Name: ショウジョウバエ・メラノガスターの概日伝播 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 学ぼう、ショウジョウバエ・メラノガスターの概日同期手法と免疫ブロッティングによる検証法。この方法は生物時計研究の基盤となり、生理リズムのメカニズム解明に活用できます。

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ミズーリ大学カンザスシティ校とジェフリー・L・プライス研究所に感謝します。

1. フライ食品生産
<ol><li>水の1 Lごとに、乾燥糖蜜の4.69 g、乾燥活性酵母の19.70 g、トウモロコシの食事の87.22 gと寒天の7.83グラムからなるフライ食品を調製します。</li>
	<li>上記の内容物をクロックポットに組み合わせ、熱を250°Fに変えます。 材料と同様に混ぜる。</li>
	<li>フライフードが加熱されている間、蓋をクロックポットに置き、10分ごとに内容物を混ぜ合わせて、転がれ沸騰するまで蓋をします。沸騰したゆを20分間続けてから火を消します。</li>
	<li>83.60mLの水を加え、食べ物が冷やすようにクロックポットの蓋を外します。</li>
	<li>ガラス温度計で10分ごとに食品の温度を混ぜて記録します。食べ物の上にフィルムの層を落ち着かせないようにしてください。</li>
	<li>食品が60°Cに冷却されたら、テゴセプトの10.44 mLと加水1リットル当たりプロピオン酸5.51mLを加えます(ステップ1.1を参照)。</li>
	<li>よく混ぜて60°Cまで加熱し、食品が冷えすぎないようにします。</li>
	<li>ドロソフィラーを使用して、必要に応じてフライフードをポンプで送ります。</li>
	<li>狭いバイアルの場合、ポンプ10 mLと6オンスの正方形の底のボトルポンプ60 mL。</li>
</ol>2. 指定された年齢のハエの収集
<ol><li>野生型ハエのモニターボトルは、25°Cで5〜7日間保存され、大量の子犬(約200個の子犬)がボトルの側面に取り付けられるまで保管されています。使用されるボトルは、正方形の底を持つ6オンスショウジョウバエストックボトルです。</li>
	<li>ボトルから既存の大人をクリアします。大人を新しいボトルに入れるか、70%エタノールに入れます。#0の絵筆の鈍い端を使用して、残りの大人をフライフードに押し込みます。使用前と使用後に70%エタノールでペイントブラシを拭き取るようにしてください。</li>
	<li>クリアしたボトルを25°Cのインキュベーターで3日間座って、次世代が閉じられるようにします。これらのハエは0〜3日の間になります。</li>
</ol>3. フライの分離
<ol><li>3日後、男性を女性から分離し、4つのタイムポイントごとに性別ごとに所望の数を集める。ハエは生殖器を調べることによってセックスによって区別することができる。男性は暗い丸みを帯びた生殖器を持っているのに対し、女性は明るく、より尖った生殖器を持っている。メスもオスのハエよりはるかに大きい。<ol>
<li>CO2麻酔2パッドを使用して、ハエを効果的に分離し、男女を区別します。ハエを殺さないように、ペイントブラシで動かしてください。</li>
		<li>各タイムポイントに対して100人の男性と100人の女性を集め、バイアルあたり50人の男性とバイアルあたり100人の女性を集める。男性はより積極的になる傾向があり、彼らの社会的相互作用は、バイアルに100人の個人がいるときに多くの死につながります。バイアルに含まれている間、最大100人の女性は影響を受けません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ZT1、ZT7、ZT13、ZT19 (表 1) の時点でコレクションを実行します。暗い(ZT12-ZT24)で行われたコレクションは光に敏感であるのに対し、ZT0-ZT11コレクションはライトオン時に行われ、ルームライトは点灯することができます。2つの別々のインキュベーターは、すべてのコレクションが一晩ではなく日中に発生することを可能にするために、逆12時間の光パターンで使用されることに注意してください。</li>
	<li>余分なハエを使用して、将来のエントレインメントのためにハエの新しいボトルを作成します。新しいボトルに5〜7人の男性を入れた25人のメスを入れ、25°Cの保育器に入れます。</li>
</ol>4. フライインキュベーション
<ol><li>概日の巻き込みが発生できるように、ハエが3〜5日間光規制インキュベーターに滞在することを許可します。少量の光害でも封じ込めが妨げになるので、インキュベーターが軽く締まるようにしてください。</li>
</ol>5. 免疫蛍光固定
<ol><li>エントレーニング後、免疫蛍光に使用されるサンプルの固定溶液の新しいバイアルを準備します。インキュベーターからハエを取り除く前に、固定される100ハエごとに新しい狭いバイアルに1x PBS + 0.1%Tween-20で希釈した4%ホルムアルデヒドの4.8 mLを加えます。各バイアルは、100人の男性または100人の女性の概日訓練されたハエを収容します。細いバイアルを氷の中に入れる。</li>
</ol>6. 免疫蛍光コレクション
<ol><li>蛍光免疫のためにインキュベーターからハエを採取する場合は、ボトルキャップを取り外し、ボトルを漏斗に素早く反転します。ハエを漏斗で溶液にそっとタップして、ハエをバイアルに導きます。1つのバイアルに合計100人の男性のための50の男性の2つのチューブを組み合わせ、他のバイアルのための100の女性の単一のチューブを使用しています。</li>
	<li>暗闇の中でZT13とZT19コレクションを実行します。ショウジョウバエがこれらの光波長に対する感受性がはるかに低く、したがって光汚染13になりやすいので見るために赤い光を使用してください。特にクリプトクロムタンパク質は青色光に対して特に感受性であり、14を避けなければならない。<ol>
<li>光の露出を減らすために、コレクションの部屋が遮られたり覆われた光の源で軽く締まるようにしなさい。次の手順で、ZT13およびZT19ハエがナットミキサーに置かれたときに光にさらされないように、これらのバイアルをホイルで包みます。ZT1およびZT7ハエは光に敏感ではなく、ホイルカバーなしでミキサーに置くことができる。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. ミキサーとストレージの栄養を取り込む
<ol><li>ハエが回収された後、こぼれを避けるために固定剤を含むバイアルの上部をテープで貼り付け、4°Cで165 RPMの栄養ミキサーに4時間置きます。この固定ステップの後、ハエはもはや光に敏感ではないので、溶液が動いていることを確認するためにホイルを取り除き、ハエが固定剤に沈められていることを確認することができます。</li>
	<li>ヌテッティングミキサーからバイアルを含むハエを取り除いた後、ホルムアルデヒドを取り出し、3,000 μLの1x PBSで3回洗浄し、洗浄ごとにバイアルを反転します。</li>
	<li>免疫蛍光サンプルを持つバイアルを4°Cに保存して、将来の免疫蛍光15を待つ。</li>
</ol>8. タンパク質抽出用コレクション
<ol><li>タンパク質抽出用サンプルを保存するために、4本の50 mLチューブと液体窒素を含むデュワーを用意</li>
	<li>タンパク質または核酸抽出のためにハエを収集するために、ステップ6.1と同じ方法でボトルからチューブにハエを移し、すぐにチューブをキャップしてハエの放出を防ぎ、チューブを液体窒素に入れて凍結します。</li>
</ol>9. タンパク質抽出用ストレージ
<ol><li>タンパク質抽出用のスナップ凍結サンプルを-80 °Cに保存します。 これらは、下流分析に適したタンパク質抽出プロトコルに従って処理することができる、免疫ブロット16を含む。</li>
</ol>

<ol><li>Halberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+physiological+and+clinical+aspects+of+24-hour+periodicity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal-Lancet%22%5BJournal%5D)">Some physiological and clinical aspects of 24-hour periodicity.</a> The Journal-Lancet. 73 (1), 20-32 (1953).</li>
<li>Smarr, B. L., Jennings, K. J., Driscoll, J. R., Kriegsfeld, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time+to+remember%3A+the+role+of+circadian+clocks+in+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A time to remember: the role of circadian clocks in learning and memory.</a> Behavioral Neuroscience. 128 (3), 283-303 (2014).</li>
<li>Leng, Y., Musiek, E. S., Hu, K., Cappuccio, F. P., Yaffe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+circadian+rhythms+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Neurology%22%5BJournal%5D)">Association between circadian rhythms and neurodegenerative diseases.</a> The Lancet. Neurology. 18 (3), 307-318 (2019).</li>
<li>Hood, S., Amir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+and+the+Circadian+Clock%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration and the Circadian Clock.</a> Frontiers in aging Neuroscience. 9, 170(2017).</li>
<li>Sulli, G., Lam, M. T. Y., Panda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+Circadian+Clock+and+Cancer%3A+New+Frontiers+for+Cancer+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interplay between Circadian Clock and Cancer: New Frontiers for Cancer Treatment.</a> Trends in Cancer. 5 (8), 475-494 (2019).</li>
<li>Zehring, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-element+transformation+with+period+locus+DNA+restores+rhythmicity+to+mutant%2C+arrhythmic+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">P-element transformation with period locus DNA restores rhythmicity to mutant, arrhythmic Drosophila melanogaster.</a> Cell. 39 (2 Pt 1), 369-376 (1984).</li>
<li>Bargiello, T. A., Jackson, F. R., Young, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+circadian+behavioural+rhythms+by+gene+transfer+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoration of circadian behavioural rhythms by gene transfer in Drosophila.</a> Nature. 312 (5996), 752-754 (1984).</li>
<li>Siwicki, K. K., Eastman, C., Petersen, G., Rosbash, M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+the+period+gene+product+of+Drosophila+reveal+diverse+tissue+distribution+and+rhythmic+changes+in+the+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Antibodies to the period gene product of Drosophila reveal diverse tissue distribution and rhythmic changes in the visual system.</a> Neuron. 1 (2), 141-150 (1988).</li>
<li>Hardin, P. E., Hall, J. C., Rosbash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+of+the+Drosophila+period+gene+product+on+circadian+cycling+of+its+messenger+RNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Feedback of the Drosophila period gene product on circadian cycling of its messenger RNA levels.</a> Nature. 343 (6258), 536-540 (1990).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+period+gene+encodes+a+predominantly+nuclear+protein+in+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The period gene encodes a predominantly nuclear protein in adult Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 12 (7), 2735-2744 (1992).</li>
<li>Vosshall, L. B., Price, J. L., Sehgal, A., Saez, L., Young, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Block+in+nuclear+localization+of+period+protein+by+a+second+clock+mutation%2C+timeless%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Block in nuclear localization of period protein by a second clock mutation, timeless.</a> Science (New York, N.Y). 263 (5153), 1606-1609 (1994).</li>
<li>Price, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((double-time+is+a+novel+Drosophila+clock+gene+that+regulates+period+protein+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">double-time is a novel Drosophila clock gene that regulates period protein accumulation.</a> Cell. 94 (1), 83-95 (1998).</li>
<li>Hanai, S., Hamasaka, Y., Ishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+entrainment+to+red+light+in+Drosophila%3A+requirement+of+Rhodopsin+1+and+Rhodopsin+6%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Circadian entrainment to red light in Drosophila: requirement of Rhodopsin 1 and Rhodopsin 6.</a> Neuroreport. 19 (14), 1441-1444 (2008).</li>
<li>Vinayak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exquisite+light+sensitivity+of+Drosophila+melanogaster+cryptochrome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exquisite light sensitivity of Drosophila melanogaster cryptochrome.</a> PLoS Genetics. 9 (7), e1003615(2013).</li>
<li>Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+Immunofluorescent+Staining+of+Mushroom+Body+and+Photoreceptor+Neurons+in+Adult+Drosophila+melanogaster+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56174(2017).</li>
<li>Au-Eslami, A., Au-Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blotting%3A+Sample+Preparation+to+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Western Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359(2010).</li>
<li>Fan, J. Y., Muskus, M. J., Price, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrainment+of+the+Drosophila+circadian+clock%3A+more+heat+than+light%5BTitle%5D)+AND+%22Science%27s+signal+Transduction+Knowledge+Environment%22%5BJournal%5D)">Entrainment of the Drosophila circadian clock: more heat than light.</a> Science's signal Transduction Knowledge Environment. (413), pe65(2007).</li>
<li>Miyasako, Y., Umezaki, Y., Tomioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separate+sets+of+cerebral+clock+neurons+are+responsible+for+light+and+temperature+entrainment+of+Drosophila+circadian+locomotor+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Separate sets of cerebral clock neurons are responsible for light and temperature entrainment of Drosophila circadian locomotor rhythms.</a> Journal of Biological Rhythms. 22 (2), 115-126 (2007).</li>
<li>Edery, I., Zwiebel, L. J., Dembinska, M. E., Rosbash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+phosphorylation+of+the+Drosophila+period+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Temporal phosphorylation of the Drosophila period protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2260-2264 (1994).</li>
<li>Helfrich-Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroarchitecture+of+the+circadian+clock+in+the+brain+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">The neuroarchitecture of the circadian clock in the brain of Drosophila melanogaster.</a> Microscopy Research and Technique. 62 (2), 94-102 (2003).</li>
<li>Price, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+for+clock+mutants+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Genetic screens for clock mutants in Drosophila.</a> Methods in Enzymology. 393, 35-60 (2005).</li>
</ol>

研究者は、成功と一貫性を持つこのエントレインメントプロトコルを利用しています。この手順により、将来の分析のために格納できる大規模なサンプリング プールを固定できます。さらに、この戦略は、将来の検査のために訓練することによって誘発される神経学的パターンを維持する。
貯蔵のための固定は、脳組織を安定させるのに役立ち、データプールから各脳を分析する時間が増え、21歳までに生存率を失う脳からの無駄を最小限に抑えるため、エントレインメントプロセスの主要な構成要素である。主な目標は、頭部の切り抜きに利用可能な連続的な在庫があり、最終的には免疫蛍光またはタンパク質抽出が得られるように、できるだけ多くのハエを概日に巻き込み、その発見を観察し、結果が高い信頼度であるかどうかを判断することです。概日の巻き込みを固定によって確実に保存するためには、光害の源を排除することが不可欠です。固定プロセスにより、ショ ウジョウバエ は神経学的な「タイムスタンプ」を維持しながら保存できるため、後で解剖され、解剖され、接種直後に免疫蛍光を受けたハエに顕著な違いなしで分析することができます。免疫蛍光の前に固定の目的のために、実験室はハエが少なくとも1ヶ月まで生存可能であることを一貫性をもって決定した。ウェスタンブロットタンパク質抽出のための固定は、-80°Cで保存すると脳を無期限に生存可能にします。
もう一つの重要なプロトコルステップは、ハエのセックスです。このステップは、固定前に同じバイアルに男女の両方を持つことが交配につながる可能性があり、男性が女性の代わりに誤って検査された場合、若い年齢で腐敗したタンパク質分析を行う新しいハエを生み出す可能性がある、またはその逆を正確に行うことが重要です。さらに、セックスの際には、時には女性に付着している幼虫標本を取り除くことが重要です。これは潜在的に結果を破損する可能性がある女性のバイアル内の新しい子孫の開発を防ぎます.
エントレインメント プロトコルの次のステップは、データ分析に関連する項目です。プロトコルの焦点はタンパク質の局在化ですが、概日の封じ込めの影響を受ける他の変数がある場合、タンパク質または核酸抽出を必要とする新しい道を探索する必要があります。さらに、 このプロトコルを介して分析することができる脳の他のタンパク質があります。.プロトコルに関連する実験は、特定のタンパク質を分析したが、概日生物学で役割を果たす遺伝子とタンパク質のリストは使い果たされていない。このプロトコルは概日リズムを確立するという目標を達成するのに有効ですが、アプリケーションは広範囲に及んでいます。

地球上のほぼすべての生物は、最大から単細胞まで、約1日のサイクルを持つ内部生物学的時計を有する。これは概日リズム(ラテン語の頃からフランツ・ハルバーグによって1953年に作られた=約/およそと"dies"=日)として知られています1.コアクロックの成分は知られており、その初歩的な機能機構が概念化されていますが、生体リズムが全身でどのように維持されているかを理解することはまだまだたくさんあります。重要なことに、生物学的リズムの誤調節は、記憶不良、睡眠障害、季節性影響障害、うつ病、双極性障害、糖尿病、肥満、神経変性、および癌22、3、4、53,4,5を含む健康状態の悪い転帰に関連している。
ショウジョウバエは、概日生物学の調査のための確立されたモデルです。遺伝的および生化学的に難易な、多数が容易に(示されるように)緊張される。実際、概日リズムの発見のためのノーベル賞の受賞を支援する主要な出版物として引用された7つの出版物はすべて、ショウジョウバエ,モデル,66、7、8、9、10、11、127のこれらの強みを活用しました。9,10,11,128
さらに、免疫蛍光、核酸、またはタンパク質抽出ベースの分析を目的として、緊張したハエを収集するための効果的な戦略を示します。これらの戦略を使用して、将来分析するために大量のサンプルを処理して保存することができます。これらの方法は、再現性があり、大規模なデータ プールの一部となり得る何百もの訓練されたハエを生成できるという点で非常に有利です。

<table><tbody><tr><td>100-1000uL ピペット</td><td>Eppendorf</td><td>ES-1000</td><td></td></tr><tr><td>10-100uL ピペット</td><td>Eppendorf</td><td>ES-100</td><td></td></tr><tr><td>16% パラホルムアルデヒド溶液</td><td>15710</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL01-6X100ML</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td>フィ<td>ッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>BP1423500</td><td></td></tr><tr><td>麻酔フィルター接続キット</td><td>世界精密機器</td><td>EZ-251A</td><td></td></tr><tr><td>コーンミール</td><td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>62-100</td><td></td></tr><tr><td>乾燥糖蜜</td><td>フードサービスダイレクト</td><td>OT280504</td><td></td></tr><tr><td>ドロソフィラーフードポンプ</td><td>geneseesci.com</td><td>59-169</td><td></td></tr>ショ<tr><td>ウジョウバエストックボトル、6オンススクエアボトムw /フラッグ geneseesci.com</td><td></td><td>32-130BF</td><td></td></tr><tr><td>ショウジョウバエバイアル、ナローK-レジンスーパーバルク</td><td>geneseesci.com</td><td>32-118SB</td><td></td></tr><tr><td>乾燥活性酵母</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>62-103</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>IBI サイエンティフィック</td><td>IB15720</td><td></td></tr><tr><td>EZ基本麻酔システム</td><td>ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ</td><td>EZ-175</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン遠心チューブ</td><td>コーニング</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン丸底チューブ</td><td>コーニング</td><td></td><td></td>352057</tr><tr><td>ファインポイントシャーピーマーカー</td><td>シャーピー</td><td>30001</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド ナットミキサー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>88-861-043</td><td></td></tr><tr><td>フラッグスナロープラスチックバイアル</td><td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>49-102</td><td></td></tr><tr><td>ガラス温度計</td><td>コールパーマー</td><td>EW-08008-12</td><td></td></tr><tr><td>液体窒素ホース</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>398202</td><td></td></tr><tr><td>液体窒素タンク-デュワー</td><td>クーパーサージカル社</td><td>900109-1</td><td></td></tr>液体<tr><td>窒素移動容器</td><td>電子Mircoscopy科学</td><td>61891-02</td><td></td></tr>絵<tr><td>筆(赤いセーブル)サイズ#0</td>電気<td>顕微鏡科学</td><td>66100-00</td><td>これは、怪我を引き起こすことなく性別を介してハエを分離するために使用されます。</td></tr><tr><td>プラスチック漏斗</td><td>PlewsおよびEdelmann</td><td>570-75-062</td><td></td></tr><tr><td>偏光光学顕微鏡</td><td>顕微鏡中央</td><td>1100100402241</td><td>性別の間にショウジョウバエをよりはっきり見るために使用される</td></tr><tr><td>ProPetteピペットのヒント</td><td>MTCの生物の先端</td><td>P5200-100U</td><td></td></tr><tr><td>ProPetteのピペットの先端</td><td>MTCの生物のIncorporated</td><td>P5200-1M</td><td></td></tr><tr><td>ProPetteのピペットの先端</td><td>MTCバイオインコーポレイテッド</td><td>P5200-5M</td><td></td></tr><tr><td>プロピオン酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P1386-1L</td><td></td></tr><tr><td>レーヨンボールジェ</td><td>ネシーサイエンティフィック</td><td>51-100</td><td></td></tr><tr><td>レイノルズラップ標準アルミホイル</td><td>ステープル</td><td>1381273</td><td></td></tr><tr><td>ロースターオーブン(クロックポット)</td><td>ハミルトンビーチ</td><td>32950</td><td></td></tr><tr><td>スコッチ810マジックテープ</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>77300</td><td></td></tr>トリガー<tr><td>付きスプレーボトル</td><td>米国プラスチック</td><td>66446</td><td>エタノールをスプレーして作業の曲げ領域を清掃するために使用されます</td></tr><tr><td>テゴセプト</td><td>ジェネシー サイエンティフィック</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>サーモサイエンティフィック ショウジョウバエ インキュベーター</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>3990FL</td><td></td></tr><tr><td>サーモサイエンティフィック Revco 4 度ラボ冷蔵庫</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック サイエンティフィ</td><td>ック REL7504D</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Revco ラボ用冷凍庫</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>REL7504A</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Anatrace</td><td>T1003-1-GA</td><td></td></tr></tbody></table>

ショウジョウバエ・メラノガスターの概日伝播

Circadian Entrainment of Drosophila Melanogaster

生物の間でほぼ普遍的な概日リズムは、太陽の周りの地球の軌道に生物活動を調整します。このリズムを生み出す因子を特定し、結果の出力を理解するために、定義された概日の時間ポイントにモデル生物を乗り込む必要があります。ここでは、多くのショウジョウバエを定義された概日リズムに巻き込む手順を詳述する。さらに、免疫蛍光、核酸、またはタンパク質抽出ベースの分析のためのサンプルを調製するための後のエントレインメントステップについて詳しく説明します。

制御された概日の訓練は、研究者がZT1-ZT19タイミングスケジュールを使用して概日を通して特定の時点で生物学を調べたり、必要に応じてタイムポイントを追加することを可能にします。ここでは、光と闇を使用して、ハエを概日サイクルに巻き込み、周期タンパク質の免疫ブロット法および免疫蛍光分析(概日巻き入れのマーカー)によってエントレインメントを検証します(図1)。正しいエントレインメントの際、周期タンパク質は特徴的な強度と移動パターンを持つ必要があります(図1A)、ZT1脳内の特定の場所(図1AB)で見える必要があります。食品や温度を含む他の変数は概日の入り込みに影響を与えることができますが、光は最もシンプルで、17を制御するために信頼性が高いです。これらの方法の目的のために、インキュベーター温度は一定に保たれ、エントレインメント18のための光の影響を受ける脳時計ニューロンに依存する。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61176/61176fig1.jpg"> 図1:エントレインメントの検証(A)増殖したハエの頭部から調製された全細胞抽出物の免疫ブロットは、期間タンパク質移動度および強度19の正規パターンを示す。示されたツァイトゲバー時間(ZT)のそれぞれから1.4の女性の頭部は抗Per抗体を用いて分析した。(B) ZTで集められた、生理タンパク質が特徴的なパターンで見つかる、緊張した脳の免疫蛍光(下部パネル、ヘルフリッヒ・フォルスター20から再現)。図示は、脳の異なるセクションから撮影された画像であり、ZT1で期間タンパク質を含むと予想されるすべてのニューロンをキャプチャする。スケールバーは40 μmです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61176/61176fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ZT1</td>
			<td>ZT7</td>
			<td>ZT13</td>
			<td>ZT19</td>
		</tr>
<tr>
<td>午前10時から午後10時までの間の光</td>
			<td>午前10時から午後10時までの間の光</td>
			<td>暗い午前9時から午後9時</td>
			<td>暗い午前9時から午後9時</td>
		</tr>
<tr>
<td>光の中で1時間後の午前11時に収集</td>
			<td>光の中で7時間後の午後5時に収集</td>
			<td>暗闇の中で1時間後の午前10時に収集</td>
			<td>暗闇の中で7時間後の午後4時に収集</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: ZT1-ZT19 概日リズムタイミングスケジュール

ここでは、ショウジョウバエを概日に同期させる方法について詳しく説明します。これは、生物学的リズムとクロノバイオロジーを研究するために必要な最初の、そして最も重要なステップです。

Nearly universal among organisms, circadian rhythms coordinate biological activity to earth&#39;s orbit around the sun. To identify factors creating this ...

ショウジョウバエを同期して概日時間を定義することは、生物学的時計を制御または応答するイベントを研究する最初のステップです。すべてのモデルの同期は、同じ基本的なアプローチに従います。これを実用的に行うための多くのステップがあり、それらをすべてまとめるのは圧倒的に思えるかもしれません。自然に感じる前に数回試してみるのを期待してください。温度を安定させ、3分間の間に明かりを消したい。食材を加えると混ぜて、摂氏121度のクロックポットでフライフードを準備します。クロックポットを覆い、内容物を10分ごとに混ぜて沸騰させます。20分後に沸騰し、火を消し、83.6ミリリットルの水をクロックポットに加えます。食べ物が冷えるにつれて蓋をはずしたままにしておきます。食品が冷却されている間、フィルムが上に形成されないように10分ごとにかき混ぜます。また、ガラス温度計で10分ごとに温度を測定します。食品が摂氏60度以下に冷却されたら、原稿に記載されているようにテゴセプトとプロピオン酸を加えます。よく混ぜて、60°C未満の温度を維持するためにクロックポットを調整します。フライ食品を配布するために蠕動ポンプを使用してください。狭いバイアルの場合、10ミリリットルをポンプし、6オンスの正方形の底のボトルのために、60ミリリットルをポンプ。野生型ハエは10〜12日間摂氏25度で保管し、約200頭の子犬がボトルの内側に取り付けられるまで保管してください。ボトルから大人を取り除くために、新しいボトルにチップを入れ、残りの大人を押し込むためにナンバーゼロのペイントブラシの鈍い端を使用します。使用前と使用後に70%エタノールでペイントブラシを拭きます。次の世代が出現できるように、摂氏25度で子犬をインキュベートします。3日後、ハエは生後0日から3日になります。温度、光、そして食べ物の選択さえも、入り込みに影響を与えることを覚えておいてください。実験中は、各コントロールを保持してください。採取の指定された時点で、二酸化炭素麻酔パッドを使用してハエを固定し、100人の男性と100人のメスを集めます。雌のハエはオスよりはるかに大きい。ハエはまた生殖器を調べることによって区別することができる。男性は暗い丸みを帯びた生殖器を持っていますが、女性は軽く、より尖った生殖器を持っています。男性と女性をバイアルあたり100人の女性とバイアルあたり50人の男性と別々のバイアルに入れる。男性の社会的相互作用は、バイアルに100人の個体があるとき、多くの死につながります。概日の巻き込みが起こるようにするために、バイアルを光調節インキュベーターに3〜5日間置きます。将来の入り込みのためにハエを生産するには、残りのメスの25人と残りのオスの5〜7人を新しいボトルに入れます。ボトルを摂氏25度でインキュベートします。収集される100ハエごとに。固定剤の4.8ミリリットルを追加することにより、狭いバイアルを準備します。細いバイアルを氷のバケツに入れ、バケツ、ペーパータオル、ホイル、テープをインキュベーターに持って行きます。ハエを収集するには、狭いバイアルに漏斗を置き、ハエのバイアルからキャップを取り外し、すぐに漏斗に反転します。静かにハエを固定剤のバイアルに導くのに役立ちます。男性を収集する場合は、1つの狭いバイアルに50ハエの2つのバイアルを組み合わせます。ホイルでZT13とZT19のバイアルを包みます。ハエを移した後、こぼれを避けるためにキャップをテープで貼ります。バイアルを165 RPM、摂氏4度で4時間ヌゲーティングミキサーに置きます。ハエはもはや光に敏感ではないので、ホイルはハエが固定剤に沈められていることを確認するために取り除かれるかもしれない。ヌゲーティングミキサーからバイアルを取り外した後、ホルムアルデヒドを取り除き、1X PBSの3000マイクロリットルでハエを3回洗い、各洗浄中にバイアルを反転します。バイアルを摂氏4度で保存し、将来の免疫蛍光を待ちます。光と闇は、概日周期にハエを巻き込むために使用されました。エントレインメントは、免疫ブロッティング、および経日封じ込め用マーカーである期間タンパク質の免疫蛍光分析によって検証された。細胞全体抽出物の免疫ブロット法は、緊張したハエの頭部から調製し、期間タンパク質移動度および強度の正規パターンを示す。ZT1で採取された、エントレーニングされた脳の免疫蛍光は、特徴的なパターンで期間タンパク質を示す。この方法は、免疫蛍光、免疫プロット、免疫沈降、行動分析、および生物学的時計が刻むにつれて経路がどのように変化するかを比較するために使用する可能性のある他の技術のための飛び降りポイントです。モデル生物をエントレインする能力を使用すると、お気に入りの経路が時間の経過とともに変化するかどうか、および好きな経路の影響が生物学的破壊につながるかどうかを尋ねることができます。生物学的時計が破壊されると、多くの病気が悪化する。根本的なメカニズムを特定することは、アルツハイマー病やパーキンソン病などの病気に苦しむ人々のためのより効果的な薬を作成するのに役立ちます。

circadian-entrainment-of-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Biology

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