免疫細胞の下流分析のための中枢神経系組織および関連する髄膜の単離

髄膜を含むCNS組織を迅速に単離することで、恒常性および病原性条件における免疫細胞の表現型、機能、および局在を包括的に分析できます。実証された2つの方法により、髄膜を用いたCNS組織の迅速な抽出が可能となり、シングルセル技術や組織学的方法を用いた下流分析に最適です。代表的な結果は免疫細胞の解析に焦点を当てていますが、この2つの方法は、ミクログリア、アストロサイト、周皮細胞、内皮細胞、間質細胞、ニューロンなどのCNS常在細胞の解析にも使用できます。

まず、安楽死させたマウスから脳と脊髄のサンプルを分離します。頭を取り除いた後、皮膚に正中線を切開し、目の上にひっくり返して頭蓋骨を解放します。鼻骨を切って下顎骨を頭蓋骨から解放します。

次に、下顎骨、舌、目を切除します。頭蓋骨の外側に沿って切断し、外耳道に沿って組織を解放し、トリミングします。脊髄サンプルを採取するには、鋭利なハサミで脊椎と平行に切断することにより、胸郭を脊柱から分離します。

腰椎下部に小さな切り込みを入れて脊柱を分離し、脊椎に沿って残っている筋肉をトリミングして取り除き、椎骨を露出させます。脱灰を行うときは、骨が柔らかくしなやかであるかどうかを判断するために、毎日骨をチェックしてください。鉗子でEDTA溶液から組織を取り出し、ペトリ皿の上に置き、25ゲージの針で骨の柔らかさを優しくテストします。

針が骨に容易に浸透すれば、脱灰プロセスは完了です。脳内の頭蓋骨を抽出するには、皮膚に正中線を切開し、皮膚を目の上で裏返します。ハサミを大孔の中に入れ、頭蓋骨を皮質に沿って嗅球に向かって横方向に切り始め、切開部を外耳道と下顎骨の上に保ちます。

反対側で同じカットを行い、嗅球で合流するカットを使用して、頭蓋骨キャップを脳から解放します。鉗子を使用して、頭蓋骨キャップをはがし、25ミリモルのHEPESを補充した5ミリリットルの冷たいRPMI培地を含む15ミリリットルの円錐形チューブに入れます。湾曲した鉗子を脳の基部の下に置き、持ち上げて脳を頭蓋骨キャップから解放します。

脊椎と平行に切断して脊柱と脊髄組織を摘出し、胸郭を脊柱から分離します。次に、腰椎下部に小さな切り込みを入れて、椎骨柱を分離します。脊椎に沿って残っている筋肉をすべてトリミングして取り除き、椎骨を露出させます。

次に、極細の手術用ハサミを脊柱内に置き、柱の横方向の端に沿って切ります。反対側の側端を完全にカットして、脊柱を前部と後部に分割します。鉗子を使用して脊柱から脊髄をゆっくりと慎重に剥がし、25ミリモルのHEPESを含む5ミリリットルの冷たいRPMIを含む15ミリリットルの円錐管に入れます。

次に、脊柱の前部と後部を別のチューブに移します。頭蓋骨キャップから髄膜を取り除くには、頭蓋骨キャップをRPMIメディアから取り出し、鋭い鉗子を使用して外縁の周りにスコアを付けます。頭蓋骨キャップの端から髄膜を剥がし、こすり落として硬膜とくも膜の髄膜を取り除き、髄膜をペトリ皿に置きます。

脊柱から髄膜を取り除くには、メディアから柱を取り出し、鋭い鉗子で脊柱の端にスコアを付けて髄膜を解放します。湾曲した鉗子を使用して椎骨の端から髄膜を剥がし、髄膜をペトリ皿に置きます。ナイロンメッシュストレーナーを50ミリリットルの円錐形チューブに入れます。

細胞懸濁液を作成するには、髄膜をストレーナーに移し、3ミリリットルのHEPESサプリメントRPMIを追加し、5ミリリットルのシリンジからプランジャーを使用して、ストレーナーを介して組織と培地を粉砕します。メディアと一緒に脳または脊髄組織を100ミリメートルのシャーレに注ぎ、鉗子を使用して組織を底に移動します。滅菌済みのカミソリの刃で脳組織をミンチにし、プレートの底に組織を集めます。

10%FCSを添加した3ミリリットルのRPMIをペトリ皿に加え、10ミリリットルの血清ピペットを使用して組織を培地に再懸濁し、15ミリリットルのコニカルチューブに移します。コラゲナーゼ1型とDNase 1を組織に加え、チューブを摂氏37度の水浴で40分間インキュベートします。15分ごとにチューブを反転させ、組織と酵素を完全に混合します。

インキュベーション後、最終濃度0.01モルになるように各チューブにEDTAを添加し、さらに5分間チューブをインキュベートしてコラゲナーゼを不活性化します。10%FCSを添加したRPMIを9ミリリットル各チューブに加え、チューブを450Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。真空状態のパスツールピペットを使用して上清を吸引し、細胞ペレットに触れないように注意してください。

100%ストックの等張密度勾配溶液を3ミリリットル細胞ペレットに加え、さらにRPMI 10%FCS培地を添加して最終容量を10ミリリットルにし、細胞ペレットを再懸濁します。チューブを反転させてよく混合し、70%ストックの等張密度勾配溶液1ミリリットルを入れた血清ピペットをチューブの底に挿入します。泡を作らないように注意しながら、溶液をゆっくりと下敷きます。

セロジカルピペットをチューブから取り外し、グラジエントを妨げないように注意してください。チューブを800Gで摂氏4度で30分間遠心分離し、ミエリン破片層を含む上清をチューブ内に2〜3ミリリットルが残るまで吸引します。1ミリリットルのピペットを使用して、30%から70%の密度勾配の間の細胞層を採取し、新しい15ミリリットルのチューブに移します。

RPMI 10%FCS培地を添加して最終容量を15ミリリットルにし、細胞を450 Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。このプロトコルは、進行性多発性硬化症の際に髄膜、脳、および脊髄のB細胞およびT細胞を評価するために使用されました。ゲーティングは、CD45の高末梢由来浸潤免疫細胞をCD45の低ミクログリアおよびCD45陰性のニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトと区別するために行われました。

偽治療マウスの脊髄および脳組織には、CD45高細胞はほとんど存在しなかった。CD45の高発現について同じゲーティングカットオフを髄膜で使用して、CD45の高免疫細胞を同定し、非免疫細胞を除外しました。すべてのTMEV-IDD CNS組織において、偽治療マウスと比較して、CD45高免疫細胞の割合の増加が観察されました。

慢性TMEV-IDDでは、脳と脊髄のCD45高免疫細胞のうちB細胞の割合は、髄膜コンパートメントと比較して高かった。脱灰した脳と脊髄を画像化して、CNSコンパートメント内のB細胞とT細胞の局在を特定しました。従来の頭蓋骨からの脳の抽出では、無傷の軟膜層が得られましたが、残りの髄膜層は除外されました。

脱灰した脳と脊髄の両方で、すべての髄膜層は無傷でした。アイソタイプスイッチB細胞およびT細胞は、それぞれIgGおよびCD3発現で局在化した。IgGをER-TR7と共染色したところ、B細胞はCNS実質と髄膜に存在し、ER-TR7陽性髄膜内の細胞凝集体には複数のIgG陽性B細胞とCD3陽性T細胞が含まれていることが明らかになりました。

これらのプロトコルの重要なステップは、単一細胞懸濁液の純度を向上させ、高品質の形態を持つ組織学組織を得るために不可欠なCNS組織の慎重な抽出です。記載されている技術により、CNSコンパートメントを占める細胞の包括的な分析が可能になり、恒常性下および疾患病因中の細胞表現型、機能、および局在を調べるのに理想的です。