.4 μL の TCEP 液、0.2 μL の TBTA 液を添加して、クリックケミストリーを行います。溶液を5秒間ボルテックスします。

次に、0.4マイクロリットルのストック硫酸銅を追加します。さらに5秒間ボルテックスし、反応を室温で暗所で1時間インキュベートします。クリックケミストリー混合物をインキュベートしている間に、ストレプトアビジンコーティングプレートのウェルを200マイクロリットルのPBST1で3回洗浄します。

18マイクロリットルのクリックケミストリー混合物をストレプトアビジンコーティングウェルに移し、100マイクロリットルのPBST1を添加してN-アシル-FSL-1-ビオチンFAM生成物をプレートに結合します。ビオチンフルオレセインをプレートに添加し、ストレプトアビジン結合および蛍光読み出しのポジティブコントロールとして使用します。次に、プレートを室温で1時間、暗所で300RPMで振とうしながらインキュベートします。

インキュベーション後、マルチチャンネル電動ピペットを使用して、200マイクロリットルのPBST2でプレートを6回手動で洗浄します。ピペットで3回洗い流します。200マイクロリットルのPBSで3回洗い、さらに3回洗い流します。

各ウェルに200マイクロリットルのPBSを添加し、マイクロプレートリーダーで520ナノメートルの蛍光を検出します。すべての結果をスプレッドシートに保存し、各反応の標準偏差と、陰性コントロールと対応のないT検定を持つ陽性サンプルのP値を計算します。ここで説明するin vitro LNTアッセイでは、アルキン脂肪酸とFSL-1-ビオチンを基質として含むリン脂質を使用して、アルキンFSL-1-ビオチンを形成します。

Azido-FAMとのクリックケミストリー反応により、本製品は蛍光標識され、蛍光分光法で検出可能になります。反応条件は、520ナノメートルで最大蛍光読み出しが得られるように最適化されました。ネガティブコントロールには、酵素を使用しない反応、酵素の不活性変異体との反応、またはチオール特異的阻害剤であるMTSESとの反応が含まれていました。

ビオチンフルオレセインは、蛍光シグナルを最大にするための内部コントロールとして使用されました。ハイスループットスクリーニングアッセイを開発するために、反応は384ウェルプレートで直接行いました。洗浄ステップが自動化され、試薬の量が削減されました。

この反応は感度が高く再現性があり、ネガティブコントロールと活性酵素との間の蛍光シグナルに大きな差がありました。ハイスループットスクリーニングでは、Zプライムファクターは、アッセイの応答がスクリーニング目的に十分な大きさであるかどうかを判断します。平均Z素因数は、384ウェルフォーマットで実施したLNTアッセイで0.6を超えており、それが優れていることを示唆しています。

このビデオのチューブアッセイは、HDSと互換性のあるマルチプレート形式で開発されました。さまざまな生物由来の他のアシルトランスフェラーゼの研究に使用できます。