Name: 免疫細胞の下流分析のための中枢神経系組織および関連する髄膜の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-19T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 学ぶ、マウスの脳・脊髄・髄膜から免疫細胞を迅速に単離する手法。単一細胞解析と組織学的解析により、恒常状態と病態における免疫細胞の表現型、機能、局在を包括的に解析できます。

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著者らは、ダートマスの比較医学研究センター(CCMR)のスタッフに、これらの研究に使用されたマウスの専門家によるケアに感謝しています。ボルンシュタイン研究基金はこの研究に資金を提供しました。

著者は開示するものは何もありません。

ホメオスタシスおよび疾患中のCNSコンパートメント内の細胞組成を評価する方法は、CNSの生理学的および病理学的状態を理解するために不可欠である。しかし、CNSの重要なバリアとして機能し、多様な免疫細胞を収容しているにもかかわらず、脳および脊髄の多くの従来の組織抽出方法ではこれらの膜の収集が不可能であるため、髄膜は分析から除外されることがよくあります。この省略は、髄膜の細胞組成と機能、および定常状態と炎症状態におけるその役割についての理解を深める上での重大な制限です。最近の研究により、髄膜コンパートメントに存在する常在免疫細胞と末梢由来免疫細胞の両方が、中枢神経系の恒常性を維持し、中枢神経系疾患の病態を駆動する上で重要な役割を果たしていることが明らかになりました。これらの研究は、実質コンパートメントだけでなく、周囲の髄膜層も分析する必要性を強調しています。ここに記載されているプロトコルは、髄膜を維持しながら脳と脊髄を迅速に分離することを可能にし、最終的には組織学的研究と単一細胞研究の両方を利用してCNSコンパートメントの包括的な下流分析を可能にします。代表的な結果は、CNSコンパートメント内の免疫細胞の評価に焦点を当てています。しかしなが...

中枢神経系(CNS)は免疫学的に特殊な部位です。CSF腔、髄膜、および血管系を除くCNS実質は、古典的に免疫特権部位1,2,3,4,5と見なされており、恒常性状態の間は免疫細胞が比較的ありません2,6,7。対照的に、硬膜、くも膜、および軟膜層で構成される髄膜は、CNSコンパートメントの重要な構成要素であり、疾患の病因中の恒常性免疫監視および炎症プロセスに積極的に関与しています3,6,7,8。定常状態の間、髄膜は、自然リンパ系細胞(ILC)、マクロファージ、樹状細胞(DC)、肥満細胞、T細胞、および程度は低いがB細胞を含む多数の免疫センチネル細胞をサポートする9,10,11。
髄膜は高度に血管新生した構造であり、CNSとその末梢との間にリンパ管接続を提供するリンパ管を含む8,12,13,14。CNS損傷、感染症、自己免疫、さらには神経変性によって誘発される炎症状態では、末梢由来の免疫細胞が実質に浸潤し、髄膜内の免疫ランドスケープを変化させます。細胞浸潤に続いて、髄膜は末梢由来の免疫細胞の機能的ニッチを表し、免疫細胞の凝集、局所免疫細胞の活性化、およびCNSコンパートメントでの長期生存を促進します。顕著な髄膜炎症は、多発性硬化症(MS)15、16、17、18、19、脳卒中20、21、無菌損傷22、23(すなわち、脊髄損傷および外傷性脳損傷)、片頭痛24、および微生物感染25、26を含む、CNSに影響を及ぼす複数の疾患において観察され、27、28、29。したがって、髄膜コンパートメント内の常在細胞および末梢由来免疫細胞の特性評価は、定常状態および疾患の病因におけるこれらの細胞の役割を理解するために不可欠です。
頭蓋体と椎体からの脳、脊髄、髄膜の抽出は、技術的に困難で時間がかかります。現在、3つの髄膜層すべてを無傷のままにして脳を迅速に抽出するために利用できる技術はありません。椎弓切除術は優れた脊髄組織の形態をもたらし、髄膜層を保存しますが、それは非常に時間がかかり、複雑です30,31。逆に、頭蓋骨からの脳の除去および脊髄の水圧押し出しなどのより従来の抽出方法は、CNS組織の迅速な抽出を容易にするが、くも膜および硬膜髄膜の両方がこれらの技術で失われる30,31。脳および脊髄組織の従来の単離中に硬膜およびくも膜層が省略されると、CNSコンパートメント内の細胞の不完全な分析がもたらされる。したがって、無傷の髄膜を有するCNS組織の迅速な抽出に焦点を当てた新しい技術の同定は、CNSコンパートメントの最適な分析にとって重要です。
この原稿は、マウスから脳、脊髄、髄膜を迅速に抽出するための2つの方法を提示し、CNS実質および髄膜の常在細胞および末梢由来免疫細胞の下流分析を容易にします。これらの最適化されたプロトコルは、1)ダウンストリーム分析用の単一細胞懸濁液の単離、および2)組織学的処理のための組織の準備に焦点を当てています。脳、脊髄組織、硬膜およびくも膜髄膜32から単一細胞懸濁液を得ることは、実質および髄膜コンパートメントの両方に存在する細胞の同時分析を可能にする。シングルセル懸濁液は、in vitro刺激33、酵素結合イムノスポット(ELISpot)28、34、35、フローサイトメトリー36、33、シングルセル37またはバルクトランスクリプトミクスを実行するための細胞培養アッセイなど、さまざまなアプリケーションで使用できます。さらに、無傷の頭蓋骨または脊柱を備えた脳全体と脊髄の脱灰に最適化されたプロトコルにより、周囲の骨を穏やかに脱灰し、髄膜を無傷のままにし、組織の形態を維持することができます。この方法では、実質空間と髄膜腔の両方で免疫組織化学(IHC)またはin situハイブリダイゼーション(ISH)技術を使用してタンパク質またはRNAを選択的に同定できます。CNS内の常在細胞および末梢由来免疫細胞の表現型、活性化状態、および局在の特性評価は、CNSコンパートメント内の個々の細胞タイプが恒常性と疾患の病因にどのように寄与するかを理解するために不可欠な情報を提供する可能性があります。

<table><tbody><tr><td>アルミホイル</td><td>任意の</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ウシ 血清 アルブミン</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>37002D</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>アレグラ X-12R 遠心分離機</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ I</td><td>ワーシントン</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>コニカルチューブ、15mL</td><td>VWR</td><td>525-1069</td><td></td></tr><tr><td>コニカルチューブ、50mL</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>ハウザーサイエンティフィック</td><td>5000</td><td></td></tr>クライ<tr><td>オモールド</td><td>VWR18000-128</td><td></td><td></td></tr><tr><td>湾曲した鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11003-14</td><td></td></tr>使い捨て<tr><td>ポリスチレンチューブ、14mL</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>14-959-1B</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てメス</td><td>フィッシャーサイエンティフィックNC0595256</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>ドライアイス</td><td>エアガス</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ダーモント #7Forceps</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 二ナトリウム塩二水和物</td><td>アムレスコ</td><td>0105-500g</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、100%</td><td>any</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>フィルタートップチューブ、5 mL</td><td>VWR</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>固定可能な生存率染色 780</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>565388</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>ガリオス</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>フィッシャー・ケミカル</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG (488 コンジュゲート)</td> <td>ジャクソン免疫研究</td><td>115-546-146</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG (594共役)</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>115-586-146</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ 488</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>111-545-144</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ラット 594</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>112-585-167</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ラット 650</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>112-605-167</td><td></td></tr><tr><td>ハンクのバルンス塩溶液 (HBSS)</td><td>コーニング</td><td>21-020-CV</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Andwin Scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13004-14</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher chemical</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 (無水)</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P5655-100G</td><td></td></tr><tr><td>液体窒素</td><td>エアガス</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>マウス FC ブロック (CD16/32)</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Na2HP04 (無水)</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>S671-500</td><td></td></tr><tr><td>ニードル、25 ゲージ</td><td>ベクトンDickinson</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>正常なマウス血清</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31881</td><td></td></tr><tr><td>ナイロンメッシュストレーナー</td><td>VWR</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、20%</td><td>電子顕微鏡 Sciences</td><td>15713-S</td> 1 x PBS パスツールピペットを使用して <td>4% に希釈、</td></tr><tr><td>9 インチ、プラグを抜いた</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>PE Rat Anti-Mouse CD4</td><td>Becton Dickinson</td><td>553730</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19</td><td>Becton Dickinson</td><td>562329</td><td></td></tr><tr><td>Percoll density gradient media</td><td>GE healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45</td><td>Becton Dickinson</td><td>550994</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿、100 mm</td><td>VWR</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-636-AB150</td><td></td></tr><tr><td>ピペットエイド</td><td>ドラモンドサイエンティフィックコーポレーション</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>ピペット 200 & マイクロ;l</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ、1 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1111-2831</td><td></td></tr>ピ<tr><td>ペットチップ、200 & マイクロ;l</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1816</td><td></td></tr><tr><td>ピペット、1 mL</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Diamond mountant with DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>精製ラット抗マウス CD16/CD32</td><td>Becton Dickinson</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗マウス CD3 (SP7 クローン)</td><td>Abcam</td><td>ab16669</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗マウスラミニン</td><td>Abcam</td><td>ab11575</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウス ERT-R7</td><td>Abcam</td><td>ab51824</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Corning</td><td></td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Serological ピペット、1 mL</td><td>VWR</td><td>357521</td><td></td></tr><tr><td>Serological ピペット、10 mL</td><td>VWR</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Serological ピペット、5 mL</td><td>VWR</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>水酸化</td><td>ナトリウムフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S318-100</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>外科用ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14001-16</td><td></td></tr><tr><td>外科用ハサミ、極細</td><td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ、10 mL</td>ベ<td>クトンディキンソン</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ、5 mL</td>ベ<td>クトンディキンソン</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>真空フィルターシステム</td><td>ミリポア</td><td>20207749</td><td></td></tr><tr><td>真空フラスコ</td><td>トーマス・サイエンティフィック</td><td>5340-2L</td><td></td></tr><tr><td>真空インラインフィルター</td><td>ポールコーポレーション</td><td>4402</td><td></td></tr><tr><td>バキュームライン</td><td>コール・パーマー</td><td>EW-06414-20</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td>・<td>ヴァーサ風呂</td><td></td></tr></tbody></table>

免疫細胞の下流分析のための中枢神経系組織および関連する髄膜の単離

Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells

中枢神経系(CNS)は脳と脊髄で構成され、末梢と中枢神経系の間の障壁として機能する膜層である髄膜に包まれています。CNSは免疫学的に特殊な部位であり、定常状態では、免疫特権はCNS実質で最も明白です。対照的に、髄膜には、自然免疫細胞や適応免疫細胞など、多様な常在細胞があります。CNS損傷、自己免疫、感染、さらには神経変性によって引き起こされる炎症状態の間、末梢由来の免疫細胞が実質に入り、髄膜内に居住する可能性があります。これらの細胞は、CNS疾患の病因の間に有益な作用と有害な作用の両方を行うと考えられています。この知識にもかかわらず、従来のCNS組織抽出方法では髄膜層が省略されているため、CNSコンパートメントを分析するときに髄膜が見落とされがちです。このプロトコルは、単一細胞技術、免疫組織化学、およびin situハイブリダイゼーション法によるダウンストリーム分析に適した、マウスCNS組織(すなわち、脳、脊髄、および髄膜)を迅速に分離するための2つの異なる方法を提示します。記載された方法は、CNS組織の包括的な分析を提供し、恒常性条件下でおよび疾患の病因の間にCNS区画を占める細胞の表現型、機能、および局在を評価するのに理想的である。

この代表的な実験は、B細胞とT細胞を定量化し、恒常性状態における髄膜および実質CNSコンパートメントおよびマウス進行性MSモデル(すなわち、TMEV-IDD)におけるB細胞およびT細胞の局在を記述することを目的としていました。TMEV-IDDは、前述のようにTMEV BeAnの5 x 106 プラーク形成ユニット(PFU)による頭蓋内感染によって5週齢の雌SJLマウスで誘導されました29。
本研究では、感染後120日目の慢性TMEV-IDD中の髄膜、脳、および脊髄のB細胞とT細胞を評価しました。年齢を一致させた偽処理マウスを対照として用いた。この研究は2つの実験で構成されていました。1つ目は、細胞表面および/または細胞内抗原(n = 4偽処理、n = 5 TMEV-IDD)を評価することによって細胞組成を分析および定量するための確立された技術であるフローサイトメトリー評価用の単一細胞懸濁液の取得に焦点を当てました。2番目の実験は、脱灰された脳および脊髄組織(n = 3偽治療、n = 8 TMEV-IDD)の免疫組...

この論文では、脳、脊髄、髄膜など、中枢神経系内の常在免疫細胞および末梢由来の免疫細胞を調べるための2つの最適化されたプロトコルを紹介します。これらの各プロトコルは、定常状態および炎症状態下でこれらのコンパートメントを占める細胞の機能と組成を確認するのに役立ちます。

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier ...

髄膜を含むCNS組織を迅速に単離することで、恒常性および病原性条件における免疫細胞の表現型、機能、および局在を包括的に分析できます。実証された2つの方法により、髄膜を用いたCNS組織の迅速な抽出が可能となり、シングルセル技術や組織学的方法を用いた下流分析に最適です。代表的な結果は免疫細胞の解析に焦点を当てていますが、この2つの方法は、ミクログリア、アストロサイト、周皮細胞、内皮細胞、間質細胞、ニューロンなどのCNS常在細胞の解析にも使用できます。まず、安楽死させたマウスから脳と脊髄のサンプルを分離します。頭を取り除いた後、皮膚に正中線を切開し、目の上にひっくり返して頭蓋骨を解放します。鼻骨を切って下顎骨を頭蓋骨から解放します。次に、下顎骨、舌、目を切除します。頭蓋骨の外側に沿って切断し、外耳道に沿って組織を解放し、トリミングします。脊髄サンプルを採取するには、鋭利なハサミで脊椎と平行に切断することにより、胸郭を脊柱から分離します。腰椎下部に小さな切り込みを入れて脊柱を分離し、脊椎に沿って残っている筋肉をトリミングして取り除き、椎骨を露出させます。脱灰を行うときは、骨が柔らかくしなやかであるかどうかを判断するために、毎日骨をチェックしてください。鉗子でEDTA溶液から組織を取り出し、ペトリ皿の上に置き、25ゲージの針で骨の柔らかさを優しくテストします。針が骨に容易に浸透すれば、脱灰プロセスは完了です。脳内の頭蓋骨を抽出するには、皮膚に正中線を切開し、皮膚を目の上で裏返します。ハサミを大孔の中に入れ、頭蓋骨を皮質に沿って嗅球に向かって横方向に切り始め、切開部を外耳道と下顎骨の上に保ちます。反対側で同じカットを行い、嗅球で合流するカットを使用して、頭蓋骨キャップを脳から解放します。鉗子を使用して、頭蓋骨キャップをはがし、25ミリモルのHEPESを補充した5ミリリットルの冷たいRPMI培地を含む15ミリリットルの円錐形チューブに入れます。湾曲した鉗子を脳の基部の下に置き、持ち上げて脳を頭蓋骨キャップから解放します。脊椎と平行に切断して脊柱と脊髄組織を摘出し、胸郭を脊柱から分離します。次に、腰椎下部に小さな切り込みを入れて、椎骨柱を分離します。脊椎に沿って残っている筋肉をすべてトリミングして取り除き、椎骨を露出させます。次に、極細の手術用ハサミを脊柱内に置き、柱の横方向の端に沿って切ります。反対側の側端を完全にカットして、脊柱を前部と後部に分割します。鉗子を使用して脊柱から脊髄をゆっくりと慎重に剥がし、25ミリモルのHEPESを含む5ミリリットルの冷たいRPMIを含む15ミリリットルの円錐管に入れます。次に、脊柱の前部と後部を別のチューブに移します。頭蓋骨キャップから髄膜を取り除くには、頭蓋骨キャップをRPMIメディアから取り出し、鋭い鉗子を使用して外縁の周りにスコアを付けます。頭蓋骨キャップの端から髄膜を剥がし、こすり落として硬膜とくも膜の髄膜を取り除き、髄膜をペトリ皿に置きます。脊柱から髄膜を取り除くには、メディアから柱を取り出し、鋭い鉗子で脊柱の端にスコアを付けて髄膜を解放します。湾曲した鉗子を使用して椎骨の端から髄膜を剥がし、髄膜をペトリ皿に置きます。ナイロンメッシュストレーナーを50ミリリットルの円錐形チューブに入れます。細胞懸濁液を作成するには、髄膜をストレーナーに移し、3ミリリットルのHEPESサプリメントRPMIを追加し、5ミリリットルのシリンジからプランジャーを使用して、ストレーナーを介して組織と培地を粉砕します。メディアと一緒に脳または脊髄組織を100ミリメートルのシャーレに注ぎ、鉗子を使用して組織を底に移動します。滅菌済みのカミソリの刃で脳組織をミンチにし、プレートの底に組織を集めます。10%FCSを添加した3ミリリットルのRPMIをペトリ皿に加え、10ミリリットルの血清ピペットを使用して組織を培地に再懸濁し、15ミリリットルのコニカルチューブに移します。コラゲナーゼ1型とDNase 1を組織に加え、チューブを摂氏37度の水浴で40分間インキュベートします。15分ごとにチューブを反転させ、組織と酵素を完全に混合します。インキュベーション後、最終濃度0.01モルになるように各チューブにEDTAを添加し、さらに5分間チューブをインキュベートしてコラゲナーゼを不活性化します。10%FCSを添加したRPMIを9ミリリットル各チューブに加え、チューブを450Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。真空状態のパスツールピペットを使用して上清を吸引し、細胞ペレットに触れないように注意してください。100%ストックの等張密度勾配溶液を3ミリリットル細胞ペレットに加え、さらにRPMI 10%FCS培地を添加して最終容量を10ミリリットルにし、細胞ペレットを再懸濁します。チューブを反転させてよく混合し、70%ストックの等張密度勾配溶液1ミリリットルを入れた血清ピペットをチューブの底に挿入します。泡を作らないように注意しながら、溶液をゆっくりと下敷きます。セロジカルピペットをチューブから取り外し、グラジエントを妨げないように注意してください。チューブを800Gで摂氏4度で30分間遠心分離し、ミエリン破片層を含む上清をチューブ内に2〜3ミリリットルが残るまで吸引します。1ミリリットルのピペットを使用して、30%から70%の密度勾配の間の細胞層を採取し、新しい15ミリリットルのチューブに移します。RPMI 10%FCS培地を添加して最終容量を15ミリリットルにし、細胞を450 Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。このプロトコルは、進行性多発性硬化症の際に髄膜、脳、および脊髄のB細胞およびT細胞を評価するために使用されました。ゲーティングは、CD45の高末梢由来浸潤免疫細胞をCD45の低ミクログリアおよびCD45陰性のニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトと区別するために行われました。偽治療マウスの脊髄および脳組織には、CD45高細胞はほとんど存在しなかった。CD45の高発現について同じゲーティングカットオフを髄膜で使用して、CD45の高免疫細胞を同定し、非免疫細胞を除外しました。すべてのTMEV-IDD CNS組織において、偽治療マウスと比較して、CD45高免疫細胞の割合の増加が観察されました。慢性TMEV-IDDでは、脳と脊髄のCD45高免疫細胞のうちB細胞の割合は、髄膜コンパートメントと比較して高かった。脱灰した脳と脊髄を画像化して、CNSコンパートメント内のB細胞とT細胞の局在を特定しました。従来の頭蓋骨からの脳の抽出では、無傷の軟膜層が得られましたが、残りの髄膜層は除外されました。脱灰した脳と脊髄の両方で、すべての髄膜層は無傷でした。アイソタイプスイッチB細胞およびT細胞は、それぞれIgGおよびCD3発現で局在化した。IgGをER-TR7と共染色したところ、B細胞はCNS実質と髄膜に存在し、ER-TR7陽性髄膜内の細胞凝集体には複数のIgG陽性B細胞とCD3陽性T細胞が含まれていることが明らかになりました。これらのプロトコルの重要なステップは、単一細胞懸濁液の純度を向上させ、高品質の形態を持つ組織学組織を得るために不可欠なCNS組織の慎重な抽出です。記載されている技術により、CNSコンパートメントを占める細胞の包括的な分析が可能になり、恒常性下および疾患病因中の細胞表現型、機能、および局在を調べるのに理想的です。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオでは、実験的自己免疫性脳脊髄炎を持つラットの中枢神経系から単核細胞を単離する方法を示します。...

EAEモデルラットの中枢神経系から単核細胞の単離

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パーコール勾配を用いて脳と脊髄単核細胞の単離

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マウス脳組織からの免疫細胞の単一細胞懸濁液の調製

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5つの脊椎動物群にわたる中枢神経系微小血管の信頼性の高い絶縁

成体マウス脳半球の異なる解剖領域からミクログリアを分離するためのプロトコルを提供し、続いて全長転写物の深い単一細胞RNAシーケンシングのための半自動化ライブラリ製剤を提供する。この方法は、健康と疾患におけるミクログリアの機能的不均一性を解明するのに役立ちます。...

ディープシングルセルRNAシーケンシングのための1つの成人マウス脳半球からの領域特異的ミクログリアの分離

ここでは、マウスCNSからの複数のグリア細胞集団のin...

複数の中枢神経系領域からのマウスグリアの解剖と分離

この研究は、単離された灌流マウスの脳脈絡叢に対するフローサイトメトリーおよび2つの異なるゲーティング戦略を使用する。このプロトコルは、この脳構造に移入する主要な免疫細胞サブセットを識別します。...

微小解剖マウス脈絡叢からの免疫細胞の単離と特性評価

これまでのところ、すべての主要な中枢神経系常在細胞タイプを同じマウスから同時に単離するためのプロトコルは、満たされていない需要です。プロトコルはneuroinflammationの間に複雑な細胞ネットワークを調査し、同時に必須のマウス数を減らすために素朴で、実験的な自己免疫の脳脊髄炎のマウスで適当なプロシージャを示す。...

成体自己免疫性脳脊髄炎マウスからの主要な中枢神経系常在細胞型の同時単離

脳疾患に対する免疫応答を調べるために、免疫細胞の変化を解析するアプローチが一般的です。ここでは、マウスの脳組織と頭蓋骨骨髄から免疫細胞を単離するための2つの簡単で効果的なプロトコルが提供されています。...

マウスの脳と頭蓋骨からの免疫細胞の単離

学ぶ、マウスの脳・脊髄・髄膜から免疫細胞を迅速に単離する手法。単一細胞解析と組織学的解析により、恒常状態と病態における免疫細胞の表現型、機能、局在を包括的に解析できます。

免疫細胞の下流分析のための中枢神経系組織および関連する髄膜の単離

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