1型糖尿病と複数の自己免疫疾患を同時にスクリーニングするハイスループット電気化学発光7-Plexアッセイ

電気化学発光アッセイは、1型糖尿病と、自己免疫クライオ病、セリアック病、自己免疫性多腺症候群-1などの他の関連する自己免疫疾患を同時にスクリーニングできます。非常に複雑なECRアッセイは、最大10の複数の抗体アッセイを1つのウェルに組み合わせることで、ハイスループット、ライブラリの削減、および広範なボリュームを必要としない安価なアッセイを実現します。手順を実演するのは、私の研究室からの投稿であるXiaofan Jiaです。

混合リンカー共役抗原溶液を調製するには、まずチェッカーボードアッセイに基づいて各抗原に最適な濃度を選択し、ビオチンおよびルテニウム標識抗原を合理的な使用濃度に希釈します。それぞれに異なるリンカーを特異的なビオチン化抗原に結合させるために、1つの96ウェルプレイアッセイで、240マイクロリットルの適切なストレプトアビジン標識リンカーと4マイクロリットルの目的のビオチン化タンパク質を混合しました。次に、チューブあたり156マイクロリットルの1%BSAを加え、混合物を室温で30分間インキュベートします。

インキュベーションの終了時に、各チューブに160マイクロリットルの停止溶液を加え、チューブをさらに30分間室温でインキュベートします。インキュベーションの終了時に、各チューブから400マイクロリットルのリンカー結合抗原を取り出し、7つの抗原懸濁液すべてを1本のチューブに引き込みます。次に、1.2ミリリットルの停止溶液と4マイクロリットルのRuスルホNHS標識GAD65、TPO、tTg、ThG、プロインスリンインターフェロンアルファ、およびIA2抗原を混合物に加えます。

標識抗原混合物と血清サンプルをインキュベートする前に、96ウェルPCRプレートのウェルあたり15マイクロリットルの血清を加え、0.5モル酸性酸18マイクロリットルを血清の各ウェルと混合して、室温で45分間インキュベートします。インキュベーション中に、新しい96ウェルPCRプレートのウェルごとに35マイクロリットルの抗原と1モルトリスバッファー13マイクロリットルを追加します。インキュベーションの終わりに、直ちに25マイクロリットルの酸処理血清を抗原プレートの各ウェルに移す。

プレートをPCRシーリングホイルで覆い、プレートを室温で低速で1時間シェーカーに置きます。インキュベーションの終わりに、プレートを摂氏4度で18〜24時間置きます。プレートを冷蔵庫から取り出し、室温に戻します。

次に、150マイクロリットルの3%ブロッカーAバッファーを各ウェルに加えます。すべてのウェルが処理されたら、プレートを天井ホイルで覆い、プレートを摂氏4度の冷蔵庫に一晩置きます。翌朝、プレートを逆さまにし、1ウェルあたり150マイクロリットルのPBS-Tでサンプルを3回洗浄します。

どのウェルにもバッファーが残らなくなるまでプレートを軽くたたいます。30マイクロリットルの血清抗原を各ウェルにインキュベートします。すべてのインキュベートを添加したら、プレートをホイルで覆い、プレートを室温で1時間低速でシェーカーに置きます。

インキュベーションの最後に、インキュベートをフリックして取り出し、示されているように、ウェルごとに150マイクロリットルのPBS-Tでウェルを3回洗浄します。最後の洗浄後、各ウェルに150マイクロリットルの読み取りバッファーを追加し、プレートリーダーでプレートを1秒あたりのカウント数で読み取ります。新たに診断された1026人の1型糖尿病患者からのサンプルの大規模なコホートのこの分析では、7プラスエレクトロルミネッセンスアッセイからの自己抗体のレベルを、対応する確立された各シングルエレクトロルミネッセンスアッセイおよび対応する各シングル標準ラジオ結合アッセイおよびELISAからのレベルと比較しました。

アッセイの特異性は、95パーセンタイルが使用された甲状腺自己抗体を除いて、すべての自己抗体アッセイの99パーセンタイルで同一でした。7つの自己抗体のそれぞれについて、各アッセイのカットオフの境界線付近で少数の不一致サンプルが見つかりました。ここでは、各アッセイの1022人の健康なコントロールに対応するデータを観察できます。

覚えておくべき最も重要なことは、それぞれに固有のビオチン化抗原に対して異なるリンカーを見つけ、各抗原を結合リンカーを提供する特性と混合することです。このアッセイ技術により、研究者は大規模な集団で複数の自己免疫疾患のスクリーニングを同時に計画し、クリニックは1型糖尿病の複数の関連疾患を簡単にスクリーニングできるようになります。