昆虫の臨界熱限界のハイスループットアッセイ

熱制限は、急速な気候変動に直面した場合に貴重な情報である生物が許容する環境を予測することができます。ここでは、昆虫の重要な熱ミニマと熱ノックダウン時間を評価するためのハイスループットプロトコルを説明します。両方のプロトコルは、スループットを最大化し、アッセイのコストを最小限に抑えます。

熱耐性は、種の分布と気候変動への対応の重要な要素です。ここでは、小さな昆虫の熱と耐寒性を迅速に評価する方法を提供します。耐寒性を測定するためのこれらの方法は、臨界熱最小および熱耐熱を介して、熱ノックダウン時間を介して、高スループット、半自動化され、最小限の機器を必要とする。

手順を実証することは、私の研究室のポスドクであるデビッド・アウデです。臨界熱最小アッセイを設定するには、温度制御された流体浴に電源を入れ、再生ボタンを押してプログラムを実行し、浴の温度を25°Cに上げて維持します。5~10分待って、流体浴室の柱が摂氏25度に達するまで、カラム上部のプラグを直径5.08センチメートルのフィルターに交換します。

約40ハエを漏斗を通して列に入れ、ハエが逃げないように気をつけて、漏斗をプラグに素早く交換します。その後、ハエが落ち着くことを許可します。時折、ハエが登ることを奨励するために底のプラグをタップします。

5分後、流体浴ゲインの開始ボタンを押して、臨界熱小量ランププログラムを開始します。コンピュータでサーマルカップル記録ソフトウェアを開き、記録をクリックして、アッセイの持続時間を毎秒、カラム内の温度記録を開始します。各温度記録に 2 番目のタイムスタンプが含まれていることを確認し、後で Dsosophila じょうごモニターのデータと温度データをマージできるようにします。

90%エタノールの5ミリリットルを15ミリリットルの円錐遠心管に加え、チューブをカラムの下のラックに入れる。時折、柱の下部プラグをタップして、下のハエを誘惑して登ります。ハエのほとんどは止まり木の上か、15°Cの柱の頂上付近にあります。

摂氏15度で、ショウジョウバエ漏斗モニターに75ミリメートルの外径ガラス漏斗を入れます。底部のプラグを取り外し、エタノールのプラグにハエを引き続き集めます。レトルトリング、じょうごモニター、漏斗を調整して、カラムの下に表示します。

漏斗の唇が柱の底を完全に密封し、漏斗の底を15ミリリットルのコレクションチューブに挿入することを確認してください。ショウジョウバエの漏斗モニターソフトウェアを開きます。ソフトウェアはすぐにハエが彼らの重要な熱ミニマに達する時刻と日付の記録を開始します。

彼らの重要な熱ミニマに達するハエは、神経筋機能を失い、ショウジョウバエ漏斗モニターを介して、彼らの止まり木から落ちる。すべてのハエが重要な熱ミニマに達しているかどうかを監視するには、温度が下がるにつれて、上部プラグと止まり木をチェックして、ハエがまだ止まっているかどうかを確認します。すべてのハエがクリティカルな熱ミニマに達したら、ショウジョウバエの漏斗モニターを動かし、カラムの開口部から離します。

まれに、ハエは重大な熱小マに達するかもしれませんが、柱に立ち往生したままです。これらのハエを削除するには、上部のプラグを開きます。高スループットの熱を設定するには、アスピレーターと中隔蓋を使用して、個々の二酸化炭素鎮静ハエを、修正された96ウェル底板の各ウェルにロードし、明確なタイトフィット蓋でプレートを密封します。

その後、食べ物の供給の上にプレートを置き、ハエが少なくとも48時間96ウェルプレートに順応できるようにします。アッセイの日に、インキュベーターを摂氏37.5度に設定し、30分後にフライカルチャープレートをトレイの底に白い紙に対してプレートの底を置いてインキュベーターに入れます。トレイとウェブカメラのフレームのウェル列と行の名前の向きを確認し、色付きのテープをプレートの側面とエッジに沿って配置して、方向を確認します。

プレートが配置されたら、インキュベータードアを閉じ、ビデオ録画ソフトウェアの[録画]をクリックします。2時間後、すべてのハエが最後の休息場所に到達し、動きを停止したかどうかを確認するために録音をチェックしてください。すべてのハエが動かなくなったら、停止してハエを処分します。

ビデオファイルを開き、各井戸の各フライのノックダウン時間を記録します。試験と観測の間のダウンタイムを打ち切った熱の最も一貫した尺度は、ハエが最終的な休息場所に到達する時間です。その後、単一の井戸に焦点を当て、フライが最初に最後の休息場所から移動する時間に注目して、逆にビデオを追跡します。

各フライの最終的な休息時間を決定することは困難な場合があります。正確な分析を行うためには、時間をかけて、それぞれを個別に観察することが重要です。この代表的な分析では、ショウジョウバエ遺伝基準パネルラインからの雌は、DGRP線714からのメスよりも平均熱ミニマ温度が有意に低かった。

さらに、熱は摂氏37.5度でノックダウン時間、73と461 DGRPラインから女性の間で有意に異なる。軽微な変更により、この方法は、ノックダウン時間を測定するために、チル昏睡回復時間または臨界熱最大量などの他の熱耐性特性を測定するために使用することができる。研究者の実践的な時間を大幅に短縮することにより、これらの方法は、これまで不可能であったスケールで遺伝的変異および熱耐性形質の探査を可能にしました。