Name: 二重マーカーを用いたモザイク解析を用いた大脳皮質の開発における系統トレースとクローン解析(MADM) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学ぼう、MADMを用いたマウス大脳皮質の系統トレースとクローン解析の手法。単一細胞レベルで前駆細胞の増殖行動と細胞産出を定量的に測定し、発生生物学における遺伝子機能を解明する。

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ヒッペンマイヤー研究所のメンバー全員に、ISTオーストリアのバイオイメージング施設、ライフサイエンス施設、前臨床施設の皆様に、技術サポートをいただき、ありがとうございました。この作業は、ISTオーストリアの機関資金によって支援されました。R.B.はオーストリア科学基金(FWF)リーゼ・マイトナー・プログラム(M 2416)から支援を受けました。N.Aはオーストリア科学基金(FWF)フィルンバーグ・プログラミング(T 1031)から支援を受けました。GCは、ISTplus博士研究員としてマリー・スクウォトフスカ・キュリー交付金第754411年に基づく欧州連合(EU)のHorizon 2020研究・イノベーションプログラムから支援を受けました。A.H. は、ÖAW DOC (オーストリア科学アカデミー博士課程) から支援を受けました。この研究はまた、欧州連合(EU)のHorizon 2020研究イノベーションプログラム(補助金契約No 725780 LinPro)の下で欧州研究評議会(ERC)によってS.H.に支持されました。

著者らは開示するものは何もない。

現像新皮質における生体内の個々のRRPの細胞系統を追跡するためにMADMを用いた方法が記載されている。TM誘導性CreERT2と組み合わせると、MADMイベントを正確にタイミングを計ることができ、単一細胞レベルでの幹細胞分割パターンの高度で定量的な視覚的読み出しを提供します。送達されるTMの用量を評価することにより、理想的な状況では、皮質半球当たり1クローン未満の平均が得られ、個々のクローンを明確に区別するための十分な空間分離を提供することができる。組織の完全性を維持することにより、この方法はまた位置、形態、および絶対細胞数に関する必須情報を取り込む。MADM カセット Chr. 117,,11,12,46,56,57, Chr. 751, そしてRosa2647,,53,,59のオリジナル MADM は MADM クローン解析研究で使用されています。個々の細胞の高解像度は、形態と娘細胞のクローン関係の両方に前例のない洞察を提供し、増殖幹細胞および新興クローン46,52,52のライブイメージングを可能にする。
帝王切開および出生後タイムポイントにおけるクローンの分析のための子犬の育成は、プロトコルにおいて必要かつ重要なステップである。TM治療済み妊娠ダムの健康状態によっては、帝王切開を行う必要がない場合があります。しかし、TM治療を受けた母親は授乳に苦労する可能性があるため、里親と一緒に子犬を育てる必要があります。異なるCreERT2ドライバを使用して育成する必要性に違いは見られていません。MADMラインと里親の両方が、上達したCD-1のバックグラウンドで維持されています。帝王切開が必要でない場合、実験用子犬を生成するために使用されるTM処置の妊娠ダムは、3Rの原則に従って追加の実験的繁殖のために再利用することができる(これは、動物実験ライセンスがこの慣行を承認した場合にのみ行うことができることに注意してください)。里親は出産後2日以内に子犬の育成に使用できるが、里親が里親を産むのと同じ日に出産すると成功率が高いことが観察されている。したがって、ステップ1.1で実験的な交配と並行して里親のための時取り合いを設定することが重要です。元の里親のごみと同様のごみ番号を維持することは、養育された子犬の生存率を向上させる可能性があるため、元のごみの一部を取り除く必要があります。育成を改善する可能性のある追加のステップは、(手袋の香りを取り除くために)ごみや食べ物で実験者の手袋をこすることが含まれます。帝王切開後に子犬を、養母の汚れたごみや巣の破片で優しくこすりつけます。そして、里親マウスケージに配置する前に、里親の子犬と密接に接触している子犬の配置。
他のレポーターベースの系統トレース方法と同様に、MADMクローン実験に最適なCreERT2ドライバを選択する際には、慎重に検討する必要があります。まず、使用されるプロモーターは、関心のある前駆体集団において時間的および空間的にリコンビナーゼを発現しなければならない。このプロモーターを見つけることは、一部のプロモーターが発現パターンを変更したり、開発の異なる段階で沈黙したりすることがあるため、困難な場合があります。細胞型特異性を改善するために、複数部位特異的リコンビナーーゼが、それぞれ別々のプロモーターによって駆動され、使用されてきた。一方または両方のリコンビナーサが同じ細胞内で発現する場合、これは蛍光レポーター74、75、76、7775,76,で細胞とその子孫にラベルを付けます。74要約すると、分析される前駆者の集団に固有のCreERT2ドライバを選択することが重要です。
この方法で最も重要なステップは、すべての細胞が単一の組み換えイベントから明確に誘導されなければならないので、クローンの同定である(ステップ8.1)。TM濃度の滴定は、脳半球当たりの赤/緑細胞の1つのクラスター未満を保証し、単一のクローンを分析する確率を最大化します (ステップ 2.2)7,,11.対象クローンの500μm以内に細胞の隣接するクラスターが発生した場合、クローンは廃棄する必要があります。したがって、クローンの出現前後のいくつかのセクションを調べて、近くに追加の再結合イベントがないことを確認することが重要です。フルオロフォアのシグナルが弱いため、胚性クローンでeGFPおよびtdTの免疫体化学を行う必要がある(セクション6参照)。これは、追加の抗原がコラベル化される場合にのみ、成体クローンで推奨されます。クローンをイメージングする場合、クローンが配置されている皮質の全幅(すなわち、pial表面から脳梁まで、ステップ8.4を参照)の全幅を捕捉することが重要です。これにより、画像処理時の画像の配置も容易になります(セクション9)。プロトコルのセクション8は、反転共焦点顕微鏡を必要とするが、利用可能な顕微鏡のセットアップに応じて適合させることができる。蛍光顕微鏡は使用できますが、焦点面外からの光汚染の減少につながるため、共焦点顕微鏡が推奨されます。また、レーザーの強度とゲインを調整して、緑、赤、黄色の細胞を明確に識別できることも重要です。設定に関係なく、近くに配置されたセルの完全な空間分離を確保するために、少なくとも 20 倍の目標を使用することをお勧めします。すべての細胞の皮質深度を記録することに加えて(ステップ8.6)、クローンが位置する皮質領域は、アレン・ブレイン・アトラスまたは他の立体的座標マップなどの脳アトラスを使用して同定されなければならない。クローンイメージを容易に識別できるように、ファイル命名パラダイムも採用する必要があります。ファイル命名には、一意の画像ID、撮影した日付画像、動物の遺伝子型、誘導年齢、解析年齢、同クローンからの残りの画像との関連で画像番号の情報を含めることができる。
1つのMADMカセットに位数の変異の導入は、遺伝的モザイク71の生成を独特に可能にし、クローンレベル77、11、46、6211,における系統および細胞型多様性の分子調節因子の解剖を可能にする。46,62MADMを用いて遺伝的モザイクを生成するには、MADMカセットが目的の遺伝子と同じ染色体に精機的にリンクされている必要があります(繁殖スキームの図2を参照)。これは、MADMを用いた現在のクローン解析を、Chr. 751、Chr. 1146、Chr.1251、およびRosa26軌跡47に遠位した遺伝子に制限する。今後の研究では、任意の染色体を標的とするMADMカセットを使用し、クローンレベルでマウスゲノムの事実上すべての遺伝子のモザイク分析を可能にする。
最後に、MADMは、現像新皮質における前駆細胞の分析に限定されない。多くの幹細胞ニッチの研究は、クローン関連細胞の時空間的な配置を解決する能力の恩恵を受けることができる。MADMを脳の他の領域に適用することにより、疾患状態(例えば、癌)、または他の組織47、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59の研究は、前駆細胞および幹細胞の多様なクラスに由来するクローンにおける系統関係を明らかにした(MADMalon研究の現在のリストについては表1参照)。47,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59MADMのもう一つの興味深い将来のアプリケーションは、クローンから取得できる情報の程度を増加させる追加の機能または細胞内レポーターと組み合わせることです。

大脳皮質は、6つの異なる層で構成される高度に組織化された構造である。皮質は、機能的な神経回路を形成するために相互作用するニューロンやグリアを含む細胞タイプの多様な配列が含まれています。ほとんどの, すべてではないにしても, 皮質興奮性の投影ニューロンとグリアは、放射状グリア前駆体として知られている神経幹細胞 (NSC) の共通プールに由来します (RRP)11,2,,3.RGP自体は、初期胚性神経エピテリウムを構成する神経上皮幹細胞(NESC)に由来する。マウスの胚性9日目(E9)によって、NESCはRMP4に移行し始める。RGP系統進行は、正確な時間的および空間的調節を必要とし、かつこのプロセスが妨げられると、腸脳症、小頭症、リセンスファリー、または統合失調症および自閉症などの障害などの重篤な神経疾患が55,66を生じ得る。E10では、ほとんどのRMPは対称増殖分裂を受け、その結果、神経前駆細胞プール44,77が拡大する。最終的にRGPは非対称的に分裂し始め、一時的に定義された方法で皮質投影ニューロンを産生する。神経新生の連続した波を介して、新生児ニューロンは、深層を占める初期のニューロンと表面層88、9、109,10に存在する後期生まれのニューロンを有する皮質薄層を形成する皮質プレートに移行する。クローン関連の錐体ニューロンは、接線分散が非常に少ない皮質に放射状に移動するため、娘細胞は、ニューロン放射状ユニット44、11、12、1311,12,と呼ばれるカラムまたは円錐形の構造を形成する傾向がある。13E17により、マウス14において胚性神経原性拡張が完了する。RGPはまた、アストロサイトとオリゴデンドロ,サイト1、15、16、17、18、19,15,16を含む、名誉細胞およびいくつかのクラスのグリア17,18を19産生することができる。RGPが神経細胞とアストロサイトの両方を生み出す可能性は、全ての皮質領域18で一貫しているようで、約1/6の神経性RRPもグリア11を産生する。
現在、その系統に沿った幹細胞の経時的な進行を調節する遺伝的およびエピジェネティック要因はほとんど知られていない。遺伝子発現の一時的なパターンは、RMP20、21、22、23、24,21,22,23における系統決定に大きな影響を24与える可能性がある。時間的パターンと空間的パターニングの間のこの緊密な結び付き関係が、皮質領域全体の成体ニューロン型の分子多様性にどのようにつながりかは不明である。同様に、個々の幹細胞電位とその細胞出力が細胞レベルおよび分子レベルでどのように変調されているかも、重要な未回答の問題である。今後の研究は、これらの質問のいくつかに対処し、最終的には機能性皮質回路形成に関する理解を深めるだろう。
発生神経生物学は、脳内の細胞が互いに共有する系統関係を理解することを目指しています。当初は、非常に少数の研究ツールは、このために利用可能であった、と多くの初期の研究は、カエノハブディティスエレガンスなどの透明な生物の分裂パターンの視覚的観察に依存していました25.ここ数十年で,、13、26、27、28、29,26,27の技術の数と洗練が劇的に増加しています。28,29CRISPR-Cas9ゲノム編集システムの出現により、進化するDNAバーコード27,30を導入することにより、30細胞系統関係の合成再構築が可能になります。バーコード戦略の最近の2つの例としては、CRISPR-Cas9を特定のDNAバーコード・ロシに誘導するホーミングガイドRNAまたはニッカーゼCas9と融合したシチジン・デアミナーゼを使用して、内因性間包化反復領域31,32,32を標的とする。これらの技術は、時間の経過とともに徐々に安定的にユニークな突然変異を蓄積するバーコードの導入を通じて、高度に多重化されたアプローチを提供します。ゲノム編集手法は、これらのバーコードの共有継承に基づいて、任意の2つの細胞間の関係を遡及的に分析できるため、非常に価値があります。しかし、個々の細胞のバーコードを読み取るためには、組織は通常破壊されなければならないため、個々の前駆体からの位置、形態、および絶対細胞数に関する情報は失われる。
結合標識パラダイムは、空間情報を保存し、原則として、密接に局在するクローン33,34,34を区別することを可能にする。系統トレース法が有益であるには、個々の前駆者とその子孫にまばらで消えない方法でラベルを付ける必要があります。特に、Brainbow35とConfetti36、37のアプローチは、37単一の遺伝子座から蛍光タンパク質の組み合わせを発現する確率的多色クレリコンビナーゼベースのレポーターを使用しています。インビボで達成することができる同時色の組み合わせの広範な数は、皮質RGPクローンとアストロサイト34をトレースするときに、この強力なツールになります。蛍光レポーターをコードするトランス遺伝子の安定したゲノム統合を提供するトランスポゾン系システムと、皮質前駆細胞の系統トレースを許可するシステムも33,38,39,40,41に開発されている。33,38,39,40,41トランスポゾン系システムは、レポーターがゲノムに安定的に統合し、それにより、線状に関連する娘細胞を確実に標識するという点で付加的な利点を有する。アストロサイト系統を具体的に追跡するために、異なる蛍光タンパク質40,42,42をコードする構築物の組み合わせを利用したスタートラックを含むピギーババックトランスポーゼのエレクトロポレーションを伴う多くの方法が開発されている。もう一つのアプローチであるMAGICマーカーは、転写可能なトランス遺伝子としてBrainbowベクターを導入する。これは正常に胚性神経およびアストロサイト前駆細胞34、43,43を追跡するために使用されています。近年、デュアルリコンビナーゼ媒介カセット交換(MADR)によるモザイク解析は、正確に定義された染色体座遺伝子44からトランスジェニック要素を発現する変異細胞を安定的に標識することを発見した。これらの強力なin vivoの組み合わせ標識技術は、前駆細胞の系統動態に多くの洞察を提供してきた。しかし、これらの分析は固定組織で行われ、定義された発達段階で個々のクローンのスナップショットを提供する。一つのクローンの系統動態の経時変化を観察するためには、成体のデンテート回で行われたものと同様の慢性インビボイメージング法を45に適用する必要がある。
二重マーカー(MADM)を用いたモザイク解析は、マウス46,47,47における個々の前駆細胞の生体内系統トレースを可能にする強力な二重色標識法である。MADM標識イベントを発生させるには2つのコンポーネントが必要です:まず、MADMカセットは同一の遺伝子座を同一の染色体に対象としなければなりません。カセットは、eGFP(緑色、G)とタンデムダイマートマト(赤、tdT[T])の2つのキメラ蛍光レポーター遺伝子で構成されています。GTカセットは、eGFPのN末語とtdTのC末語を含み、loxP部位を含むイントロンで分離する。TGカセットは逆に構築され、tdTのN末語とeGFPのC末語が付いています。第2に、標的MADMカセットを含む同じ細胞内のクレリコンビナーゼの発現が必須である。Creがない場合、キメラカセットはコード配列が破壊されるため、機能的なeGFPまたはtdTを発現しません。loxP部位は、クレメディアされた染色体間組換えの標的となり、両方の発現カセットの再構成を同時に行う。細胞周期のG2フェーズ中に再結合が起こり、その後にX分離(G2-X)が起こった場合、2つの娘細胞はそれぞれ2つの蛍光タンパク質のうちの1つを発現する。タモキシフェン(TM)を用いたCreERT2活性の時間的調節は、MADMクローンの生年月日及びそれらの子孫の除算パターンに関する正確な情報を提供する(図1A)29、46、47。29,46,47
MADMは、ゴルジ染色48または染料充填49のような従来の非特異的かつ骨の折れる方法に類似した、マウス脳内の高い単一細胞分解能を有する個々のクローンを体系的に標識することができる。CreERT2を駆動するプロモーターのみがクローンMADM標識の細胞型特異性を決定するので、MADMは原則として、任意のマウス器官および組織全体のクローン系統トレースに適用することができる47、50、51、52。47,50,51,52実際、研究は、多様な組織に由来するクローンの系統関係を明らかにするためにMADMを使用しています47,,50,,51,,52,,53,,54,,55,,56,,57,,58,,59.MADM実験パラダイムは、,新皮質7,,,,,,7、11、12、46、60、61、62、63、64、6511,12の皮質投影ニューロン、グリア、および出生後幹細胞の系統を研究するために適用されてきた。46606162636465MADMはまた、成体のデンテート回、視床、小脳顆粒細胞、およびクローンレベルのインターニューロンにおける細胞系統を研究するためにも使用されてきた(完全なリストについては表1を参照)47、53、54、56、57、66。47,53,54,56,57,66
MADMのユニークな特徴は、1つのMADMカセットに遠位の突然変異を遺伝的に連結する機能であり、それによって遺伝的モザイクを作成する(図1Bおよび図2)。この結果、一方の蛍光マーカー(図1BのtdT)で標識された野生型のドーター細胞と、他方のホモ接合変異体兄弟(図1BのeGFP)が標識されていない異種性環境で生じる。MADMは、制御と変異サブクローンの比較分析が生体内の同じ組織環境で行うことができるという中でユニークである。もともとMADMカセットはRosa26遺伝子座47に標的化されたが、遺伝子機能のMADM分析は遺伝子の遺伝子に限定されていた。この制限を(少なくとも部分的には)克服し、MADMベースの遺伝子分析の可能性を拡大するために、MADMカセットはChr.751、Chr.1146、およびChr.1251の中心に近いところにノックされました。MADMカセットを搭載した19個のマウスオートソームすべてを標的にすることは進行中であり、将来的に事実上あらゆる遺伝子を研究することを可能にし、機能的遺伝子解析と組み合わせた発達系統関係の研究のための比類のないプラットフォームを提供する。

<table><tbody><tr><td>1 mL ツベルクリン シリンジ (Omnifix ルアー ロック)</td><td>Braun</td><td>9204512N</td><td></td></tr><tr><td>1,4-ジアザビシクロオクタン (DABCO)</td><td>Roth</td><td>0718.2</td><td></td></tr><tr><td>10 mL シリンジ (Omnifix Luer Lock)</td><td>Braun</td><td>8508429N</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 円錐形遠心分離機</td><td>Sarstedt</td><td>65.554.502</td><td></td></tr><tr><td>24 マルチウェルディッシュ</td><td>Roth/Greiner Bio-one</td><td>CE56.1</td><td></td></tr><tr><td>27ゲージ×3/4針(ステリカン)</td><td>ブラウン</td><td>16010256E</td><td></td></tr><tr><td>コーン油</td><td>シグマ</td><td>C8267-500ML</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ(24 x 60 mm #1)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック(メンゼル)</td><td>15747592</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット クライオスターNX70</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>957000H</td><td></td></tr><tr><td>ダコペン(ワックスマーカー)</td><td>アジレント</td><td>S200230-2</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>ディスポーザブルミクロトームブレード(MX35 Ultra)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>705830</td><td></td></tr><tr><td>ファインフォーセプス (Dumont #5)</td><td>ファインサイエンスツール (FST)</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>ガラス製アンチロールプレート</td><td>Histocom</td><td>M 449980</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマ</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>LSM 800 Confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>封入剤</td><td></td><td></td><td>25 mg/mL DAPCO、6 g グリセロール、2.4 g Mowiol 4-88、6 mL dH2O、12 mL 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5)</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Roth</td><td>0713.2</td><td></td></tr><tr><td>正常ロバ血清</td><td></td><td></td> パラホルムアルデヒド Sigma 441244-1KG IGDNSER100ML <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ 323E/D 400RPM</td><td>ワトソン・マーロー</td><td>036.3124.00A</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>シグマ</td><td>S8501-5KG</td><td></td></tr><tr><td>スーパーフロストプラス スライドガラス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>J1800AMNT</td><td></td></tr><tr><td>タモキシフェン</td><td>シグマ</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>組織埋め込み型 T-12 (22mm角)</td><td>株式会社ポリサイエンシズ</td><td>18986-1</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT</td><td>サクラ</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>シグマ</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr><tr><td>塩酸トリズマ</td><td>シグマ</td><td>93363</td><td></td></tr>トゥ<tr><td>イーン-20</td><td>シグマ</td><td>P9416-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェアとプラグイン:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>1.52p</td><td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">Fiji</a></td><td></td></tr><tr><td>MultiStackReg</td><td>1.45</td><td><a href="http://bradbusse.net/sciencedownloads.html" target="_blank">ダウンロードリンク</a></td><td></td></tr><tr><td>TurboReg</td><td></td><td><a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/" target="_blank">EPFL Bioimaging</a></td><td></td></tr><tr><td>Zen Blue</td><td>2.6</td><td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_us/products/microscope-software/zen.html#introduction" target="_blank">Zeiss</a></td><td></td></tr><tr><td>実験モデル: 生物/株:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse: Emx1-CreER</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>JAX:027784</td><td></td></tr><tr><td>Mouse: MADM-11-GT</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>JAX:013749</td><td></td></tr><tr><td>Mouse: MADM-11-TG</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>JAX:013751</td><td></td></tr><tr><td>Primary 抗体:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-GFP 1:500</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-tdTomato 1:500</td><td>Sicgen 抗体</td><td>AB8181-200</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗RFP 1:500</td><td>MBL</td><td>PM005</td><td></td></tr><tr><td>二次抗体:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ロバ 抗チキン Alexa Fluor 488 1:500</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>715-475-150</td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗ヤギ Cy3 1:500</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>705-165-147</td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギ Cy3 1:500</td><td>ジャクソンイムノリサーチ</td><td>711-165-152</td><td></td></tr></tbody></table>

二重マーカーを用いたモザイク解析を用いた大脳皮質の開発における系統トレースとクローン解析(madm)

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers (MADM)

哺乳類大脳皮質は、限られた前駆子のプールから始まり、高度に組織化された機能的神経回路を形成する。しかし、神経幹細胞(NSC)の系統転移を調節する基礎となる細胞および分子メカニズムと、発達中の神経エピテリウムにおけるニューロンおよびグリアの最終的な産生は不明のままである。NSC分裂パターンを追跡し、クローン関連細胞の系統をマッピングする方法は劇的に進歩した。しかし、多くの現代系統トレース技術は、前駆細胞分裂パターンを解読するために不可欠な前生細胞運命の細胞分解能の欠如に苦しんでいる。提示は、二重マーカー(MADM)を用いたモザイク解析を用いたプロトコルで、生体内クローン解析を行う。MADMは、個々の前駆細胞を同時に操作し、前例のない単一細胞分解能で正確な分割パターンと系統進行を可視化します。MMベースの軟体間組換えイベントは、ヒト誘導性CreER T2と共に、ヒト誘導性CreERT2のG2-X相における、クローンの生年月日およびその分割パターンに関する正確な情報を提供する。したがって、MADM系統トレースは、単一細胞レベルでの幹細胞前駆物質の増殖モードの前例のない質的および定量的な光学読み出しを提供する。MADMはまたNSC系統進行の候補遺伝子のメカニズムおよび機能要件の検討を可能にする。この方法は、制御と変異サブクローンの比較分析が生体内の同じ組織環境で行うことができるという中でユニークである。ここで、プロトコルについて詳細に説明し、開発中の大脳皮質におけるクローン解析および系統トレースにMADMを採用するための実験的パラダイムが示されている。重要なことに、このプロトコルは、CreERT2ドライバが存在する限り、任意のマウス幹細胞ニッチにおいてMADMクローン分析を実行するように適応することができる。

二重マーカー(MADM)を用いたモザイク解析を用いて、単一細胞レベルで候補遺伝子の系統トレースと機能遺伝子解析を行うプロトコルを紹介する。MADMクローン解析は、個々の前駆細胞とその娘細胞の増殖行動、細胞出力、および系統関係を測定するための定量的枠組みを提供します。

二重マーカーを用いたモザイク解析を用いた大脳皮質の開発における系統トレースとクローン解析(MADM)

Beginning from a limited pool of progenitors, the mammalian cerebral cortex forms highly organized functional neural circuits. However, the underlying ...

二重マーカー技術によるモザイク解析は、個人幹細胞の増殖行動やセラー出力に関する定量的な情報を提供できる強力な方法です。この技術のユニークな特徴は、単一細胞レベルでの候補遺伝子の系統追跡と機能的遺伝子解析を可能にすることです。プロシージャにカルメン・シュトライヒャー、あなたの技術者、ニコール・アンバージ、ポストドック、ギゼル・チョン、ポストドクターとアンディ・ハンセン、私の研究室の博士課程の学生です。実験マウスでMADM再結合イベントを誘導するには、25ゲージ針を装着した1mlシリンジを使用して、タモキシフェン内腹腔内を妊娠ダムに1回注射します。MADMクローン解析から出生後の時点まで。胚の日に 18 から 19, 妊娠マウスを supine 位置に置き、70%エタノールで毛皮を消毒します。子宮の上の下腹部の皮膚に小さな切開を行い、腹膜を明らかにするために筋肉と腹筋壁を通して2回目の切開を行います。はさみを使用して周囲の組織から子宮を分離し、無傷の子宮を温水で手袋に入れます。その後、細かい先端のはさみと指を使用して子宮壁を慎重に開き、胚を放出します。出生前の動物を里親に移す前に、時々胸を静かに押して呼吸を開始する子犬をきれいにしてください。神経MADMクローン組織を収集するには、麻酔手術トレイ上のスペシン位置に麻酔動物を配置し、70%エタノールで毛皮を消毒します。はさみと鉗子を使用して、皮膚を通して1つの切開を行い、筋肉層を通して1つの切開を行います。胸腔が見える場合は、横隔膜を嗅いで心臓を明らかにし、リブケージを慎重に整頓して手術トレイに固定します。PBSで心血管系を穿ファズし、その後すぐに新たに調製した氷冷4%パラホルムアルデヒドをPBSで灌流する。灌流が完了したら、慎重な解剖を通して脳を取り除き、収穫した器官を新鮮な4%パラホルムアルデヒドの脳容積の少なくとも5倍に4%で一晩置く

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生物学

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子宮内エレクトロポレーション マウス大脳皮質における Cre lox 組換えを誘導します。

この方法は、R26R-Confetti(Confetti)マウスモデルを使用してミネラル化された組織を研究し、繁殖戦略から画像取得に至るすべてのステップをカバーすることを説明します。含まれているすべての軟部組織に適用することができる一般的なプロトコルおよびミネラル化されたティッシュに適用することができる改変されたプロトコル。...

ミネラル化組織を研究するために紙吹雪マウスを用いてクローン遺伝トレース

アストロサイトは大脳皮質を均一にタイル化し、複雑な形態の分析を細胞レベルで困難にします。ここで提供されるプロトコルは、子宮内のエレクトロポレーションに基づく多色標識を使用して、皮質アストロサイトを単一にし、ユーザーフレンドリーな画像解析パイプラインでボリュームと形態を分析します。...

多アドレス可能なゲノム積分色(MAGIC)マーカーを皮質マウスアストロサイトに個別化する子宮内電気的

誘導性トランスジェニック系統トレースマウス系統を用いて幹細胞およびその子孫を蛍光色素で恒久的にマーキングする能力は、...

成体マウス脳における誘導性蛍光標識幹細胞の系統追跡

このプロトコルでは、iDISCO+を使用して無傷のマウス脳の磁気共鳴イメージング、クリアリング、および免疫標識を行う方法について説明し、その後、ライトシート顕微鏡を使用したイメージングの詳細な説明、およびNuMorphを使用したダウンストリーム分析について説明します。...

MRI、組織透明化、ライトシート顕微鏡を用いた無傷新生児マウス脳の全脳単一細胞イメージングと解析

学ぼう、MADMを用いたマウス大脳皮質の系統トレースとクローン解析の手法。単一細胞レベルで前駆細胞の増殖行動と細胞産出を定量的に測定し、発生生物学における遺伝子機能を解明する。

二重マーカーを用いたモザイク解析を用いた大脳皮質の開発における系統トレースとクローン解析(MADM)

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