マウスにおけるペリオスチール骨格幹細胞のCCL5誘導性移行のリアルタイムイメージング

標準化されたプロトコルは、内因性細胞遊走の評価に使用でき、いくつかの細胞タイプや骨格表現型に適用できます。この技術の利点は、損傷やサイトカイン治療に応答した細胞集団ではなく、個々の細胞についてin vivo細胞移動を追跡できることです。手順を開始する前に、麻酔をかけたマウスのつま先をつまんでも反応がないことを確認し、動物の目に軟膏を塗布します。

次に、右耳のすぐ内側から左耳に向かって横方向の1センチメートル未満の切開を行い、最初の切開から右目を過ぎて鼻に向かって約2〜3ミリメートルの2回目の切開を行います。鉗子を使用して皮膚を骨膜から分離し、はさみを使用して結合組織を優しく切り込み、皮膚を頭蓋骨から分離します。滅菌綿棒を使用して、皮膚フラップの上部に眼科用軟膏を塗布し、フラップを左目の上にそっと折ります。

矢状縫合糸と冠状縫合糸の交点は、はっきりと露出する必要があります。開いた表面を滅菌PBSで洗い流して、血液や残留毛の領域をきれいにし、冠状縫合糸から鼻に向かって1〜2本の針幅にベベルの先端を置き、矢状縫合糸の右側に1〜2本の針幅を配置します。ごく少量の下向きの圧力を使用して、シリンジを時計回りに1回、反時計回りに数回慎重に回転させます。

次に、27ゲージの針を使用して、マイクロフラクチャーを約40マイクロメートルに広げます。骨片が残っている場合は、PBSでマイクロフラクチャーを洗い流します。それでも骨片が残っている場合は、29ゲージの針を使用して破片をやさしくすくい取ります。

CCL5処理には、100ナノグラム/ミリリットルのストックCCL5溶液と基底膜マトリックスを使用して、10ナノグラム/ミリリットルの作用する化学誘引性溶液を得ます。怪我を治療するには、220マイクロリットルのピペットに5マイクロリットルの溶液をロードし、2マイクロリットルのケモカインを縫合糸に塗布します。次に、マトリックスを固化させ、頭蓋骨を皮膚フラップで優しく覆い、1時間のケモカイン治療中に組織が脱水状態にならないようにします。

骨膜幹細胞の遊走をリアルタイムで生体内イメージングするには、マウスを顕微鏡に移す前に、マウスの後頭部に穏やかな圧力をかけて、頭蓋骨の視面を確認します。平面が水平でない場合は、マウスの拘束具を左または右にゆっくりと回転させて位置を調整します。次に、皮膚フラップの頭蓋全体を滅菌した2%メチルセルロース水で覆い、マウスをXYZ軸電動顕微鏡ステージに置きます。

エピ蛍光光を使用して、マウスが顕微鏡に面し、冠状縫合糸と矢状縫合糸の交点がステージの中心基準点になるようにマウスの位置を合わせます。次に、イメージングエリアにガラスカバーを置き、位置合わせを再確認します。縫合糸への出入りのタイムラプスイメージングには、低倍率の水浸レンズを選択して頭蓋骨をスキャンします。

矢状縫合糸と冠状縫合糸の交差の参照画像を取得し、細胞からのSHGおよび蛍光信号を使用して、各損傷部位を特定し、XYZ座標と矢状縫合糸および冠状縫合糸からの距離を記録します。長期イメージングのために冠状縫合糸または矢状縫合糸のいずれか上の位置を選択し、イメージング中に参照からこの領域の詳細なZStack画像を取得します。タイムラプスソフトウェアの設定を使用して、スナップショット間の時間内の現在の視野と最初の視野を比較して、少なくとも1時間にわたって1分ごとに画像を録画します。

視野が異なる場合は、ZStack 画像を使用して、視野を調整する必要がある方向を判断します。最近、骨膜骨格幹細胞がMx1陽性α-SMA陽性二重標識によってマークされるMx1トマトα-SMA GFPレポーターマウスが作製されました。縫合糸埋入後24時間後の1時間のイメージングでは、Mx1陽性のα-SMA陽性の骨膜骨格幹細胞の遊走がほとんどまたはまったく観察されません。

損傷の 24 時間後に頭蓋骨欠損の CCL5 ケモカイン治療を行うと、冠状縫合糸から損傷部位への方向的に明確な移動が誘発されます。この代表的な解析では、イメージングから1時間以内に、Mx1陽性α-SMA陽性の骨膜骨格幹細胞の1つが損傷に向かって約50マイクロメートル移動しました。このプロトコルの最も重要な側面を覚えておくべきは、細胞特異的な移動を刺激するために、CCL5治療を損傷部位に限定することです。

この手順が完了すると、局所治療を1週間継続できます。マイクロCTは、カルバリア損傷の治癒とミネラル沈着を評価するために使用できます。