高濃度単一分子顕微鏡のためのゼロモード導波ガイドの作製

ここで紹介するゼロモード導波路の作製用ナノスフィリソグラフィープロトコルは、特殊な作製ツールや設備を必要としない、利用しやすく低コストの方法です。この方法は、単一分子生物物理学に有用であり、より多くの研究者が生物学的に適切な濃度の蛍光試薬で単一分子実験を行うことを可能にします。コロイド粒子の蒸発堆積のためのきれいな表面を作成するには、光学ホウケイ酸ガラスカバースリップをCoplinガラス染色ジャーの溝付きインサートに配置します。

カバースリップを覆い、ジャーを覆うのに十分なアセトンを染色ジャーに充填します。瓶を摂氏40度で10分間超音波処理します。アセトンを注ぎ、カバースリップを蒸留水で3回すすいでください。

超音波処理とアセトンを繰り返した後、カバーガラスを覆うのに十分な水酸化カリウムを瓶に満たします。蓋をした瓶を再び40°Cで20分間超音波処理します。カバーガラスを蒸留水で6回すすぎ、エタノールで摂氏40度で10分間超音波処理します。

カバースリップを蒸留水で3回洗った後、鉗子を使用して各カバースリップの端をそっと持ち上げます。各カバースリップを窒素ガスで乾燥させ、清潔で乾燥したカバースリップと専用のシャーレを置きます。1ミクロンの非機能ポリスチレンビーズの50マイクロリットルを遠心分離します。

上清を捨て、水の残りをできるだけ少なくします。ビーズを50マイクロリットルの溶媒に再懸濁し、ピペッティングで十分に混合します。蒸着用の湿度チャンバーを設置するには、6つのシャーレを一列に並べます。

各シャーレに1枚のカバースリップを置き、カバースリップが環境にさらされるように配置して、蓋を少し半開きにします。湿度計と小型の扇風機をペトリ皿の後ろの中央に設置し、実験室の相対湿度を記録します。200ミリリットルのビーカーに150〜200ミリリットルの水を摂氏約75度で満たし、ビーカーをファンの後ろに置きます。

ファンをオンにしてから、シャーレ、ファン、ビーカー、湿度計をひっくり返した透明なプラスチック製の保管容器で覆います。相対湿度が70〜75%に達したら、プラスチック製の保管容器を少し持ち上げ、カバースリップの濡れすぎを防ぐためにペトリ皿の蓋をすばやく閉じます。チャンバー内の相対湿度が85%に達すると、ビーズ懸濁液の5マイクロリットルを各カバースリップの中央にピペット

堆積直後に各ペトリ皿を覆い、堆積物の間にすべてを保管容器に覆いを入れます。ビーズの堆積は、湿度の損失を最小限に抑えるために、できるだけ早く完了する必要があります。蒸着が乾燥しすぎたり湿りすぎたりする場合、チャンバーの湿度は最適化する最も重要な変数です。

6回の蒸着がすべて完了したら、チャンバー内の相対湿度を記録し、ビーズ液滴を広げて5分間乾燥させます。ポリスチレンビーズの焼きなましに均一な温度面を提供するには、標準的なセラミックホットプレートの上に平らなフライス加工されたアルミニウムプレートを置き、ホットプレートの温度をポリスチレンのガラス転移温度である摂氏107度に設定します。ビーズテンプレートを含むカバースリップを熱いアルミニウムプレートに置きます。

20秒間焼きなましした後、カバーガラスをアルミプレートから取り外し、すぐに室温のアルミ面に置いて冷まします。熱蒸着法を用いて、ビーズテンプレートを含むカバースリップ上に毎秒2オングストロームで300ナノメートルの銅を堆積させます。これにより、ビード間の隙間にポストが生成されます。

ビーズから余分な銅を取り除くには、テープを表面にそっと押し付けてから、テープをゆっくりとはがします。ポリスチレンビーズをトーレンに入れて溶かし、一晩放置します。カバースリップの取り扱いには注意を払い、クロロホルムで1回、エタノールで2回すすぎます。

テンプレートを窒素で乾燥させます。酸素プラズマクリーナーに30分間入れて、残留ポリマーと汚染物質を取り除きます。熱蒸着法を用いて、3ナノメートルのチタン接着層を毎秒1オングストロームで堆積させ、次に100〜150ナノメートルのアルミニウムを毎秒4オングストロームで銅ポストの周囲および上に堆積させます。

一部の蒸着ユニットで自動的に行われるように、蒸着中にサンプルが回転していないことを確認してください。銅の支柱を溶かすには、カバーガラスを銅のエッチング液に2時間浸します。カバーガラスを蒸留水ですすいだ後、窒素で乾かし、レンズペーパーで表面をやさしく磨いて、まだクラッディングで覆われている支柱を露出させます。

カバーガラスを銅エッチング液にさらに2時間浸した後、蒸留水で再度すすぎ、窒素で乾燥させます。表面パッシベーション後、ゼロモード導波路カバースリップを両面粘着テープを使用して石英スライドと組み合わせ、単一分子イメージング用のマイクロ流体フローチャンバーを作製できます。コロイドテンプレートの自己組織化の成功は、相対湿度に大きく依存します。

整形式のテンプレートでは、ビーズの領域は円形で、境界は不透明な多層リングによって定義されます。整形式のテンプレートでは、ほとんどのテンプレートに六角形に密集したビーズが含まれている必要があります。蒸発沈殿中の詰まりにより、粒子間にいくつかの欠陥が生じます。

銅の堆積とポリスチレンビーズの溶解後、銅ポストは直径150ナノメートル未満である必要があります。銅の堆積深さが300ナノメートルの場合、ポストの高さは約250ナノメートルです。アルミニウムクラッディングの堆積とそれに続く銅ポストの溶解後、導波路は原子間力顕微鏡で視認でき、約550ナノメートルの間隔で配置する必要があります。

ポリスチレンテンプレートを20秒間アニールすると、可視光の伝搬を遮断するのに十分な小ささの直径118ナノメートルのアルミニウム導波路が作られました。イメージング用のZMWの典型的なフィールドには、40 x 80ミクロンの視野に3, 000の導波路が含まれています。ZMWの機能性をテストするために、単一分子FRETを実行しました。

1分子FRETトレースは、試験したすべての濃度の周囲Cy5蛍光色素で検出可能でした。それに比べて、単一分子は、ピコモルから低ナノモル濃度のTERF照明でのみ検出できます。ゼロモード導波路作製後、デバイスをポリマーで不動態化して、単一分子イメージング中の非特異的相互作用を低減することができます。

ゼロモード導波路のガラス底部は、単一分子の放出を強化するためにわずかにエッチングすることもできます。全体として、この新しいゼロモード導波路作製法により、研究者は細胞内の濃度と速度に近い濃度と速度での転写や翻訳などの動的な生化学的プロセスをより簡単に調査できるようになります。