インビトロにおけるマウス胚性幹細胞からの神経細胞分化

マウスアッセイからのニューロン分化は、ニューロン新生に関与する主要なメカニズムを説明するための優れたモデルです。私たちは、企業のトロスクリーニング戦略を使用して、胚様神経新生の最適化された方法を示します。この手法は、高効率、低コスト、操作の容易さという利点があり、実験室での普及に適しています。

これは、神経科学研究のための強力なツールです。プロトコル1を使用して分化を行うには、2ミリリットルの基礎分化培地に20,000個のマウス胚様幹細胞を0.1%ゼラチンコーティングされた6ウェルプレートの各ウェルに播種します。細胞接着後、細胞を2ミリリットルのPBSで洗浄し、各ウェルに2ミリリットルの基礎分化培地を加えてから、細胞をインキュベーターに戻します。

細胞を8日間分化させ、2日ごとに培地を交換します。プロトコル2を実行するには、150万個のマウス胚様幹細胞を10ミリリットルの基礎分化培地中の非接着性細菌皿に加え、プレートを摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートして胚様体形成を可能にします。2日後、細胞凝集体を15ミリリットルの遠心分離管に移し、重力によって沈殿させます。

上清を取り除き、10ミリリットルの新鮮な基礎分化培地を追加して、胚様体を再懸濁します。次に、それらを新しい非粘着性皿に植え直し、さらに2日間インキュベートします。ウェルあたり2ミリリットルの基礎分化培地に約50個の胚様体を収集し、ゼラチンでコーティングされた6ウェルプレートに播種します。

レチノイン酸誘導では、各ウェルに2マイクロリットルのRAストックを添加し、最終濃度を1マイクロモルにします。プレートをインキュベーターに戻し、さらに4日間細胞を分化させます。プロトコル3を使用して分化を行うには、プロトコル2を繰り返しますが、胚体形成には2日、RA導入には6日しか許可しないでください。

胚様体形成の品質管理は、顕微鏡を用いて実施すべきである。明るいコアを持つものだけが、後続のプロセスでうまく区別できます。プロトコル4のために、ゼラチンで塗られた版に井戸ごとの20、000のマウス胚性幹細胞を播種し、プロトコル1に従う。

細胞を4日間分化させた後、各ウェルに全トランスRAストックを2マイクロリットル加え、さらに4日間プレートをインキュベートします。プロトコール5を実行するには、プロトコール4を繰り返しますが、分化のわずか2日後にRA導入を開始します。プロトコル6では、150万個の幹細胞を10ミリリットルのN2B27培地2の非接着性細菌皿に植え付け、プレートを摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートして胚様体の形成を可能にします。

2日後、前述のように細胞凝集体を採取し、10ミリリットルの新鮮なN2B27培地2で胚体を再懸濁します。それらを新しい非粘着性の細菌皿に植え直し、さらに2日間分化させます。4日目に、ウェルあたり約50個の胚様体を収集し、ゼラチンでコーティングされた6つのウェルプレートに2ミリリットルのN2B27培地2を充填します。

すべてのトランスRAストックを2マイクロリットルずつ各ウェルに加え、さらに4日間分化を誘導します。プロトコル7を実行するには、ゼラチン被覆プレート上にウェルあたり2ミリリットルの基礎分化培地に約20,000個の細胞を播種します。細胞を接着し、PBSで2回洗浄した後、各ウェルに2ミリリットルのN2B7培地を2個ずつ加え、細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%で8日間分化させます。

プロトコル3を使用してフェーズ1の分化を行った後、0.1%ゼラチンコーティングされたプレートにウェルあたり2ミリリットルの基礎分化培地に約500,000マウス胚性幹細胞誘導体を播種します。誘導体をランダムに3つのグループに分けて、3つのフェーズ、2つの分化プロトコルをテストします。プレートを6時間インキュベートした後、細胞を2ミリリットルのPBSで2回洗浄し、プロトコールに応じて、2ミリリットルの基礎分化培地N2B27培地1またはN2B27培地2を各ウェルに加えます。

ブレードをインキュベーターに入れ、細胞をさらに10日間分化させ、対応する培地を2日ごとに交換します。一般的な前駆細胞またはNPCにおけるマウス胚性幹細胞の分化に最適なプロトコルを決定するために、7つのプロトコルが試験されました。プロトコールは、A2loxロックスと129細胞の両方で試験され、各グループの分化状態を光学顕微鏡を用いてモニターしました。

ほとんどのA2loxおよび129誘導体は、NPCの形成を示すプロトコル3の下で、よく積み重なった神経突起様の形態を示しました。しかし、プロトコル2を用いて分化した細胞は、胚様体内の栄養素の不足によるものであってもよいアポトーシスが現れた。NPCの形成をさらに確認するために、ネスチン陽性細胞を免疫蛍光アッセイを用いて検出した。

プロトコル3は、ネスチン陽性細胞の最高の割合をもたらし、A2loxおよび129誘導体でそれぞれ最大78および69%に達しました。NPCのニューロンへの分化について、3つのプロトコルがテストされました。プロトコル3が最も効果的に分化を誘導すると判断されました。

フェーズ2プロトコル3のほとんどのA2loxおよび129誘導体は、明確な神経突起と細胞体の伸長を伴う長期のニューロン様構造を持っていました。免疫蛍光アッセイはさらに、プロトコル3を使用して、βチューブリン3陽性細胞の割合がA2loxおよび129誘導体でそれぞれ最大68および59%のニューロンの生成を確認しました。この手順を試みるときは、分化する前にマウスアッセイが健康で未分化であることを確認することが重要です。

さらに、厳密な品質管理は穴あけボディの形成の後でそして段階2の分化の前に遂行されるべきである。この手法は、神経生物学や発生生物学の研究者に標準的なモデルを提供し、神経新生に関与する主要なメカニズムを説明するための強力なツールになると期待されています。