Name: 糸球体腎炎における細胞外DNAの半定量化のための教師付き機械学習 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学習する糸球体腎炎における細胞外DNAの半定量化法。教師付き機械学習を用いて腎組織内のecDNAを可視化し、病理学的損傷のサロゲートマーカーとして測定する技術を解説します。

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我々は、ニコンC1直立共焦点レーザー走査顕微鏡と腎臓組織の処理のためのモナッシュ組織学プラットフォームの使用のためのモナッシュマイクロイメージングを認める。

<ol><li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+%28ANCA%29-associated+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li>
<li>Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+antineutrophil+cytoplasmic+autoantibody-associated+small-vessel+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis.</a> Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).</li>
<li>Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+as+a+defence+against+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death as a defence against infection.</a> Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death%3A+the+significance+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology%22%5BJournal%5D)">Cell death: the significance of apoptosis.</a> International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).</li>
<li>Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+one+way+to+die%3A+apoptosis%2C+necrosis+and+reactive+oxygen+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage.</a> Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).</li>
<li>Pasparakis, M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+and+its+role+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Necroptosis and its role in inflammation.</a> Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).</li>
<li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-1-dependent+pore+formation+during+pyroptosis+leads+to+osmotic+lysis+of+infected+host+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages.</a> Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).</li>
<li>Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+mediated+autoimmune+glomerular+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice.</a> Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).</li>
<li>Ruth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-neutrophil+cytoplasmic+antibodies+and+effector+CD4%2B+cells+play+nonredundant+roles+in+anti-myeloperoxidase+crescentic+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).</li>
<li>Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+DNA+in+natural+environments%3A+features%2C+relevance+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).</li>
<li>Burnham, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+cell-free+DNA+is+a+versatile+analyte+for+monitoring+infections+of+the+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract.</a> Nature Communications. 9 (1), 2412(2018).</li>
<li>Gobe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+apoptosis+in+kidney+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of apoptosis in kidney tissue sections.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).</li>
<li>Olander, M., Handin, N., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-Based+Quantification+of+Cell+Debris+as+a+Measure+of+Apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).</li>
<li>Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trainable+Weka+Segmentation%3A+a+machine+learning+tool+for+microscopy+pixel+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification.</a> Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neutrophil+extracellular+traps+in+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).</li>
<li>Chapman, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caught+in+a+Trap%3F+Proteomic+Analysis+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Rheumatoid+Arthritis+and+Systemic+Lupus+Erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus.</a> Frontiers in Immunology. 10, 423(2019).</li>
<li>Oliveira, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sudan+Black+B+treatment+reduces+autofluorescence+and+improves+resolution+of+in+situ+hybridization+specific+fluorescent+signals+of+brain+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+%26+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections.</a> Histology & Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).</li>
<li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).</li>
<li>Schreiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+controls+NET+generation+and+mediates+complement+activation%2C+endothelial+damage%2C+and+autoimmune+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).</li>
<li>Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-myeloperoxidase+antibody+positivity+in+patients+without+primary+systemic+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis.</a> Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).</li>
</ol>

開示するものは何もありません。

糸球体腎炎の患者およびマウスモデルの血清および尿中の炎症促進マーカーを測定する複数のプロトコルが存在する。この記述されたプロトコルは糸球体の中の細胞死の産物(ecDNA、NETおよびecMPO)を直接分析することを可能にする。このプロトコルの最も重要なステップは、組織の準備とイメージングです。蛍光染色法を用いて分析する主な制限要素は、組織自家蛍光です。ホルマリン固定パラフィン組織は、特定の蛍光染色を覆い隠すことができる自己蛍光の対象となります。スライドがスーダンブラックに浸漬される染色法の最終工程では、組織の自己蛍光を減衰させ、信号対雑音比19の低減を通じて抗体特異的染色の照明を可能にする。この組織のイメージングは、ecDNAおよびMPOの小さな断片を検出できるように、少なくとも40倍の油倍率で行う必要があります。イメージングを取得する場合、あるマーカーから別のマーカーへの蛍光の出血を防ぐために、連続したラインで行うことは重要です。
分析用のプロトコルの利点は、誰でも16にアクセスするた...

骨髄ペルオキシダーゼ抗好中球細胞質抗体関連血管炎(MPO-AAV)は、腺球体損傷による腎不全を有する自己免疫疾患であり、相当な細胞死および脱酸性ビオ核酸(DNA)1、2。1,2DNAは、危険信号として機能することによって免疫系を活性化することができます。正常な健康な条件下では、DNAの核位置は免疫系への暴露からの保護を提供する。病原性プロセスまたは自己免疫の間に細胞外に放出される自己DNAは、免疫系によって、分子自己タンパク質(DAMP)3に関連する強力な炎症障害として見られる。細胞外DNA(ecDNA)は、アポトーシス、ネクロトーシス好中球外細胞トラップ形成(NETs)、壊死またはピロプトーシス4,4、5、6、7、8などの異なる生化学的経路によって支配されるいくつかの異なるメカニズムを介して死細胞から放出される。5,6,7,8
我々は、MPO-AAV99,1010の患者からの実験的抗MPO GNおよび腎臓生検からホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)腎臓のセクションで死細胞から放出されるecDNAを染色および測定する方法をここに記載する。血清および尿の両方から、およびインビトロアッセイ11,12から循環二本鎖DNA(dsDNA)およびDNA複合体を検出するための複数の方法が12存在する。これらの方法は、ecDNAの量を決定する際に正確であるが、ecDNAが解剖学的に放出される場所を決定しない。アポトーシスのためのチューンルや細胞デブリの測定などのecDNAの特異的測定を記述する方法があります13,,14.病的損傷が起こるFFPE腎臓におけるあらゆる形態の細胞死から最高潮に達したecDNAの測定を記述する方法はない。これは、実験的治療が実際の標的器官の病的傷害部位からecDNAをクリアしているかどうかを判断するために重要である。
腎臓サンプルから複数の画像を取得すると、1人のユーザーによって一般的に分析される大量のデータが作成されます。これは、労力がかかり、時間がかかり、ユーザーの偏見のために、他のユーザーが信頼性の低い再現性を受ける可能性があります。トレーニング可能な Weka セグメンテーションは、機械学習アルゴリズム15,,16を使用してピクセルを分類するために最先端のバイオインフォマティクスツールを使用する ImageJ 用のオープンソースソフトウェアプラグインです。この方法は、ユーザーのピクセルのセグメントの分類から学習し、新しい学習した分類を他の画像に適用する「トレーニング可能」です。この方法は、特定の「クラス」に属するものとしてセグメント内の各ピクセルを「分類」するために使用される ImageJ プログラム内の一般的な分析ツールに依存します。プログラムが「分類子」を学習すると、同じ画像内の他の類似した分類セグメントを識別するために使用できます。このモデルは、同じ実験内の他の画像セットに保存され、適用されます。
腎臓切片におけるその場でのecDNAの決定に対する現在の障害は、ホルマリンにおける固定からの内因性自己蛍光と画像の労働集約的な分析である。ここでは、この自己蛍光を消し止め、ecDNAを検出し、ecDNAの高スループット測定のための教師付き機械学習を使用する方法について説明します。我々は、以前に、ImageJのマクロを用いてNETおよび細胞外MPO(ecMPO)の測定を公表し、今では、教師付き機械学習1を用いてこれらの方法の半自動化を実証する。同じ画像内でNETとecMPOの代替染色を分類するために、機械学習ツールの適応性を実証します。ecDNA、NETおよびecMPOを検出するためにここで説明するこれらの染色法は、ecDNA、NETSおよびecMPOが関節リウマチおよびルプス17,18,18などの永続的疾患において役割を果たす他の固体器官および疾患に翻訳することができる。

<table><tbody><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>SIGMA</td><td>A2153</td><td>5%および1%溶液はPBSで作られており、バルクで作成でき、解凍後に冷凍廃棄することができます。</td></tr><tr><td>チキン抗ヤギIgG(H+L)交差吸収抗体 Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21468</td><td>抗体カクテル中の遊離コンジュゲートを避けるために、使用前にミニ遠心分離機で1分間スピン</td></tr>してください <tr><td>チキン抗マウスIgG(H+L)交差吸収抗体、Alex Fluor 647</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-121468</td><td>抗体カクテル中の遊離コンジュゲートを避けるために、使用前にミニ遠心分離機で1分間スピン</td></tr>してください<tr><td>チキン抗ウサギIgG(H + L)交差吸収抗体アレクサフルーア488</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-21441</td><td>抗体カクテルの遊離コンジュゲートを避けるために、使用前にミニ遠心分離機で1分間スピン</td></tr>します <tr><td>チキンセラ</td>シ<td>グマ</td><td>C5405</td><td>1%BSA/PBS</td></tr><tr><td>カバースリップ24 x60 mm</td>で作られました <td>アゼルサイエンティフィック</td><td>ES0107222</td><td>#1.5 これは標準的な厚さではありません-共焦点顕微鏡</td></tr><tr><td>で使用するように設計されていますEDTA 10mM</td><td>SIGMA</td><td>E6758</td><td>TRISとEDTAを蒸留水とpHで一緒に添加し、抗原賦活化のために、10倍溶液</td></tr><tr><td>エタノール30%、70%、100%</td><td>Chem Supply</td><td>UN1170</td>として<td>供給 100%非変性エタノール-蒸留水</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド、4%(10%中性緩衝ホルマリン)</td><td>TRAJAN</td><td>NBF-500</td><td>を使用して30%および70%に希釈腎臓はRTで16時間ホルマリンの3mlを含む5mlのチューブに入れられます、ホルマリンはヒュームフードで使用する必要があります</td></tr><tr><td>ガラス組織学スライド-ウルトラスーパーフロスト、メンゼルグレーズ、25x75 x1.0mm</td><td>TRAJAN</td><td>J3800AM4</td><td>正に帯電したコーティングされたスライドを使用することが不可欠です。抗原賦活化ステップ中に組織がスライドから離れるため、スライドのコーティングにポリ-L-リジンを使用することはお勧めしません</td></tr><tr><td>ヤギ抗ヒト/マウスMPO抗体</td><td>R&D</td><td>AF3667</td><td>到着時にマイナス80度でアリコートと凍結</td></tr><tr><td>Histosol</td><td>Clini Pure</td><td>CPL HISTOSOL 08</td><td>200mlの染色ラック容器できちんと使用し、ヒュームフードで使用</td></tr><tr><td>疎水性ペン</td><td>VECTOR Labs</td><td>H-400</td><td>腎臓組織の周りに円を描くために使用</td></tr><tr><td>マウス抗ヒト/マウスペプチジルアルギナーゼ4(PAD4)</td><td>ABCAM</td><td>ab128086</td><td>到着時にマイナス80度でアリコートと凍結</td></tr><tr><td>ニコン C1 共焦点走査型レーザーヘッド ニコン Ti-E 倒立顕微鏡</td><td>コヒーレント サイエン</td><td></td>ティフィック <td>アリコートし、到着時にマイナス 80 度で凍結</td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水</td><td>SIGMA</td><td>P38135</td><td>0.01M PB/0.09% NaCl 一度に 5L をメイクアップ</td></tr><tr><td>圧力鍋 6L ティファール 5 ネオ ステンレス</td><td>ティファー</td>ル <td>GSA-P2530738</td><td>地元の家庭用品店</td></tr><tr><td>Prolong Gold DAPI</td> <td>で購入ライフテクノロジー</td><td>ズ P36962</td><td>カバースリップに直接滴を塗布</td></tr><tr><td>ウサギ抗ヒト/マウス ベータアクチン抗体</td><td>ABCAM</td><td>ab8227</td><td>到着時にマイナス80度で凍結</td></tr><tr><td>ウサギ抗ヒト/マウス H3Cit 抗体</td><td>ABCAM</td><td>ab5103</td><td>到着時にマイナス80度で凍結</td></tr><tr><td>染色ラック 24スライド</td><td>ProScitech</td><td>H4465</td><td>選択された染色ラックは、圧力下での沸騰と60度オーブンでのインキュベーションに耐えることができなければなりません</td></tr><tr><td>スーダンブラックB</td><td>シグマ</td><td>199664</td><td>0.3% 70%エタノールで1Lボトルに3gを追加し、ろ過し、室温で6ヶ月間光安定</td></tr>から保護します <tr><td>トリス10mM</td><td>SIGMA</td><td>T4661</td><td>蒸留水とpHでTRISとEDTAを一緒に加え、pHを9に設定します。 抗原賦活化のために、10倍溶液で作ることができます</td></tr><tr><td>キシレン</td><td>トラヤヌ</td><td>XL005/20</td><td>ヒュームフードで使用する必要があります</td></tr></tbody></table>

糸球体腎炎における細胞外dnaの半定量化のための教師付き機械学習

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

糸球体細胞死は、骨髄ペルオキシダーゼ抗好中球細胞質抗体関連血管炎(MPO-AAV)の病理学的特徴である。細胞外デオキシリボ核酸(ecDNA)は、アポトーシス、壊死、ネクロトーシス、好中球外細胞トラップ(NETs)およびピロトーシスを含む細胞死の異なる形態の間に放出される。この細胞死の測定は、細胞死の異なる生化学的形態を同定するために必要ないくつかの異なるバイオマーカーで時間がかかる。ecDNAの測定は、一般に、病的損傷が起こる実際の標的器官ではなく、腎損傷の代理として血清および尿において行われる。腎臓のecDNAを調査する上で現在の難しさは、実験的およびアーカイブされたヒト腎臓生検の両方でホルマリン固定パラフィン埋め込み組織(FFPE)の方法の欠如である。このプロトコルは、FFPE組織(ヒトとマウスの両方)でecDNAを染色し、自家蛍光をクエンチし、一般に公開されているオープンソースImageJプラグインのトレーニング可能なWekaセグメンテーションから機械学習ツールを使用して、結果の画像中のecDNAを測定するために必要なステップの概要を提供します。トレーニング可能な Weka セグメンテーションは、プログラムが ecDNA を分類することを学習する糸球体の中の ecDNA に適用されます。この分類器は、後に取得した腎臓画像に適用され、個々の画像の手動注釈の必要性を減らします。トレーニング可能なWekaセグメンテーションの適応性は、実験的なマウス抗MPO糸球体腎炎(GN)から腎臓組織においてさらに実証され、NETおよびecMPOを同定し、抗MPOGNに共通の病理学的寄与者である。この方法は、トレーニング可能なWekaセグメンテーションプログラムが健康な正常な腎臓組織と病気の腎臓組織との間でecDNAを区別できる有効性を明らかに示す腎臓組織におけるecDNAの客観的な分析を提供する。このプロトコルは、他の臓器のecDNA、NETおよびecMPOを同定するために容易に適応することができる。

これらの画像は、誘導抗MPO GNを有するマウスから蛍光染色されたFFPE腎臓組織におけるecDNAの労力集約的な手動測定を最小限に抑えるために、トレーニング可能なWekaセグメンテーションを正常に使用するために必要な複数のステップを表しています。これらの手順は、図1と図 2に、Weka セグメンテーション プログラムから直接撮影された画像と共に、分析プロセスのすべてのステップを概説したものです。この分析からの測定値は、プログラムが糸球体に堆積する異なる量のecDNAを、対照組織において、誘導抗MPO GNなしで決定する能力を示す図3に示される。図4は、ecDNAのモデルが、コントロール患者(最小変化疾患患者は組織学的レベルで明らかな最小限の糸球体損傷を有する)から腎臓生検検中のecDNAを同定するために適応し、MPO-AAV患者からの...

細胞死の間に放出される細胞外DNA(ecDNA)は炎症を誘発し、炎症に寄与する。傷害部位におけるecDNAの測定は、標的器官における治療の有効性を決定することができる。このプロトコルは、機械学習ツールを使用して腎臓組織のecDNAの測定を自動化する方法を説明します。

糸球体腎炎における細胞外DNAの半定量化のための教師付き機械学習

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

糸球体腎炎は、かなりの細胞死および細胞外DNA放出で病理学的糸球体損傷を引き起こす。このプロトコルは病理学的傷害の間に放出の場所で細胞外DNAの視覚化を可能にする。この技術の利点は、腎臓における細胞死から細胞外DNAを測定することです。血清または尿とは対照的に、細胞外DNA測定は病理学的損傷の代理マーカーである。この方法の意義は、細胞外DNA染色と画像解析の両方が、関節リウマチやルプスなどの他の自己免疫疾患に容易に転移できることである。この方法は腎臓の神学の基礎知識を必要とする。糸球体細胞外DNAを正確に検出するには、研究者が糸球体を正しく識別できる必要があります。細胞外DNA染色の場合、まず目的のサンプルを60°Cで摂氏60度で加熱してから、スライドをヒュームフードに40分間の溶媒の2回の変化に浸します。2回目の浸漬後、100%エタノールでサンプルを2回、1回の処理で5分間70%エタノールで1回再水和します。最後の処理の後、トングを使用して、10分間高い圧力鍋で沸騰抗原検索溶液にスライドを置きます。抗原エピトープのマスクを解除した後、圧力鍋を熱からシンクに移し、すぐに蓋の上に冷たい水道水を流します。スライドが抗原検索溶液で20分間平衡化してから、1回の洗浄で軌道シェーカー上の0.01モルPBSでサンプルを2回洗浄します。2回目の洗浄後、疎水性ペンを使用して腎臓組織サンプルの周りに円を描き、室温で30分間、5%ウシ血清アルブミンで10%チキン血清の60マイクロリットルで非特異的染色をブロックします。インキュベーションの終了時に、ブロッキング溶液を、摂氏4度で一晩湿度チャンバーに目的とする一次抗体の60マイクロリットルに慎重に交換します。翌朝、PBSの軌道シェーカーでスライドを1回2分間洗浄してから、適切なフルオロフォア共役二次抗体の60マイクロリットルを各スライドに加え、室温で40分間インキュベーションします。インキュベーションの終わりに、示されているようにPBSでスライドを洗浄し、続いて70%エタノール中の0.3%スーダンブラックで治療を行い、潜在的なホルマリン誘発自己蛍光を消し止める。30分後、蛇口でスライドを洗い流して沈殿物を取り除き、スライドをPBSに10分間浸して、スーダンの黒い沈殿物の形成を防ぎます。インキュベーションの最後に、DAPIを補った3つの60マイクロリットルの取り付け溶液でスライドをコンフォーカルガラスカバーリップに取り付け、カバーリップをマニキュアで密封します。スライドを室温で24時間硬化させます。標準プロトコルに従って共焦点レーザー走査顕微鏡法によって画像化まで光から保護された4°Cで保存します。イメージング中の動きを防ぎ、エタノールのカバーリップを洗浄してイメージング解像度を高めるために、マニキュアでカバーリップを密封してください。スライドあたり20のグロメルリをイメージングした後、ImageJでトレーニング可能なWekaセグメンテーションプラグインを開き、ImageJツールバーに最初の画像をドロップします。画像、色、分割チャンネルをクリックします。一次抗体染色を示す画像が現れます。単一の画像のマージファイルを作成するには、カラーをクリックしてチャンネルを結合します。各チャンネルに色を割り当てるように求めるポップアップボックスが表示されます。[合成を作成]ボックスをオンにし、[ソースイメージを保持]ボックスをオンにして、[OK]をクリックします。合成画像が合成されます。一次抗体染色をガイドとして使用し、糸球体房の周りに関心領域を描く。単一の青色の DAPI イメージにガウス ブラーを実行するには、プロセス、フィルター、およびガウス ブラーをクリックします。ぼかしを1~2に設定します。画像は少しぼやけますが、核は滑らかに表示され、背景は柔らかくなります。次に、プラグイン、セグメンテーション、およびトレーニング可能なWekaセグメンテーションをクリックし、フリーハンドツールを使用して無傷の核をトレースします。対象となるすべての核が追加されたら、クラス 1 ボックスを追加し、ライン ツールを使用して、バックグラウンド領域をクラス 2 ボックスに示します。[新しいクラスを作成]をクリックし、ラインツールを使用してDAPI染色された核外DNAの概要を説明します。[列車分類器]をクリックして、確率を取得します。マウスを切り替えて、選択オブジェクトが白でハイライト表示されたすべてのコンポーネントの白黒画像を取得します。この画像を複製するには、[画像] をクリックして複製します。[画像] で調整し、しきい値を設定します。マウスボタンを使用して、細胞外DNAのみが観察されるまでしきい値を調整します。しきい値を設定した後、プロセス、バイナリ、バイナリを作成をクリックし、以前に生成された関心のある糸球体領域をコピーします。Ctrl Shift E キーを押して、編集、選択、復元を選択して選択を復元します。糸球体内の細胞外DNA粒子のみを測定するには、「粒子を分析」をクリックしてOK。細胞外DNAを含む糸球体の粒子数、面積、平均画素、およびパーセンテージを示す結果シートが生成される。分類子を細胞外 DNA 分類子として保存するには、[分類器を保存] をクリックしてデータを保存します。モデルを後続のイメージに再適用するには、ロード分類器と保存済み分類子ファイルを選択する前に、示されているように初期イメージ処理を繰り返します。ログメニューがポップアップしてモデルが実行されます。モデルが実行されたら、[データのロード] をクリックし、セルラーDNA.arff外を選択します。次に、[結果の作成] をクリックします。結果として得られた画像がすべての核、背景、または細胞外DNAを拾うことができなかった場合は、分類器を再訓練をクリックし、必要に応じて分類器を追加します。ここで、代表的なDNAおよびβアクチン染色を示す単一チャネル画像が示されている。2つの画像をマージすると、トレーニング可能なWekaセグメンテーションを使用して、マウス腎臓糸球体内の細胞外DNAを測定するために糸球体領域の周りに関心のある領域を描くことができる。このモデルは、コントロール患者から腎臓生検検体中の細胞外DNAを同定したり、骨髄ペルオキシダーゼANCA関連血管炎患者の腎臓生検と比較するために採用することができる。さらに、このプログラムは、腎臓組織サンプル内の他の染色に翻訳することができ、例えば、好中球外細胞トラップの染色およびANCA関連血管炎における細胞外骨髄ペルオキシダーゼの沈着に。重要なのは、複数のユーザーが同じデータを分析する場合、有意な差は見られないことです。解析の最も重要なステップは、Wekaセグメンテーションプログラムの分類者として糸球体を持つ背景、核、および細胞外DNAの十分な例を提供することです。この方法は簡単に譲渡可能です。例えば、異なるタイプの細胞死のさらなる分析は、アポトーシスまたは壊死に対するマーカーに対する特定の抗体の染色を通じて調べることができる。我々の技術は、自己免疫腎疾患におけるTLR発現の評価やヒト腎臓生検における細胞外骨髄ペルオキシダーゼ発現などの他の炎症プロセスと共に使用することができる。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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