Name: インビボ子宮内電気ポレーションによるフェレット新皮質における神経前駆細胞の標的化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 学ぶインビボ子宮内電気ポレーションによるフェレット新皮質の神経前駆細胞標的化法。脳の発達と進化における遺伝子機能を解明し、ヒト新皮質の拡張メカニズム理解に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

マックスプランク分子細胞生物学遺伝学研究所のサービスと施設に感謝し、フェレットとJ.ペイクルの優れた畜産と軽顕微鏡施設の彼のチームのために生物医学サービス(BMS)のチーム全体が提供された優れたサポートを提供しました。特に、BMSのカトリン・レッペとアンナ・プフェファーが優れた獣医支援をしてくれたことに感謝し、フットナー・グループのレイ・シンがフェレット手術を支援してくれたことに感謝しています。

すべての実験手順は、ランデスディレクション・ザクセンの承認を得てドイツ動物福祉法に同意して実施されました(ライセンスTVV 2/2015およびTVV 21/2017)。
1. 子宮内電気ポレーションの準備
<ol><li>DNA混合物を準備します。このプロトコルでは、pGFPの最終濃度は1μg/μLが使用されます。PBSでDNAを溶解し、可視化を容易にするために0.1%の高速グリーンで補います。準備ができたら、数回上下にピペットまたは指のタッピングによってDNA混合物を混合する。使用するまで室温で保管してください。 注意:コエレクトロポレーションの場合、DNA混合物は、PBSで希釈されたpGFPの0.5 μg/μLと共に、目的の遺伝子をコードするプラスミドの最終濃度1 μg/μLを含む準備が整います。</li>
	<li>必要な工具と器具をすべて使って手術台を準備します。</li>
	<li>マイクロピペットプーラーを使用してガラスの毛細血管を引っ張ります。前述の41のように鉗子を使用して毛細管の遠位部分を切り落とすことによって毛細管先端の直径を調整する。</li>
</ol>2. 手術用フェレットの準備
<ol><li>嘔吐のリスクを減らすために、手術前に少なくとも3時間E33断食で胚を持つ妊娠中のジルを保ちます。</li>
	<li>手術前にオートクレーブですべてのツールを殺菌します。無菌状態で特別に割り当てられた部屋で手術を行い、潜在的な汚染源を排除します。</li>
	<li>4%イソフルランとナルコシスボックスに妊娠中のジルを置きます。</li>
	<li>麻酔をしたとき、フェレットをヒートパッドで操作テーブルの上に置き、鼻に一定の2〜3%のイソフルランの流れを持つナルコシスマスクを取り付けます。適切なレベルの麻酔を確実にするために、以下の反射神経の欠如を確認してください。<ol>
<li>眼球の皮膚に触れることによる、触動神経反射</li>
		<li>2番目 と3rdの間、または3番目 と4番目 の後肢のつま先の間の皮膚をつまんで屈筋反射</li>
		<li>もし、触動反射が存在せず、屈筋反射が明らかに減少している場合は、後肢の足の指を1本つまんで痛みの反射を確認する。 注:必要に応じて心拍数とリズムを監視するために、聴診器を手元に持っていることを確認してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>フェレットを鎮痛薬(0.1mLのメタミゾール、体重50mg/kg)、抗生物質(0.1 mL/kgの体重20mg/kgのアモキシシリン+クラヴラン酸)、グルコース(5%グルコース溶液10mL)で皮下注射します。</li>
	<li>外科的処置中の眼の脱水を防ぐために、目の上に眼軟膏溶液の滴を置く。</li>
	<li>フェレットの腹を剃ります。</li>
	<li>水と石鹸で肌をきれいにし、70%エタノールスクラブで腹を消毒し、ヨウ素で2xを消毒し、乾燥させます。</li>
</ol>3. フェレットの子宮エレクトロポレーションで
<ol><li>手術領域が無菌であることを確認する:滅菌組織に無菌の外科用具を置き、コートおよび手袋を変更する。</li>
	<li>動物に無菌の外科用ドレープを置きます。</li>
	<li>メスを使用して、リネアアルバの腹を〜5cmの長いカットで外科的に開く。</li>
	<li>はさみを使って筋肉の層を切ります。</li>
	<li>切開部位の周りにガーゼスワブを置き、PBSでそれらを濡らします。ガーゼ綿棒は、手術中に追加される追加のPBSを吸収します。 注:手術中は熱とPBSのサポートを維持してください。</li>
	<li>フェレット子宮を露出させ、ガーゼ綿棒の上に置きます。</li>
	<li>長い負荷チップを持つピペットを使用して、注入溶液でガラスキャピラリーをロードします。胚の数と実験条件の数に応じて、負荷量がおよそ5〜20 μLであることを確認してください。胚あたりの平均注入容積は3~5μLで、装填されたガラスキャピラリーをホルダーに取り付け、ホルダーの反対側をチューブとマウスピースに接続します。</li>
	<li>最初の胚を検査し、頭を見つける。</li>
	<li>視覚化を容易にするために、光ファイバー光源を胚の頭部の隣に置きます。 注:フェレットの子宮壁は非常に暗く、光が直接光を当てない限り、それらを通して見ることは困難です。</li>
	<li>脳半球の1つの心室への単一の心室内注射を行い、他の半球をそのまま維持して内部制御として機能する。心室自体は目で区別されにくいので、その位置は、目に見える色素虹彩の位置に基づいて推定されます。心室内注射は、ガラスキャピラリーに付着したホルダーを取り、ガラス毛細血管の先端で皮膚、頭蓋骨、脳組織を貫通することによって行われます。 注:マウスプラセンタよりも暗い胎盤を損傷しないようにしてください。<ol>
<li>ガラスキャピラリーの先端が心室にある場合は、ガラスキャピラリーホルダーに接続されたマウスピースを使用して口ピペットで約3〜5μLの注入液を注入します。注入された溶液は0.1%の速い緑を含んでいるので、注入された心室は今暗緑色に変わり、腎臓形の構造として見える。</li>
	</ol>
</li>
	<li>正極が標的となる領域の上に配置され、負極が注入された領域の下に置かるように、子宮の頭の上にツイーザー電極を置きます。</li>
	<li>エレクトロポレーターに次のエレクトロポレーション条件を設定します: パルス長 = 50 ミリ秒;パルス電圧= 100 V;パルス間隔 = 1 秒パルスの数 = 5。次に、エレクトロポレーターの「パルス」ボタンを押します。</li>
	<li>すぐに電気ポレート胚に暖かい1x PBSの数滴をドロップします。</li>
	<li>すべての胚に対して手順を繰り返します。子宮は常に暖かいPBSで濡れ続けます。 注:膣に面した最初の胚に簡単にアクセスできない場合は、それらを電気ポレートしないことをお勧めします。</li>
	<li>すべての胚が電気ポポレートされたら、子宮を腹腔に戻します。</li>
	<li>4-0縫合を用いて腹膜で筋肉層を縫合する。</li>
	<li>同じ厚さを使用して皮膚を縫合し、傷口をアルミニウムスプレーでスプレーします。</li>
	<li>ケージに動物を置き、熱源で暖かく保ちます。目が覚まるまで動物を注意深く監視してください。</li>
</ol>4. 対象動物の術後ケアと住宅
<ol><li>手術後3日間、動物が術後ケアを受けていることを確認します: 20 mg/kg アモキシシリン (抗生物質) 毎日 1x;25 mg/kg メタミゾール (鎮痛) 3x 毎日.</li>
	<li>フェレットが個別に収納されていることを確認します。</li>
	<li>フェレットは獣医によって1日に少なくとも1倍検査されることを確認してください。</li>
	<li>フェレットが配達中にできるだけ邪魔されていないことを確認してください。</li>
	<li>子犬が泣いたり犠牲になったりした後、子宮摘出のためにジルを準備する。</li>
</ol>5. フェレットの子宮摘出術
注意:除菌動物をペットとして養子に寄付できるように、殺された動物の数を減らすために子宮摘出術を行います。子宮摘出術の術前の手順は、ステップ2と同じです。
<ol><li>手順 3.1 および 3.2 で説明したようにフェレット腹を剃り、滅菌します。</li>
	<li>外科的にリネアアルバで腹を開きます.筋肉層をカットします。筋肉層を持ち上げ、完全に筋肉層を開きながら指で腸を保護します。</li>
	<li>切開部位の周りにガーゼスワブを置き、滅菌PBSでそれらを濡らします。フェレット子宮と卵巣を露出させ、ガーゼ綿棒の上に置きます。</li>
	<li>動脈卵巣と頭蓋頭蓋を中隔に合体させることにより、片側で子宮摘出術を開始する。ライゲーションの両側にクランプを入れ、クランプに対して別のライゲーション頭蓋を行います。ライゲーションの端に3つ目のクランプを取り付けて保存します。反対側で繰り返します。</li>
	<li>クランプの間を切り、両側の腸間膜からコルヌア子宮を取り外します。</li>
	<li>両子宮側の動脈子宮をオスティウム子宮にリゲートする。その後、膣をリゲートし、合字を修正します。それらを保存するために結紮の端にクランプを取り付けます。合字に2つのクランプ頭蓋を入れます。クランプの間を切り、膣から子宮を切り離す。子宮と卵巣を取り除き、処分する。子宮の尻から残った粘膜を削る。</li>
	<li>残りのクランプをすべて取り外し、合字の端を短くします。クランプが取り外された後、出血を制御するようにしてください。</li>
	<li>ステップ3.16および3.17に記載されているように筋肉層および皮膚を縫合する。手順 3.18 および 4.1- 4.3 の手順に従って、術後プロトコルに従ってください。動物の動物を動物施設に少なくとも2週間保管し、定期的な獣医を訪問してください。動物が完全に回復した後、彼らは養子縁組のために寄付することができます。</li>
</ol>

<ol><li>Kalebic, N., Long, K., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKalebic%2C+N+%22Evolution+of+Nervous+Systems+2e%22">Evolution of Nervous Systems 2e</a>. Kaas, J. 3, Elsevier. 73-89 (2017).</li>
<li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+neocortex%3A+a+perspective+from+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology.</a> Nature Reviews Neurosciences. 10 (10), 724-735 (2009).</li>
<li>Dehay, C., Kennedy, H., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+outer+subventricular+zone+and+primate-specific+cortical+complexification%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The outer subventricular zone and primate-specific cortical complexification.</a> Neuron. 85 (4), 683-694 (2015).</li>
<li>Fernandez, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+cortex+expansion+and+folding%3A+what+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned.</a> EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).</li>
<li>Molnar, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+development+of+the+human+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">New insights into the development of the human cerebral cortex.</a> Journal of Anatomy. 235 (3), 432-451 (2019).</li>
<li>Janson, C. G., McPhee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral-based+gene+transfer+to+the+mammalian+CNS+for+functional+genomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies.</a> Trends in Neurosciences. 24 (12), 706-712 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+embryonic+mouse+central+nervous+system+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation.</a> Development Growth & Differentiation. 50 (6), 507-511 (2008).</li>
<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e239(2007).</li>
<li>Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+gene+knock-down+in+post-mitotic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons.</a> PLoS One. 9 (8), 105584(2014).</li>
<li>Shinmyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+gene+knockout+in+the+mouse+brain+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the mouse brain using in utero electroporation.</a> Science Reports. 6, 20611(2016).</li>
<li>Kalebic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-induced+disruption+of+gene+expression+in+mouse+embryonic+brain+and+single+neural+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo.</a> EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).</li>
<li>Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput%2C+High-Resolution+Mapping+of+Protein+Localization+in+Mammalian+Brain+by+In+Vivo+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing.</a> Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).</li>
<li>Albert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenome+profiling+and+editing+of+neocortical+progenitor+cells+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development.</a> EMBO Journal. 36 (17), 2642-2658 (2017).</li>
<li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).</li>
<li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E16+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), e236(2007).</li>
<li>Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+genetic+manipulation+of+gyrencephalic+carnivores+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation.</a> Molecular Brain. 5, 24(2012).</li>
<li>Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genetic+manipulation+of+cortical+progenitors+in+gyrencephalic+carnivores+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation.</a> Biology Open. 2 (1), 95-100 (2013).</li>
<li>Kalebic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+expansion+due+to+increased+proliferation+of+basal+progenitors+is+linked+to+changes+in+their+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology.</a> Cell Stem Cell. 24 (4), 535-550 (2019).</li>
<li>Martinez-Martinez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+restricted+period+for+formation+of+outer+subventricular+zone+defined+by+Cdh1+and+Trnp1+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">A restricted period for formation of outer subventricular zone defined by Cdh1 and Trnp1 levels.</a> Nature Communication. 7, 11812(2016).</li>
<li>Saito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Inner+and+Outer+Fiber+Layers+in+the+Developing+Cerebral+Cortex+of+Gyrencephalic+Ferrets%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Inner and Outer Fiber Layers in the Developing Cerebral Cortex of Gyrencephalic Ferrets.</a> Cerebral Cortex. 29 (10), 4303-4311 (2019).</li>
<li>Shinmyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+the+Cerebral+Cortex+Requires+Cdk5+in+Upper-Layer+Neurons+in+Gyrencephalic+Mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Folding of the Cerebral Cortex Requires Cdk5 in Upper-Layer Neurons in Gyrencephalic Mammals.</a> Cell Reports. 20 (9), 2131-2143 (2017).</li>
<li>Matsumoto, N., Shinmyo, Y., Ichikawa, Y., Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gyrification+of+the+cerebral+cortex+requires+FGF+signaling+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Gyrification of the cerebral cortex requires FGF signaling in the mammalian brain.</a> Elife. 6, 29285(2017).</li>
<li>Kalebic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-specific+ARHGAP11B+induces+hallmarks+of+neocortical+expansion+in+developing+ferret+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex.</a> Elife. 7, 41241(2018).</li>
<li>Masuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+analyses+of+cortical+malformation+using+gyrencephalic+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological analyses of cortical malformation using gyrencephalic mammals.</a> Science Reports. 5, 15370(2015).</li>
<li>Matsumoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+analyses+of+periventricular+nodular+heterotopia+using+gyrencephalic+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological analyses of periventricular nodular heterotopia using gyrencephalic mammals.</a> Human Molecular Genetics. 26 (6), 1173-1181 (2017).</li>
<li>Barnette, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+brain+development+in+the+ferret+via+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of brain development in the ferret via MRI.</a> Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).</li>
<li>Smart, I. H., McSherry, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gyrus+formation+in+the+cerebral+cortex+in+the+ferret.+I.+Description+of+the+external+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Gyrus formation in the cerebral cortex in the ferret. I. Description of the external changes.</a> Journal of Anatomy. 146, 141-152 (1986).</li>
<li>Sawada, K., Watanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cerebral+sulci+and+gyri+in+ferrets+%28Mustela+putorius%29%5BTitle%5D)+AND+%22Congenital+Anomalies+%28Kyoto%29%22%5BJournal%5D)">Development of cerebral sulci and gyri in ferrets (Mustela putorius).</a> Congenital Anomalies (Kyoto). 52 (3), 168-175 (2012).</li>
<li>Reillo, I., Borrell, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+zones+in+the+developing+cerebral+cortex+of+ferret%3A+ontogeny%2C+cell+cycle+kinetics%2C+and+diversity+of+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Germinal zones in the developing cerebral cortex of ferret: ontogeny, cell cycle kinetics, and diversity of progenitors.</a> Cerebral Cortex. 22 (9), 2039-2054 (2012).</li>
<li>Smart, I. H., McSherry, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gyrus+formation+in+the+cerebral+cortex+of+the+ferret.+II.+Description+of+the+internal+histological+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Gyrus formation in the cerebral cortex of the ferret. II. Description of the internal histological changes.</a> Journal of Anatomy. 147, 27-43 (1986).</li>
<li>Borrell, V., Reillo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+neural+stem+cells+in+cerebral+cortex+development+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of neural stem cells in cerebral cortex development and evolution.</a> Developmental Neurobiology. 72 (7), 955-971 (2012).</li>
<li>Reillo, I., de Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+intermediate+radial+glia+in+the+tangential+expansion+of+the+mammalian+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex.</a> Cerebral Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).</li>
<li>Fietz, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OSVZ+progenitors+of+human+and+ferret+neocortex+are+epithelial-like+and+expand+by+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling.</a> Nature Neurosciences. 13 (6), 690-699 (2010).</li>
<li>Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evolution+of+the+human+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and evolution of the human neocortex.</a> Cell. 146 (1), 18-36 (2011).</li>
<li>Fietz, S. A., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+progenitor+expansion%2C+self-renewal+and+neurogenesis-a+polarized+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Cortical progenitor expansion, self-renewal and neurogenesis-a polarized perspective.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 23-35 (2011).</li>
<li>De Juan Romero, C., Bruder, C., Tomasello, U., Sanz-Anquela, J. M., Borrell, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+domains+of+gene+expression+in+germinal+layers+distinguish+the+development+of+gyrencephaly%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Discrete domains of gene expression in germinal layers distinguish the development of gyrencephaly.</a> EMBO Journal. 34 (14), 1859-1874 (2015).</li>
<li>Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+investigations+of+the+brain+of+higher+mammals+using+gyrencephalic+carnivore+ferrets%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosciences+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular investigations of the brain of higher mammals using gyrencephalic carnivore ferrets.</a> Neurosciences Research. 86, 59-65 (2014).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e3024(2011).</li>
<li>Borrell, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+delivery+to+the+postnatal+ferret+cerebral+cortex+by+DNA+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo gene delivery to the postnatal ferret cerebral cortex by DNA electroporation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 186 (2), 186-195 (2010).</li>
<li>Borrell, V., Kaspar, B. K., Gage, F. H., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evidence+for+radial+migration+of+neurons+by+long-distance+somal+translocation+in+the+developing+ferret+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">In vivo evidence for radial migration of neurons by long-distance somal translocation in the developing ferret visual cortex.</a> Cerebral Cortex. 16 (11), 1571-1583 (2006).</li>
<li>Johnson, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspm+knockout+ferret+reveals+an+evolutionary+mechanism+governing+cerebral+cortical+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size.</a> Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).</li>
<li>Vaid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+population+of+Hopx-dependent+basal+radial+glial+cells+in+the+developing+mouse+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A novel population of Hopx-dependent basal radial glial cells in the developing mouse neocortex.</a> Development. 145 (20), 169276(2018).</li>
<li>Pilz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+progenitors+in+the+mammalian+telencephalon+includes+a+new+radial+glial+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type.</a> Nature Communications. 4, 2125(2013).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

フェレットにおける子宮エレクトロポレーションでは、他の方法に関しては利点と欠点を有する重要な技術である。この方法には、重要な手順と制限事項、潜在的な変更、将来のアプリケーションが考慮されます。
Victor Borrellたちの先駆的な研究は、エレクトロポレーションまたはウイルス注射35、42、4342,43による出生後フェレット35新皮質の遺伝子操作に関する研究の先駆者として、遺伝的にアクセス可能なモデル生物となっています。子宮エレクトロポレーション19で胚発生時に遺伝子操作を確立する20は、初期の発達段階で神経前駆細胞を標的にできるようにすることで、新しい研究の可能性を開いた。出生後の操作と比較して、子宮エレクトロポレーションでは、新皮質のより大きな領域を標的にし、新皮質の他の...

新皮質は哺乳類大脳の外側のシートであり、高い認知機能の座席,21、2、3、4、53,4,5である。胚発生時に生体内で哺乳動物新皮質で急性の遺伝子操作を達成するために、ウイルス感染6および子宮エレクトロポレーション7の2つの異なる方法が検討されている。どちらの方法も新皮質細胞の効率的な標的化を可能にするが、いくつかの制限に苦しんでいる。ウイルス感染と比較して子宮エレクトロポレーションにおける主な利点は、電界の方向を調節することによって達成される新皮質内の空間特異性を達成する能力である。
エレクトロポレーションは、インビトロ8で細胞へのDNAの侵入を容易にすることが最初に示されたことから、生体内の様々な脊椎動物にDNAを送達するために適用されている。発達神経科学では、マウス新皮質の子宮エレクトロポレーションが2001年9年に10初めて報告された。この方法は、胚性脳の側心室におけるDNA混合物の注入と、その後のテキサ電極を用いた電界の適用7からなる。子宮内エレクトロポレーションでは、マウス新皮質中の内在性または異所性付加遺伝子の発現を操作するために核酸を送達するために適用されている。最近、マウス新皮質における子宮内電気ポレーションによるCRISPR/Cas9媒介ゲノム編集の方法論を適用し、後味ニューロン12、13および神経前駆細胞14、および(2)ゲノム1215およびエピゲノム16編集において(1)遺伝子破壊を行うことで重要な進歩15が見られた。
マウスの最初の報告の直後に、子宮内のエレクトロポレーションが胚性ラット新皮質17,18,18に適用された。非げっ歯類は、フェレットの子宮エレクトロポレーションの最初のまで挑戦のままでした, 小さな食動物, で報告されました2012 19,,20.それ以来、フェレットの子宮エレクトロポレーションでは、神経前駆物質とニューロン20、21、22、23を標識し21,22,23、CRISPR/Cas9,技術24の使用を含む内因性遺伝子の発現を操作し、ヒト特異的20遺伝子21、22、25、ヒト特異的遺伝子を含むヒト特異性遺伝子を含21,22む神経皮質発達のメカニズムを研究するために応用されてきた。,25さらに、フェレットの子宮エレクトロポレーションにおいて、病理学的状態27,28,28におけるヒト新皮質の発達の特徴に対処するために用いられてきた。
新皮質の発達の文脈では、フェレットをマウスと比較してモデル生物として使用することの利点は、フェレットが一連の人間のような特徴をよりよく再現するという事実によるものです。解剖学的レベルでは、フェレットは、ヒトおよび他のほとんどの霊長類にも存在する皮質折りたたみの特徴的なパターンを示すが、マウスまたはラット44、29、30、3129,30,31には完全に存在しない。組織学的レベルではフェレットは、2つの異なる心室下胚芽帯を有し、内側および外側の心室領域(それぞれISVZおよびOSVZ)32、33、内32,33繊維層23によって分離される。これらの機能は、ヒトを含む霊長類とも共有されますが、マウス34では共有されません。フェレットおよびヒトのISVZおよびOSVZには豊富な神経前駆細胞が含まれているのに対し、マウスの心室領域(SVZ)は疎神経前駆物質21、32、35、3632,35,36のみを含む。21細胞レベルでは、フェレットは、哺乳類新皮質34、37、38,37,38の進化的拡張に役立つと考えられる基底または外径神経グリア(それぞれbRGまたはoRG)と呼ばれる神経前駆体のサブタイプの高い割合を示す。bRGは、したがって胎児のヒトおよび胚性フェレット新皮質に非常に豊富であるが、それらは胚マウス新皮質35、36,36では非常にまれである。さらに、フェレットbRGは、ヒトbRGの形態学的不均一性と同様の形態学的不均一性を示し、マウスbRG21に対してはるかに優れている。最後に、分子レベルで、フェレット新皮質の開発は、皮質フォールディングの発症を制御すると推測される胎児ヒト新皮質のものと非常によく似た遺伝子発現パターンを示す。とりわけ39。
フェレットbRGの細胞の生物学的および分子的特性は、ヒトbRGと同様に、それらを高度に増殖させる。これはニューロンの増加の生産と拡張され、非常に複雑な新皮質の開発に34.これらの特性は、マウス26,40,40ではモデル化できない新皮質発達の人間のような特徴を研究するための優れたモデル生物をフェレットにする。フェレットをモデル生物として最大限に活用するために、提示された方法が開発された。これは、ユビキタスプロモーターであるCAGの制御下でGFP(pGFP)を発現するプラスミドを有するE33フェレット胚の子宮エレクトロポレーションで構成される。電気電化胚は、胚または出生後に分析することができる。殺された動物の数を減らすために、雌のフェレット(ジル)は子宮摘出術によって殺菌され、ペットとして養子縁組のために寄付される。標的胚が胚期に収穫された場合、第二の手術が行われ、胚は帝王切開によって除去され、ジルは子宮摘出される。標的胚が出生後の段階で分析される場合、ジズは子犬が脱後または犠牲になった後に子宮摘出される。したがって、ジルの子宮摘出のためのプロトコルも提示される。

<table><tbody><tr><td>1mlシリンジ</td><td>BD</td><td>309628</td><td>エレクトロポレーション</td></tr><tr><td>4-0 Vicryl縫合糸</td><td>Ethicon</td><td>V392ZG</td><td>手術</td></tr><tr><td>アルミスプレー</td><td>cp-pharma</td><td>98017</td><td>手術</td></tr><tr><td>アモキシシリン+クラブラン酸(Synulox RTU)</td> <td>WDT</td><td>6301</td><td>手術</td></tr><tr><td>カピラリーホルダー</td><td>WPI</td><td>MPH6S12</td><td>エレクトロポレーション</td></tr><tr><td>デクスパンテノール軟膏溶液</td><td>バイエル</td><td>6029009.00.00手術</td><td></td></tr><tr><td>ドレープシート45x75cm</td><td>ハルトマン</td><td>2513052</td><td>手術</td></tr><tr><td>電極ピンセット、プラチナメッキ5mm</td><td>BTX</td><td>45-0489</td>エレクトロ<td>ポレーション</td></tr><tr><td>エレクトロポレーターBTX</td><td></td><td>ECM830</td>エレクトロ<td>ポレーション</td></tr><tr><td>ファストグリーン</td><td>シグマ</td><td>F7258-25G</td><td>エレクトロポレーション</td></tr><tr><td>Ferret Mustela putorius furo</td><td>Marshall</td><td>NA</td><td>実験生物</td></tr><tr><td>光ファイバー光源</td><td>オリンパス</td><td>KL1500LCD</td><td>エレクトロポレーション</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>Allgaier instrumente</td><td>08-033-130</td><td>手術</td></tr><tr><td>用鉗子 3C-SA</td><td>Rubis Tech</td><td>3C-SA</td><td>手術</td></tr><tr><td>用鉗子 55</td><td>デュモスター</td><td>11295-51</td><td>手術</td></tr><tr><td>鉗子 5-SA</td><td>ルビステック</td><td>5-SA</td><td>手術用</td></tr><tr><td>ガーゼ綿棒 大</td><td>ハルトマン</td><td>401723</td><td>手術</td></tr><tr><td>ガーゼ綿棒 小</td><td>ハルトマン</td><td>401721</td><td>手術</td></tr><tr><td>GFAP抗体</td><td>ダコ</td><td>Z0334</td><td></td></tr>抗体 <tr><td>GFP抗体</td><td>アベスラボ</td><td>GFP1020</td><td>抗体</td></tr><tr><td>ガラスカピラリー(フィラメント付きホウケイ酸ガラス、外径:1.2mm、ID:0.69mm、長さ10cm)</td><td>サッター機器</td><td>BF120-69-10</td><td>エレクトロポレーション</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Bela-pharm</td><td>K4011-02</td><td></td></tr>手術<tr><td>用ヒートパッド</td><td>ハンス・ディンスラージュ</td><td>・サニタスSHK18</td><td>手術用</td></tr><tr><td>ヨウ素(ベタジン溶液100mg / ml)</td><td>メダ</td><td>997437</td><td>外科イ</td></tr><tr><td>ソフルラン</td><td>CP21311</td><td>手術</td><td></td></tr><tr><td>ローディングチップ20&micro;l</td><td>Eppendorf</td><td>#5242 956.003</td><td>エレクトロポレーション</td></tr><tr><td>メタミゾール</td><td>WDT</td><td>99012</td><td>手術</td></tr><tr><td>メッツェンバウム 解剖ハサミ</td><td>Aesculap</td><td>BC600R</td><td>手術</td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>Sutter Instrument</td><td>Model P-97</td><td>エレクトロポレーション</td></tr><tr><td>pCAGGS-GFP</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Kalebic et al., eLife, 2018</td></tr><tr><td>PCNA 抗体</td><td>ミリポア</td><td>CBL407</td><td>抗体、</td></tr><tr><td>pH3抗体</td>、<td>アブカム</td><td>ab10543</td><td></td></tr>抗体メス、<tr><td></td><td>Aesculap、</td><td>294200104</td><td>手術、</td></tr><tr><td>シェーバー</td>、<td>ブラウン</td><td>、EP100</td><td>手術、</td></tr><tr><td>Sox2抗体</td><td>、R + Dシステム</td><td>、AF2018</td><td></td></tr>抗体<tr><td>、外科用クランプ、13cm</td><td>、WDT</td><td>、27080</td><td>、手術</td></tr><tr><td>外科用ダブルスプーン(Williger)</td><td>WDT</td><td>27232</td><td>手術</td></tr><tr><td>用ドレープ</td><td>WDT</td><td>28800</td><td>手術</td></tr><tr><td>用ハサミ 小</td><td>FST</td><td>14090-09</td><td>手術</td></tr><tr><td>縫合針ホルダー</td><td>Aesculap</td><td>BM149R</td><td>手術</td></tr><tr><td>Tbr2抗体</td><td>Abcam</td><td>ab23345</td><td>抗体</td></tr><tr><td>トランスファーピペット 3ml</td><td>フィッシャー科学</td><td>13439108</td><td>手術用ウォーター</td></tr><tr><td>バス</td><td>Julabo</td><td>TW2</td><td>Surgery</td></tr></tbody></table>

インビボ子宮内電気ポレーションによるフェレット新皮質における神経前駆細胞の標的化

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

胚発生時の生体内での遺伝子発現の操作は、哺乳動物の発達中に個々の遺伝子の役割を分析する際に選択する方法である。子宮内エレクトロポレーションは、生体内の胚哺乳類脳における遺伝子発現の操作に関する重要な技術である。小さな食動物であるフェレットの胚性新皮質の子宮内電気散挿のためのプロトコルがここに提示される。フェレットは、新皮質がヒトおよび非ヒト霊長類にも存在する一連の解剖学的、組織学的、細胞的、分子的特徴を示すが、マウスやラットなどのげっ歯類モデルには存在しないため、新皮質開発のモデルとしてますます使用されている。子宮内電気ポレーションでは、フェレット中発性の中発性ステージである胚期(E)33で行った。子宮内電気ポレーションでは、脳の側心室を裏打ちする神経前駆細胞を標的とする。神経新生の間に、これらの前駆細胞は他のすべての神経細胞タイプを生み出す。この研究は、E37、出生後(P)1、およびP16において、それぞれ子宮エレクトロポレーション後4、9、および24日後に対応する代表的な結果と分析を示す。初期の段階では、標的細胞の子孫は主に様々な神経前駆細胞サブタイプからなり、後の段階ではほとんどの標識細胞がポストミトジンクニューロンである。このように、子宮エレクトロポレーションでは、様々なタイプの神経細胞の細胞および分子特徴に対する遺伝子操作の効果の研究が可能になる。様々な細胞集団に対するその効果を通じて、子宮エレクトロポレーションでは、フェレット新皮質の組織学的および解剖学的特徴の操作にも使用することができる。重要なことに、これらすべての効果は急性であり、ユーザーによって決定される時空間的特異性で行われる。

E33におけるフェレットの子宮エレクトロポレーションでは、胚性新皮質の心室表面を裏打ちする神経前駆細胞を標的化した(図1)。これらの細胞は、アプリカル前駆物質と呼ばれ、高度に増殖し、開発中に他のすべての細胞タイプを生み出します。非対称分裂の際、有端な前駆体は、別の有端前駆体およびより分化された細胞、典型的には心室表面から剥離した基底前駆体(BP)を生成した。BPは二次胚分帯SVZに移行した。E33でエレクトロポレーションが行われたとき、多くの新生児のBPはSVZの基底部分に移行し、そこでOSVZ22を形成した。
E37で4日後にエレクトロポレーションの効果を調べた場合、標的細胞とその子孫のほとんどは胚細胞領域(VZ、ISVZ、およびOSVZを参照)にあり、細胞が皮質プレート(CP)でさらに基底に存在することはめったになかった。標的細胞の子孫は、主に神経前駆細胞型と新生児ニューロンから構成された。前駆体同一性は、PCN...

ここで提示されるのが、子宮エレクトロポレーションで使用する胚フェレット脳における遺伝子操作を行うプロトコルである。この方法は、生体内の新皮質における神経前駆細胞の標的化を可能にする。

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...

このプロトコルは、我々は我々が開発中の新皮質の拡大と折りたたみを研究することを可能にする重要な動物モデルで生体内で遺伝子操作を実行することができます。この方法の主な利点は、脳の発達のための重要な細胞型である神経幹細胞を標的とする上で、高い空間的および時間的特異性を使用することです。手順を開始する前に、マイクロピペットプーラーでガラスの毛細血管を引っ張り、鉗子を使用して毛細血管の遠位部分を切断して毛細管先端の直径を調整します。胚性33日目に、PBSに適切なDNA濃度を加え、穏やかな混合で0.1%高速グリーンを補い、ヒートパッド付きの手術台に3時間断食した麻酔を受けた妊娠中の女性フェレットを置きます。両後肢の2番目と3番目または3番目または4番目のつま先の間で皮膚をつまんで、適切なレベルの沈澱を確認します。イオブルランは、吐き気やめまいなどの副作用を引き起こす可能性があります。イオブルランを液体で取り扱う場合は、保護具を使用してください。手術中、適切なキャニスターを使用してガスを捕獲します。動物を鎮痛薬、抗生物質、ブドウ糖で皮下注射し、動物の目に軟膏を置きます。バリカンを使って腹部を剃り、水、石鹸、ヨウ素溶液で露出した皮膚をきれいにします。その後、ガーゼ綿棒で肌を乾燥させ、アルコールとヨウ素のスクラブで消毒します。子宮内のエレクトロポレーションでは、動物の上に無菌ドレープを置き、メスを使用してリネアアルバで約5センチメートルの皮膚切開を行います。はさみを使って筋肉層を切り取り、切開部位の周りにガーゼ綿棒を置きます。PBSでガーゼを濡らし、綿棒の上に子宮を置きます。長い先端を持つピペットを使用して、注射する胚あたり5マイクロリットルのDNA溶液で引っ張られたガラス毛細血管の1つをロードする。装填したキャピラリーをホルダーに取り付け、ホルダーの反対側をチューブとマウスピースに接続します。最初の胚の頭部を見つけ、頭部の隣に光ファイバー光源を置く。色素アイリスを基準点として使用し、ガラス毛細血管の先端を用いて皮膚、頭蓋骨、および脳組織を浸透させ、口腔内で3〜5マイクロリットルの注射液を脳半球の1つの心室に送達するのを容易にする。注入された溶液は0.1%の速い緑を含んでいるので、正常な注入は、腎臓形の構造として表示されるように、注入された心室の濃い緑色の染色をもたらす。注射後、対象とする領域の上に正極を、注入領域の下に負極を持つ胚の頭の上の子宮の上にツイーザー電極を置きます。エレクトロポレートのパルス長を50ミリ秒、パルス電圧を100ボルト、パルス間隔を1秒、パルス数を5に設定します。すべてのパラメータが設定されたら、Pulseを押して、すぐに電気ポレート胚に暖かいPBSの数滴をドロップします。すべての胚が電気ポポレートされたら、子宮を腹腔に戻し、4-0縫合糸を使用して腹

in-vivo-targeting-neural-progenitor-cells-ferret-neocortex-utero

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

E16ラット胚の子宮内での脳室内注入とエレクトロポレーションで

E15マウス胚の子宮内での脳室内注入とエレクトロポレーションで

子宮内エレクトロポレーションでは、生体内で神経前駆細胞をトランスフェクションするための貴重な方法です。電極の配置とエレクトロの発達タイムポイントに応じて、皮質細胞の特定のサブセットを対象とすることができます。標的細胞は、その後、in vivoまたは遺伝的改変の影響についてin...

子宮内エレクトロポレーションは、皮質ニューロンのサブセットで、遺伝子機能の研究のために初代神経培養した

子宮内エレクトロポレーションでは発達中の中枢神経系（CNS）における空間的および時間的に制御された方法で迅速な遺伝子デリバリーを可能にする。ここでは、終脳、間脳や網膜など、複数の胚中枢神経系領域、中に発現構築物を提供するために使用することができる子宮内エレクトロポレーションプロトコルにおける適応性の高いを説明します。...

使用した複数のCNS準州への効率的な遺伝子送達子宮内でエレクトロポレーション

発展途上のマウス脳への遺伝子導入法は、ユニークな手術法と電極の特殊な形状を用いて記述されます。このユニークな手法は、脳の発達の研究に多くの神経科学者を支援する時間的および空間的にプラスミドDNAのトランスフェクションすることができます。...

マウス子宮内でエレクトロポレーション：制御時空間遺伝子導入

軟膜表面はますます注目を受けているCNSにおけるユニークな前駆ゾーンです。ここで、我々の詳細を修飾エレクトロポレーション法を使用して、この前駆ゾーンの迅速な遺伝子操作のための方法。この手順は、細胞系統および細胞分化に関与するシグナル伝達経路の細胞および分子研究のために使用することができ、娘細胞の運命および特性を解明する。...

新生児軟膜表面エレクトロ

この手順は、子宮内エレクトロポレーションによって、発生中のマウス前脳の介在ニューロンを標的にする方法を示しています。この技術は、皮質の表層に向けられた介在ニューロンサブタイプで選択的な遺伝子発現を達成するのに特に効率的でした。...

皮質介在ニューロンのサブタイプ選択的エレクトロポレーション

このプロトコルは、子宮内エレクトロポレーションを介してC57BL/6中枢神経系の異なる領域を特異的にトランスフェクションする方法を詳細に説明しています。このプロトコルには、皮質、海馬、視床、視床下部、外側中隔核、線条体に発達する領域のトランスフェクションに関する詳細な指示が含まれています。...

Cortex-、Hippocampus-、Thalamus-、Hypothalamus-、横中隔Nucleus-と線条体固有<em&gt;子宮内</em&gt; C57BL / 6マウスでのエレクトロポレーション

この原稿は、単一細胞レベルおよび蛍光標識された神経細胞の興奮で、ニューロンの構造的接続性を記述するために子宮内エレクトロポレーション（IUE） で使用するプロトコルを提供します。組織学は、樹状突起および軸索突起を特徴付けるために使用されます。急性スライスにおける全細胞記録は、興奮性を調査するために使用されます。...

子宮内エレクトロポレーションは、神経部分集団の興奮とシングルセルの接続を研究するためのアプローチ

子宮エレクトロポレーションの二重は、空間的および時間的に分離された細胞集団を標的にすることを可能にする。この技術は、通常の条件で蛍光タンパク質を使用して、また、目的の遺伝子を摂動する機能実験の後に、それらの細胞集団間の相互作用を視覚化するのに有用である。...

時間的および空間的に分離された細胞集団を標的とする子宮エレクトロポレーションの二重

ここでは、エレクトロポレーションによるスライスされたヒト皮質オルガノイドの急性遺伝子操作について紹介します。これらの皮質オルガノイドモデルは、スライス後に心室のような構造を容易に特定できるため、特に注射に適しており、ヒトの皮質発達、神経発達障害、および皮質進化の機能的研究を可能にします。...

遺伝子機能研究のためのスライスヒト皮質オルガノイドのエレクトロポレーション

学ぶインビボ子宮内電気ポレーションによるフェレット新皮質の神経前駆細胞標的化法。脳の発達と進化における遺伝子機能を解明し、ヒト新皮質の拡張メカニズム理解に貢献します。

インビボ子宮内電気ポレーションによるフェレット新皮質における神経前駆細胞の標的化

さらに動画を探す