Name: 肺上皮細胞における シュードモナス 感染に及ぼすタバコの煙の影響の研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 学ぶタバコ煙抽出液が肺上皮細胞におけるPseudomonas細菌の定着に与える影響を評価する方法です。細菌負荷の測定技術を含む再現性の高い実験手順を解説します。

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この研究は、国立衛生研究所R01がHL125435とHL142997(CZに)を付与することによって部分的にサポートされました。

1. 100% CSEの準備
<ol><li>10 mL の無血清細胞培養培地(BeAS-2B 細胞の DMEM/F12、HSAEC 細胞用の気道上皮細胞基底培地)を 60 mL シリンジに引き出します。</li>
	<li>適切にトリミングした1mLピペットチップをシガレット(3R4F)を保持するアダプターとしてシリンジのノズルに取り付けます。</li>
	<li>タバコのフィルターを取り外します。チップアダプターにタバコを取り付け、タバコを燃焼させます。</li>
	<li>無血清培地の10mLに40mLの煙含有空気を引き込む。激しく揺れる(1回の引き分けにつき30秒)と煙を混ぜます。</li>
	<li>約11倍のステップ11xを、タバコが完全に燃え尽きるまで7分ほど繰り返します。</li>
	<li>10 mLのスモークメディアを0.22 μmフィルターで濾過し、微生物や不溶性粒子を除外します。閉じた無菌チューブに移します。100%CSEを30分以下で準備してから、その後のアッセイを行ってください。</li>
</ol>2. シュードモナス 文化
<ol><li>凍結した P.緑素吸い( 株PAO1)または P.フルオレセンスミグラ (株PAO143)をトリプティック大豆ブロス(TSB)寒天プレートに接種し、37°Cで一晩培養する。 注:培養に十分な細菌を得るために、できるだけ多くの細菌をTSB寒天プレートに広げます。</li>
	<li>細菌の汚れを収集し、炭素源としてグリセロールの5%とTSBの20 mLでインキュベート。</li>
	<li>37°Cインキュベーターで37°Cインキュベーターで1時間、OD600 値=0.6になるまで振ります。 注意: 揺れの速度が200 rpmを超えないようにしてください。より高い揺れ速度は、細菌のバテラの形態を損傷し、肺上皮への細菌の侵入に影響を与える可能性があります。同様に、高侵襲性細菌を得るために揺れ時間を1時間に制限する。OD600 値を測定して、細菌の数を推定する。OD600 = 1 は、〜109 コロニー形成単位(CFU)/mL に対応します。</li>
</ol>3. ヒト肺上皮細胞培養とCSE治療
<ol><li>ヒトBEAS-2B細胞をHITES培地で培養(500 mLのDMEM/F12、 2.5 mgインスリン、2.5mgトランスフェリン、2.5mgセレニン、2.5mgトランスフェリン、10μMヒドロコルチゾン、10μM βエストラジオール、10mM HEPES、および2mM L-グルタミン)を10%のウシ血清(FB)を補った。</li>
	<li>培養ヒト一次小気道上皮細胞(HSAEC)の気道上皮細胞培地(気道細胞基底培地の500mL、 500 μg/mL HSA, 0.6 μM リノール酸, 0.6 μg/mL レシチン, 6 mM L-グルタミン, 0.4% エキス P, 1.0 μM エピネフリン, 5 μg/mL トランスフェリン, 10 nM T3, 1 μg/mL ヒドロコルチゾン, rhGF 5 g/m/m, インスリン).5%CO2で37°Cで細胞をインキュ2ベートする。</li>
	<li>細胞がプレートの底から完全に剥離するまで、0.25%のトリプシンを1 mLで5分間解離します。</li>
	<li>完全なHITES培地の10 mLを加えてトリプシンを中和し、15 mLチューブ内の細胞を集めます。遠心分離機 300 x g で 4 °C で 5 分間 注意:過剰消化は細胞死を引き起こす可能性があるため、顕微鏡によるトリプシン消化の時間を注意深く監視する。</li>
	<li>上清を捨て、10%FBSでHITES培地2mLの細胞を再懸濁します。</li>
	<li>上記の細胞懸濁液のピペット10μLをプレートに挿入し、自動セルカウンターに挿入して細胞/mLの濃度を得る。</li>
	<li>BEAS-2B細胞を3×10個 の5細胞/mLの濃度で6ウェルプレートにプレートし、一晩培養のためにFBSの10%を添加したHITES培地で2mLの総体積を2mLにした。</li>
	<li>約80%の合流度、または5 x 105 細胞/mLで細胞を、3時間CSEの4%で治療します。CSE処理の前に、FBSの1%でHITES培地で媒体を交換してください。</li>
</ol>4. 細菌感染
<ol><li>P.エルギノーザまたはP.フルオレセンスミグラ(1×17 CFU/mL)をCSE処理細胞の各ウェルに加え、5%CO2で37°Cで1時間インキュベートする。7 2</li>
	<li>上清を吸引し、4%CSEおよび100 μg/mLのゲンタマイシンと扱うために2 mLの新鮮なHITES媒体と交換してください。 注:ゲンタマイシンは、ヒト肺上皮細胞膜に浸透することができないので使用されます。したがって、それは培地内のすべての細菌を殺すことができるが、肺上皮細胞に侵入したものではない。</li>
	<li>CSE/ゲンタマイシン処理を5%CO2で37°Cで1時間2処理した後、上清を吸引し、その後の細菌濃度決定のために細胞3xをPBSで洗浄した。 注:内在菌を確認するために、GFP標識 P.フルオレセンスミグラに感染した細胞は、蛍光顕微鏡下で観察されました。</li>
</ol>5. ドロッププレート法による細菌濃度の測定
<ol><li>ドロッププレート法で感染した細胞の細菌負荷を判定するには、ゲンタマイシン処理した細胞を2mLの冷たいPBSで洗浄します。</li>
	<li>各ウェルに細胞溶菌バッファー(PBSで0.5%トリトンX-100)の1 mLを加えます。</li>
	<li>TSB寒天板への次の接種のために、内在化した細菌を含む細胞ライセートを勾配(1:10、1:100、1:1,000、および1:10,000)で希釈します。</li>
	<li>16時間のインキュベーション後、細菌コロニーをカウントしてCFUの結果を得る。</li>
</ol>細菌16S rRNAのRT-qPCR検出
<ol><li>上述のようにゲタマイシンを用いて、シュードモナス感染肺上皮細胞(〜1 x 106細胞/mL)を治療する。6培地を吸引し、2mLの冷たいPBSで細胞2倍を洗浄する。</li>
	<li>6ウェルプレートのウェルあたりグアニジウムチオシアネートライシスバッファーの0.35 mLを追加します。セルスクレーパーでセルを収集します。ライゼートをマイクロ遠心分離チューブにピペットし、ピペットとやさしく混ぜます。</li>
	<li>作りたての70%エタノールを同じボリューム(0.35mL)をlysateに加え、よく混ぜます。すべてのサンプルを 2 mL コレクションチューブに配置されたスピンカラムに移します。20~25 °Cで30sの10,000 x g で遠心分離機。 その後、コレクションチューブ内のバッファを廃棄します。</li>
	<li>0.7 mLの洗浄バッファー 1 でカラムを洗浄します。30 s の場合、10,000 x g の列を遠心分離します。0.5 mLのバッファーでカラム2xを洗浄し、膜結合RNAを洗浄します。10,000 x g で 2 分間遠心分離を繰り返します。</li>
	<li>柱を新しい 1.5 mL コレクションチューブに配置します。30~50 μL のRNaseフリーウォーターを追加します。10,000 x g で1分間遠心分離機。フロースルーを収集し、RNA濃度を測定します。</li>
	<li>製造者のプロトコルに従って逆転写反応を行います。全RNAの1μgを10 mLの反応バッファー、1μLの逆転写酵素、RNaseフリー水と混合して20μLの反応を行います。37°Cで1時間、95°Cで5分間逆転写反応を行います。</li>
	<li>cDNAテンプレート(上記の各逆転写反応の1 μL)、SYBR色素を含むマスターミックスの5 μL、200 nM特異的プライマーのそれぞれ1μL、および20μL混合物中の水を混ぜ合わせて、以下のPCR分析を行います。 注:以下は 、P.エルギノーザの16S rRNAを標的とするプライマーです: フォワード5'-CAAACTGAGCTAGAGTACG-3';逆5'-TAAGATCTCAAGガタクタCGGC-3′。 GAPDH は、次のプライマーを持つ負荷制御として使用されました: 前方: 5'-GGCATGGACTGGTCATGA-3′;逆:5'-TTCACCATGGAGAAGGC-3′。</li>
	<li>比較CT法を用い、式を決定します。</li>
</ol>7. フローサイトメトリーを用いた蛍光 シュードモナス の検出
<ol><li>上記の蛍光 シュードモナス-感染肺上皮細胞(〜1 x 106 細胞/mL)を前に述べたようにゲンタマイシンで治療する。培地を吸引し、2mLの冷たいPBSで細胞2倍を洗浄する。</li>
	<li>GFPの検出のために509 nmの波長のフローサイトメーターでサンプルを分析しなさい。各読み取り値を 100,000 カウントで終了します。取得したデータを関連ソフトウェアで分析します。</li>
</ol>

<ol><li>Vogelmeier, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Strategy+for+the+Diagnosis%2C+Management%2C+and+Prevention+of+Chronic+Obstructive+Lung+Disease+2017+Report.+GOLD+Executive+Summary%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).</li>
<li>Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+for+lung+cancer+worldwide%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Care+Journal%22%5BJournal%5D)">Risk factors for lung cancer worldwide.</a> European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).</li>
<li>Lugade, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+exposure+exacerbates+lung+inflammation+and+compromises+immunity+to+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).</li>
<li>Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+Smoke+Induces+and+Alters+Immune+Responses+in+the+Lung+Triggering+Inflammation%2C+Allergy%2C+Asthma+and+Other+Lung+Diseases%3A+A+Mechanistic+Review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Environmental+Research+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review.</a> International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).</li>
<li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrelated+role+of+cigarette+smoking%2C+oxidative+stress%2C+and+immune+response+in+COPD+and+corresponding+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).</li>
<li>Morse, D., Rosas, I. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+smoke-induced+lung+fibrosis+and+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema.</a> Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).</li>
<li>Rigotti, N. A., Clair, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+tobacco+use%3A+the+neglected+cardiovascular+disease+risk+factor%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor.</a> European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).</li>
<li>Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco-related+carcinogenesis+in+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Review%22%5BJournal%5D)">Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer.</a> Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).</li>
<li>Papi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+and+airway+inflammation+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease+severe+exacerbations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).</li>
<li>Garcia-Vidal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+in+patients+hospitalised+for+COPD+exacerbation%3A+a+prospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study.</a> European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).</li>
<li>Murphy, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).</li>
<li>Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPD+exacerbations%3A+defining+their+cause+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">COPD exacerbations: defining their cause and prevention.</a> Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).</li>
<li>Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exacerbations+of+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Chronic+Obstructive+Pulmonary+Disease%22%5BJournal%5D)">Exacerbations of COPD.</a> International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, Spec Iss 21-30 (2016).</li>
<li>Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+infection+and+the+pathogenesis+of+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Bacterial infection and the pathogenesis of COPD.</a> Chest. 117 (5), Suppl 1 286-291 (2000).</li>
<li>Weinreich, U. M., Korsgaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+colonisation+of+lower+airways+in+health+and+chronic+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease.</a> Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).</li>
<li>Hook, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+staphylococcal+aggregation+protects+against+lethal+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).</li>
<li>Ross, K. F., Herzberg, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+immunity+in+mucosal+epithelial+cells%3A+fortifying+the+barrier+against+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infection%22%5BJournal%5D)">Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection.</a> Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).</li>
<li>Bedi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+agonists+attenuate+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa.</a> FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).</li>
<li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+p21%28CIP1%2FWAF1%29+and+B+cell+lymphoma+leukemia-x%28L%29+expression+and+reduced+apoptosis+in+alveolar+macrophages+from+smokers%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).</li>
<li>Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+decreases+airway+epithelial+FABP5+expression+and+promotes+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection.</a> PLoS One. 8 (1), 51784(2013).</li>
<li>Thorne, D., Adamson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+in+vitro+cigarette+smoke+exposure+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">A review of in vitro cigarette smoke exposure systems.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).</li>
<li>Keyser, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+for+assessment+of+dose+in+in+vitro+evaluations+using+a+VITROCELL%28R%29+VC10%28R%29+smoke+exposure+system%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system.</a> Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).</li>
<li>Del Arroyo, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+modulation+of+glutamate+release+in+activated+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils.</a> EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).</li>
<li>Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+modulates+p300+and+Sirt1+to+promote+PRMT1+stability+via+an+SCF%28Fbxl17%29-recognized+acetyldegron%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron.</a> Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).</li>
<li>Bauman, S. J., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+vesicles+associate+with+and+are+internalized+by+human+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells.</a> BMC Microbiology. 9, 26(2009).</li>
<li>Ichikawa, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+pseudomonas+aeruginosa+with+epithelial+cells%3A+identification+of+differentially+regulated+genes+by+expression+microarray+analysis+of+human+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).</li>
<li>Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis%3A+An+essential+issue+for+in+vitro+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiologyopen%22%5BJournal%5D)">Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays.</a> Microbiologyopen. 7 (2), 00588(2018).</li>
<li>Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+extract+modulates+Pseudomonas+aeruginosa+bacterial+load+via+USP25%2FHDAC11+axis+in+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).</li>
<li>Feldman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+flagella+in+pathogenesis+of+Pseudomonas+aeruginosa+pulmonary+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection.</a> Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Agitation%2C+Aeration+and+Temperature+on+Production+of+a+Novel+Glycoprotein+GP-1+by+Streptomyces+kanasenisi+ZX01+and+Scale-Up+Based+on+Volumetric+Oxygen+Transfer+Coefficient%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient.</a> Molecules. 23 (1), 125(2018).</li>
<li>Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminoglycosides%3A+activity+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Aminoglycosides: activity and resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-1+receptor+antagonists+prevent+the+development+of+pulmonary+emphysema+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats.</a> European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).</li>
<li>Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+anti-emphysema+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+in+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Animal models for anti-emphysema drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+model+of+primary+human+pediatric+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells.</a> Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).</li>
<li>Amatngalim, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+epithelial+differentiation+by+cigarette+smoke+dysregulates+respiratory+host+defence%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence.</a> European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009(2018).</li>
<li>Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+airway+organoid+engineering+as+a+step+toward+lung+regeneration+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling.</a> Biomaterials. 113, 118-132 (2017).</li>
<li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li>
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著者らは開示するものは何もない。

肺上皮細胞への細菌の侵入は、細菌感染の病因における重要なステップである。細菌の細胞への侵入のプロセスは、次の3つのステップに分けることができます:まず、細菌が接触し、それらのフラゲラを使用して上皮細胞の表面に付着します。第二に、細菌は内在化を受けるか、細胞膜に浸透する。最後に、細菌は細胞防御機構25,26を正常に脱出すれば細胞を複製し、コロニー形成する。肺ミクロファージにおける細菌感染の観察のためのアプローチは長い間開発されてきたが、肺上皮細胞27,28,28の限られた知識を有する。この研究は、ドロッププレートアッセイ、シュードモナスリボソーム16S RNAのRT-qPCR、フローサイトメトリーの3つのアプローチを介して肺上皮細胞の細菌負荷を決定した。3 つのアプローチはすべて、同様の感度でうまく機能します。肺上皮細胞における細菌負荷を決定するアプローチを選択することは、機器の可用性と時...

タバコの喫煙は、世界中の何百万人もの人々の公衆衛生に影響を与えます。肺癌や慢性閉塞性肺疾患(COPD)を含む多くの有害性疾患は、タバコの喫煙11,22に関連していると報告されている。タバコの喫煙は、呼吸器系,3、4、54における急性微生物感染に対する3感受性を高める。5さらに、取り付け証拠は、タバコの喫煙が多くの慢性疾患66、7、87,8の病因を高めることを証明する。例えば、タバコの喫煙は、COPDの悪化を引き起こすウイルスまたは細菌感染を増加させる可能性があります9.COPDの急性増悪に病因となる細菌病原体の中で、日和見グラム陰性バチルス病原体である緑膿菌は、予後不良および死亡率の高い10,11,11と相関する感染症を引き起こす。COPD増悪は病理学的進行を加速することによって病気を悪化させる。COPDの悪化に対する有効な治療法は、抗無症候性管理12を除いてはない。COPDの悪化は患者の死亡率を促進し、生活の質を低下させ、社会13の経済的負担を増大させる。
呼吸器気道は開放系であり、外部に存在する種々の微生物病原体に連続的に供される。日和見細菌病原体は、通常、上気道で検出されるが、時には下気道14、15,15で観察される。動物モデルではP.緑素吸虫は、感染16後1時間と速やかに肺胞嚢で検出することができる。主要な防御機構として、マクロファージや好中球などの免疫細胞は、気道内の細菌を排除する。肺上皮細胞は、第1の生理学的障壁として、微生物感染に対する宿主防御において独特の役割を果たす。肺上皮細胞は、免疫細胞17から独立した微生物の浸潤、コロニー形成、または複製を調節することができる。PPARgを含む上皮細胞に見られるいくつかの分子は、抗菌機能を発揮し、それによって肺上皮細胞18における細菌コロニー形成および複製を調節する。タバコの喫煙は、分子を変化させ、肺上皮細胞19,20,20における正常な防御機能を損なう可能性がある。最近の研究では、ロボット喫煙装置21,22を用いて肺上皮細胞へのタバコの煙の直接暴露が22報告された。しかし、煙への暴露は、CSEの適用を含む他の方法で行うことができます。CSEの調製は、間接的にタバコの煙にさらされている血管内皮細胞を含む他の細胞タイプの潜在的な用途を有する再現可能なアプローチである。
本報告書は、肺上皮細胞の細菌負荷を変化させるタバコの煙抽出物を生成するプロトコルについて説明する。CSEは 、緑内科の細菌負荷を増加させ、COPD悪化に通常見られる細菌感染の再発に寄与する可能性がある。CSEの調製には、従来の方法が使用されます。肺上皮細胞は、その指数成長段階で、3時間の4%CSEで処理される。あるいは、単層培養肺上皮細胞は、空気液体界面でタバコの煙に直接曝すことができる。CSE処理細胞は、その後、10の感染の多重性(MOI)で シュードモナス で挑戦されます。細菌は、そのフラゲラの形態が完全な侵襲能力を保持するためにそのまま残っていることを確認するために、特定の揺れの速度で伝播されます。ゲンタマイシンは、培養培地に残された細菌を殺すために採用され、それにより、細菌負荷のその後の判定時に潜在的な汚染を低減する。このプロトコルはまた、さまざまなモデルで シュードモナス感染を研究する強力なツールとして利用されているGFPラベル付き シュードモナスを 使用しています。代表的な株は 、P.フルオレセンの ミグラ23です。CSE治療後の感染性または細菌負荷の程度は、コロニー計数を伴うドロッププレート法、 シュードモナス 16S rRNA特異的プライマーを用いた定量PCR、または蛍光 シュードモナスに感染した細胞におけるフローサイトメトリーの3つの方法で決定される。このプロトコルは、肺上皮細胞の細菌感染に対するタバコの煙の影響を研究するための簡単で再現可能なアプローチです。

<table><tbody><tr><td>50mLシリンジ</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>airway epithelial cell basal medium</td><td>ATCC</td><td>PCS-300-030</td><td></td></tr><tr><td>バクテリアシェーカー</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>気管支上皮細胞増殖キット</td><td>ATCC</td><td>PCS-300-040</td><td></td></tr><tr><td>Cell Counter</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time PCR System</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>大容量 RNA-to-DNA KIT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4387406</td><td></td></tr><tr><td>HITES medium</td><td>ATCC</td><td>ATCC 30-2004</td><td></td></tr><tr><td>ヒト BEAS-2B 細胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-9609</td><td></td></tr><tr><td>ヒト初代小気道上皮細胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-300-030</td><td></td></tr><tr><td>LSRII フローサイトメーター</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニッコン共焦点顕微鏡</td><td>ニッコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ODリーダー</td><td>USA サイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCRプライマー</td><td>ITD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>緑膿菌</td><td>ATCC ATCC</td><td>47085</td><td>PAO1-LAC</td></tr><tr><td>シュードモナスフルオレッセンス ミグラ</td><td>ATCC</td><td>ATCC 27853</td><td>緑膿菌 GFP</td></tr><tr><td>研究用タバコ (3R4F)</td><td>ケンタッキー大学</td><td>TP-7-VA</td><td></td></tr><tr><td>RNeasyミニキット</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>トランスプレントPETトランズウェルインサート</td><td>コーニング共星</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリプシン大豆ブロス</td><td>BDバイオサイエンス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

肺上皮細胞における シュードモナス 感染に及ぼすタバコの煙の影響の研究

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

タバコの喫煙は肺肺気腫や慢性閉塞性肺疾患(COPD)の主要な病因である。タバコの喫煙はまた、呼吸器系における細菌感染に対する感受性を促進する。しかし、タバコの喫煙がヒト肺上皮細胞の細菌感染に及ぼす影響は、まだ十分に研究されていない。ここで説明するのは、タバコ喫煙抽出物(CSE)の調製、ヒト肺上皮細胞のCSEによる治療、および細菌感染および感染判定の詳細なプロトコルである。CSEは、従来の方法で調製した。肺上皮細胞は、CSE処理細胞を3hに対して4%CSEで処理し、その後、10の多重性の感染(MOI)で シュードモナス に感染した。細胞の細菌負荷は、3つの異なる方法によって決定した。その結果、CSEは肺上皮細胞における シュードモナス 負荷を増加させる。したがって、このプロトコルは、肺上皮細胞における細菌感染に対するタバコの煙の影響を研究するための簡単で再現可能なアプローチを提供する。

図を使用して、図 1にプロトコルを示します。肺上皮BEAS-2B細胞はCSEで治療され、シュードモナスで挑戦した。培地中のシュードモナスを添加したゲンタマイシンによって殺され、細胞はドロッププレートアッセイ、シュードモナスリボソーム16S RNAのRT-qPCR検出、およびフローサイトメトリーを行った。対照と比較して、CSE治療は、ドロッププレート法における細菌感染を実質的に増加させた(図2)。これに対応して、CSEはHSAECにおける細菌負荷に影響を与えた(図3)。細胞生存率は、3時間4%CSE処置後、シュードモナス感染の1時間、または1時間のゲンタマイシン治療で大きく変化しなかった(図4図6)。 Figure 5</stron...

ここで説明する、タバコの煙抽出物が肺上皮細胞における細菌のコロニー形成にどのように影響するかを研究するプロトコルである。

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes ...

このプロトコルは、タバコの煙が肺上皮細胞のシュードモナス菌負荷に影響を与えるかどうかを判断するために3つのアプローチを使用します。この方法は、内皮細胞または他の細胞タップに拡張することができる。タバコの煙抽出の調製、細菌感染および細菌負荷による決定は、このビデオで詳細に説明されている。この手順は、新しいユーザーにとって非常に簡単に実行できます。10ミリリットルの無血清細胞培養培地を60ミリリットルのシリンジに引き込む。トリムの狭い端をシリンジのノズルに1ミリリットルのピペットチップに取り付け、タバコを保持するアダプターとして取り付けます。タバコからフィルターを取り外し、タバコをアダプターに取り付けます。アッセイを行う前に30分以上タバコを燃焼し、シリンジに空気を含む煙の40ミリリットルを引き込みます。煙と煙を激しく振って媒体と混ぜます。タバコが完全に燃え尽きるまで描画プロセスを繰り返し、約7分で約11回の引き出しが必要になります。培地から微生物や不溶性粒子を除去するには、0.22ミクロンのフィルターを通して濾過します。次いで、閉じた滅菌チューブに培地を移す。選択したシュードモナス株でトリプティック大豆ブロスまたはTSBオーガープレートを接種する。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。炭素源として5%グリセロールを有するTSBの20ミリリットルを含むチューブを調製する。オーガープレートから汚れを収集し、TSBを接種します。シュードモナス懸濁液を200RPMで37度の摂氏シェーカーでインキュベートし、約1時間、600ナノメートルでの光学密度が0.6になるまで。原稿に記載されているように肺上皮細胞を培養した後、0.25%トリプシンの1ミリリットルを細胞に加える。約5分後、細胞がプレートの底から完全に剥離したら、トリプシンを中和するために完全なハイツ培地の10ミリリットルを加えます。細胞を15ミリリットルのチューブに移します。その後、セルを摂氏4度で5分間、G.300回遠心分離し、上清を取り除いて捨てます。その後、セルを10%FBSでハイツ培地のミリリットルに再懸濁します。上皮細胞懸濁液のピペット10マイクロリットルを新しいプレートに上に。細胞濃度を求めるには、自動セルカウンターを使用します。肺上皮細胞を1ミリリットル当たり5番目の細胞の3倍の濃度で、井戸当たり2ミリリットルの培地の総量でプレートします。プレートを一晩インキュベートします。セルが約 80% のコンフルエンスに達したら、高さの媒体に 1%FBS を加えた媒体を取り替えます。その後、ウェルに4%CSEを加え、プレートを3時間インキュベートします。CSE処理肺上皮細胞の各ウェルにシュードモナスを加える。その後、5%の二酸化炭素で摂氏37度で1時間プレートをインキュベートします。次に、6つのウェルプレートの培地を、4%CSEと1ミリリットルのゲンタマイシンを含む新鮮なハイツ培地の2ミリリットルに交換します。5%の二酸化炭素で摂氏37度で1時間プレートをインキュベートした後、ウェルから培地を吸引する。ゲンタマイシン処理細胞を2ミリリットルの冷たいPBSで2回洗浄する。肺上皮細胞に負荷が入った細菌は、ドロッププレート法、qRT-PCR法、またはフローサイトメトリーによって検出することができる。肺上皮細胞の各ウェルに細胞ライシスバッファーの1ミリリットルを追加します。.1から10から10、000までの範囲の細胞溶菌の連続希釈を修復する。次にTSBオーガープレートを接種します。16時間のインキュベーションの後、細菌コロニーの数を数えることによって、肺上皮細胞に存在したコロニー形成ユニットの数を決定する。肺上皮細胞の各ウェルにグアニジニウム・チオシアネート・ライシス緩衝液を0.35ミリリットル加える。セルスクレーパーでセルを収集します。ライセートをマイクロ遠心分離チューブにピペットし、ピペットとやさしく混ぜます。0.35ミリリットルの新鮮な準備をして、70%エタノールをlysateに加え、よく混ぜます。すべてのサンプルを2ミリリットルの回収チューブに入れたスピンカラムに移します。コレクションチューブを10,000倍G、摂氏20~25度で30秒間遠心分離します。回収管のバッファーを廃棄し、0.7 ミリリットルの洗浄バッファーでカラムを洗浄します。列を10,000倍のGで30秒間遠心分離します。0.5ミリリットルのバッファーでカラムを2回洗います。10,000回Gで遠心分離を2分間繰り返します。カラムを新しい1.5ミリリットルの回収チューブに入れ、30~50マイクロリットルのRNaseフリー水を加えます。チューブを10,000倍Gで1分間遠心した後、流れを集め、RNA濃度を測定します。20マイクロリットル逆転写反応の準備のために、反応バッファーの10マイクロリットル、逆転写酵素およびRNaseフリー水の1マイクロリットルを有する総RNAの1マイクログラムを作る。メーカーのプロトコルに従って、37°Cで1時間、摂氏95度で5分間逆転写反応を行います。次に、各cDNAサンプルの1マイクロリットルを、サイバー色素を含むマスターミックスの5マイクロリットルと、各200ナノモル特異的プライマーの1マイクロリットルと混合します。20マイクロリットルの総容量のための水を加えます。メーカーの推奨に従って PCR 分析を実行します。次に、比較CT法を用いて式を決定します。BEAS-2B細胞では、細胞を3時間4%CSEで処理しても生存率は大きく変化しなかった。シュードモナス感染として1時間も生存率に実質的に影響を及ぼさなかった。最後に、培養培地中のシュードモナを殺すためにゲンタマイシンを使用しても、細胞の生存率に統計的に有意な影響を及ぼさなかった。ドロッププレート法により測定したとおり、BEAS-2B細胞における細菌感染はCSEによる処理により実質的に増加した。同じことがHSAECのCSE治療にも当てはまり、CSE処理BEAS-2B細胞の細菌感染も、16S rRNAの存在量を定量化するためにRT-PCRを用いて評価し、シュードモナス・フルギノーサの増加を示した。CSEで処理され、シュードモナスフルオレセンスミグラに感染したBEAS-2B細胞を、509ナノメートルのフローサイトメトリーで分析した。結果はまた、CSE治療が細菌感染を増加させることも示した。蛍光顕微鏡の結果、シュードモナスフルオレセンスミグラ感染実験において、GFP標識細菌がBEAS-2B細胞と共局化することが示された。細胞は、人間の行動を模倣し、肺上皮細胞に対するタバコの煙の影響を直接研究することを可能にするロボット喫煙でタバコの煙にさらされる可能性があります。この技術は、肺感染症の文脈で他の細胞タップでタバコの煙を探索するために使用することができます。記載されたアプローチは、タバコの喫煙後回り肺損傷およびC0PD余分に対する効果的な治療法の発達の基礎となる

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

肺上皮細胞は、マウスの気道から分離し、差別化された呼吸上皮のモデルとしての気液界面で培養することができます。プロトコルは、分離培養し、この環境毒素への分子応答を研究するために、たばこの主流煙にこれらの細胞を露出させるための記述されています。...

エアー液界面におけるマウスの呼吸器上皮細胞と実験たばこの煙への暴露の分離

Source: Li, T., et al. Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates how cigarette smoke extract weakens antimicrobial defense in lung epithelial cells by reducing AMP production, leading to increased bacterial invasion. The procedure measures intracellular bacterial load to assess the impact of smoke exposure on host-pathogen interactions.

Analyzing the Effects of Cigarette Smoke on Antimicrobial Defense in Lung Epithelial Cells

我々は、マウスモデルにおいて、長期持続性の慢性緑膿菌気道感染を確立する寒天ビーズ法を記載している。...

長期的な慢性<em&gt;緑膿菌</emマウスにおける&gt;気道感染

このプロトコルの目標は、COPDのマウスモデルにおける慢性肺の病状を定量化する自動化された方法を提供することです。このプロトコルには、マウスをタバコの煙(CS)にさらすこと、肺機能の測定、肺を膨らませること、および形態測定法を使用してマウスの肺気腫と小さな気道リモデリングを測定することが含まれます。...

肺気腫とタバコ煙曝露マウスにおける末梢気道リモデリングの自動測定

このプロトコルの目的は、人間の器官型の3D気管支および鼻組織モデルを、気液界面で主流のタバコの煙（CS）にさらすことです。次に、組織に対するCSの影響を、シトクロムP450活性アッセイ、繊毛拍動測定、およびシステム生物学的アプローチを使用して調査します。...

全体タバコ煙への器官型3D気管支及び鼻腔組織培養モデルの反復暴露の影響評価

最適化されたヒト末梢血単核細胞(PBMC)ex...

可燃たばこ製品製剤の細胞毒性および免疫抑制を評価するための方法

宿主と病原体の相互作用に関するin vitro研究は特定の免疫応答の特性評価を可能にしますが、複雑な反応の影響を観察するにはin...

微生物群集を学びます<em&gt;インビボ</em&gt;：ホスト間の媒介の相互作用のモデル<em&gt;カンジダ</em&gt;と<em&gt;緑膿菌</em&gt;航空で

ここに提示される肺固定のための有用なプロトコルは、肺気腫のマウスモデルからの肺標本の組織学的評価のための安定した状態を作成する。このモデルの主な利点は肺の崩壊またはデフレなしで同じ一定した圧力の多くの肺を固定できることである。...

マウスにおける気腫の評価に対する一定圧力下での肺固定

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全身吸入システムを用いたマウスのタバコの煙暴露

ここでは、長期バイオバンキングのための初代気管支上皮細胞の単離と増殖、および気液界面での培養による分化上皮細胞の生成のための、再現性があり、手頃な価格で堅牢な方法を紹介します。...

バイオバンキングのための切除肺組織からの気管支上皮細胞の単離と高分化気液界面培養の樹立

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肺上皮細胞におけるシュードモナス感染に及ぼすタバコの煙の影響の研究

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