Name: インビトロにおけるマウス胚性幹細胞からの神経細胞分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 学ぶマウス胚性幹細胞からの神経細胞分化法。ネスチン陽性前駆細胞78%、β-チューブリンIII陽性ニューロン68%の高効率を達成。神経発生メカニズム研究の標準ツールとして広く活用可能です。

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この研究は、中国国立自然科学財団(No. 31501099)と中国湖北省教育部の中高年と若者(No.Q20191104)。そして、武漢科学技術大学のウェンシェン・デン教授が、マウス胚性幹細胞株A2loxを提供してくれたことに感謝します。

1. マウス胚性幹細胞培養
<ol><li>0.1%ゼラチンコーティングされた細胞培養皿またはプレートを準備します。<ol>
<li>滅菌した0.1%のゼラチン(水中0.1%w/v)を60mm細胞培養皿に2mL加えます。細胞培養皿のコーティングを確実にするために、穏やかにロックします。</li>
		<li>37°Cで5%CO2インキュベーターに皿を入れ、1時間コーティングを行います。</li>
		<li>細胞を播種する前に0.1%ゼラチン溶液を取り除きます。 注:ゼラチンを取り除いた後、コーティングされた皿を乾燥または洗浄する必要はありません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マウス胚性幹細胞(A2loxおよび129)培養<ol>
<li>0.1%のゼラチン中のインキュベートメベック(A2loxおよび129)細胞は、それぞれ5%CO2インキュベーターで37°CのmESC成長培地で60mmの細胞培養皿をコーティングした。MESC成長培地は、85%ノックアウトDMEM/F12、15%ノックアウト血清置換(KSR)、0.1 mM βメルカプトエタノール(2ME)、2 mMグルタマックス、2 mMグルタマックスで構成されています。 1%非必須アミノ酸(NEAA)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)、1000 U/mL白血病阻害因子(LIF)、10 nM CHIR-99021(GSK-3阻害剤)および0.33 nM PD0325901(MEK阻害剤)。 注意:β-メルカプトエタノールは可燃性であり、吸入毒性を有する。火災源から離れ、使用時の吸入を避けるためにマスクを着用してください。</li>
		<li>A2loxおよび129のより良い成長のために毎日mESC成長培地を変更してください。</li>
		<li>細胞が80%合流に達したら、培地を取り除き、0.1%のトリプシンを1 mL加えます。すべての細胞にトリプシンのカバーを確実にするために30 sのために穏やかに揺れる。</li>
		<li>トリプシンを化し、1 mLピペットを使用してトリプシンを除去するために約1分間細胞を残します。</li>
		<li>2 mLのmESC成長培地を皿に加え、ピペットを数回上下に加えて、単一の細胞懸濁液を作ります。</li>
		<li>ヘモサイトメーターを使用して、懸濁液中の細胞の密度をできるだけ正確にカウントします。</li>
		<li>セルを7つのグループに分け、 表1に示す異なるプロトコルを使用して分化を誘導する。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. mESC から NPC への分化 (フェーズ I)
<ol><li>0.1%ゼラチンコーティングされた細胞培養プレートまたはカバーリップを調製します。<ol>
<li>使用前に、ステップ1.1のように0.1%ゼラチンコーティング6ウェルプレートまたはカバーリップを調製します。</li>
	</ol></li>
	<li>プロトコル 1 を使用したフェーズ I の分化 (表 1)<ol>
<li>0.1%ゼラチンコーティング6ウェルプレートの1ウェルあたり2 mLの基底分化培地Iで約2 x 104 mESCsをシード。顕微鏡で細胞密度を確認します。</li>
		<li>5%CO2インキュベーターで37°Cの細胞を6時間インキュベーターでインキュベートし、取り付けができるようにします。</li>
		<li>付着後、培養器から細胞を取り出し、2mLのPBSで細胞を2回洗浄する。</li>
		<li>各ウェルに2mLの基底分化培地I(表1)を加え、細胞をインキュベーターに戻します。</li>
		<li>8日間分化のために細胞を残します。2日ごとに基礎分化培地Iを交換してください。</li>
	</ol></li>
	<li>プロトコル 2 を使用したフェーズ I の分化 (表 1)<ol>
<li>1.5 x 106 mESCsを10 mLの基底分化培地Iの非粘着性細菌皿に加え、5%CO2インキュベーターで37°Cで胚体形成を可能にする。</li>
		<li>2日後、細胞凝集体を15 mL遠心管に移し、重力で落ち着かせる。</li>
		<li>上清を取り除き、10mLの新鮮な基底分化培地Iを加え、胚体を再懸濁させる。新しい非粘着性細菌皿にそれらを植え替え、さらに2日間分化を可能にする。</li>
		<li>顕微鏡下での胚体の形成を確認する(図2A)。</li>
		<li>ステップ 2.3.2-2.3.3 で説明されているように、胚体を収集します。2 mLの基底分化培地で約50個の胚体を0.1%ゼラチンコーティング6ウェルプレートに播種する。</li>
		<li>1 mMオールトランスRAストック(DMSO)を準備し、サブパッケージング後に-80°Cの冷凍庫で光から離れて保管します。 注意:RAは不安定であり、RAストックの準備中に光から遠ざけ、空気接触を減らすことに注意する必要があります。</li>
		<li>RA誘導の場合は、各ウェルに2μLのRAストックを加えて、1μMの最終濃度を作ります。</li>
		<li>プレートを37°Cの5%CO2 インキュベーターに入れ、さらに4日間分化します。</li>
		<li>2日ごとに、基底分化培地I(1μM RA)全体を2 mL変更します。</li>
	</ol></li>
	<li>プロトコル 3 を使用したフェーズ I の分化 (表 1)<ol>
<li>10 mLの基底分化培地I.の非粘着性細菌皿に1.5 x 106 mESCsを植え付け、5%CO2インキュベーターで37°Cで胚体形成のために2日間放置します。</li>
		<li>顕微鏡下での胚体の形成を確認する(図2B)。</li>
		<li>細胞凝集体を15 mL遠心管に移し、重力で落ち着かせる。</li>
		<li>上清を慎重に取り出し、10mLの新鮮な基底分化培地を加え、再中断します。</li>
		<li>約50個の胚体を2mLの基底分化培地に播種し、0.1%ゼラチンコーティングされた6ウェルプレート上に十分に塗布した。</li>
		<li>RA誘導の場合は、各ウェルに2μLのRAストックを加えて、1μMの最終濃度を作ります。</li>
		<li>プレートを37°Cの5%CO2 インキュベーターに入れ、さらに6日間分化します。2日ごとに基礎分化培地I(1μM RA)全体を変更します。</li>
	</ol></li>
	<li>プロトコル 4 を使用したフェーズ I の分化 (表 1)<ol>
<li>シード約 2 x 104 mESCs 基礎分化培地の 2 mL 内で 0.1% ゼラチンコーティング 6 ウェルプレートにウェルあたり.プレートを37°Cの5%CO2 インキュベーターに入れ、6時間取り付けます。</li>
		<li>取り付け後、2 mLのPBSで細胞を2回洗浄します。各ウェルに2mLの基底分化培地Iを加え、37°Cの5%CO2インキュベーターで4日間分化を可能にする。</li>
		<li>RA誘導の場合、2μLの全トランスRAストックを各ウェル(作業濃度は1μM)に加えて、さらに4日間分化を誘導します。</li>
		<li>全体のプロセスでは、2日ごとに媒体全体を交換してください。</li>
	</ol></li>
	<li>プロトコル 5 を使用したフェーズ I の分化 (表 1)<ol>
<li>シード約 2 x 104 mESCs 基礎分化培地の 2 mL 内で 0.1% ゼラチンコーティング 6 ウェルプレートにウェルあたり.プレートを37°Cの5%CO2 インキュベーターに入れ、6時間取り付けます。</li>
		<li>2 mLのPBSで細胞を2回洗います。各ウェルに2mLの基底分化培地Iを加え、37°Cの5%CO2インキュベーターで2日間分化を可能にする。</li>
		<li>その後のRA誘導では、各ウェルに2μLのRAストックを加えて1μMの最終濃度を作り、プレートを37°Cの5%CO2 インキュベーターに入れ、さらに6日間分化を誘発します。</li>
		<li>全体のプロセスでは、2日ごとに媒体全体を交換してください。</li>
	</ol></li>
	<li>プロトコル 6 を使用したフェーズ I の分化 (表 1)<ol>
<li>N2B27培地IIの10mLに非粘着性細菌皿に1.5 x 10 6 mESCsを植物1.5 x 106 mESC(表1)胚体形成を可能にする。</li>
		<li>2日目 に、ステップ2.3.2-2.3.3に記載されているように細胞凝集体を収集し、新鮮なN2B27培地IIの10 mLを使用して胚体を再中断する。</li>
		<li>それらを新しい非粘着性の細菌皿に再植え、37°Cの5%CO2インキュベーターでさらに2日間分化を可能にする。 顕微鏡下で胚体の形成を確認してください。</li>
		<li>4日目 に、胚の体を収集します。種子は、N2B27培地IIの2 mLで0.1%ゼラチンコーティング6ウェルプレート上にウェルあたり約50胚体。</li>
		<li>各ウェルに2μLの全トランスRAストックを加え、さらに4日間分化を誘導します。2日ごとに媒体全体(N2B27培地IIを1μM RA)に交換してください。</li>
	</ol></li>
	<li>プロトコル 7 を使用したフェーズ I の分化 (表 1)<ol>
<li>シード約 2 x 104 mESCs 基礎分化培地の 2 mL 内で 0.1% ゼラチンコーティング 6 ウェルプレートにウェルあたり.プレートを37°Cの5%CO2 インキュベーターに入れ、6時間取り付けます。</li>
		<li>PBSで細胞を2回洗います。次いで、各ウェルに2mLのN2B27培地IIを加え、5%CO2インキュベーターで37°Cで8日間分化を可能にする。</li>
		<li>N2B27培地II全体を2日ごとに変更します。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 細胞形態観察
<ol><li>反転位相コントラスト光顕微鏡下で、上記7群の分化状況を毎日確認する。</li>
	<li>ランダムに少なくとも12のフィールドを選択し、D8上の各グループの形態変化を記録するために写真を撮ります。</li>
</ol>4. 免疫蛍光染色
<ol><li>サンプル調製:0.1%ゼラチンコーティングカバーリップにmESCsをシードし、ステップ2で述べたプロトコルを使用して8日間分化を可能にします。</li>
	<li>すいす:8日目 に、培養器からサンプルを取り出し、吸引によって分化培地を取り除きます。1 mLのPBSで細胞を5分間穏やかにすすいだ。</li>
	<li>固定:各サンプルに4%パラホルムアルデヒドの1 mLを加え、室温(RT)で20分間細胞を固定します。</li>
	<li>すすい: 固定後、1 mLのPBSで細胞を3回、それぞれ5分間静かにすすいだ。</li>
	<li>透過:各サンプルにPBSに0.2%TritonX-100の1 mLを加え、RTで8分間放置します。</li>
	<li>すすい: 透過後、1 mLのPBSで細胞を3回、それぞれ5分間静かにすすいだ。</li>
	<li>ブロッキング:各サンプルにPBSに10%のヤギ血清1mLを加え、RTで1時間インキュベートして非特異的な相互作用を遮断します。</li>
	<li>一次抗体によるインキュベーション<ol>
<li>PBSで5%のヤギ血清を使用して、抗ネスチン抗体を1:100の比率で希釈します。</li>
		<li>希釈した抗体を500μL異なるサンプルに塗布し、4°Cで一晩インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>すいす: 抗体を取り除き、1 mLのPBSを3回ずつ8分間静かにすすいます。</li>
	<li>二次抗体によるインキュベーション<ol>
<li>PBSで5%のヤギ血清を使用して1:500の比率でアレクサフルオール488標識ヤギ抗マウスIgGを希釈します。</li>
		<li>希釈した抗体を500 μL異なるサンプルに塗布し、RTで2時間暗くインキュベートします。 注:蛍光二次抗体を適用した後、暗闇の中ですべての後続のステップを実行して、蛍光消光を防ぎます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>すいす: 二次抗体を取り出し、1 mLのPBSをそれぞれ8分間3回静かにすすいます。</li>
	<li>核染色および実装<ol>
<li>DAPI取り付け媒体を1滴ずつクリーンなマイクロスライドに置きます。</li>
		<li>プレートからサンプルを慎重に取り出し、セルを下にしてDAPI取り付け媒体の上にサンプルを置きます。RTで5分間暗闇の中に置いておきます。</li>
		<li>吸収性紙で余分なDAPI取り付け媒体を取り除きます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>蛍光顕微鏡観察<ol>
<li>蛍光顕微鏡下に標本を置き、適切なフィルターを使用してDAPIおよびAlexa Fluor 488の信号を検出します。</li>
		<li>各サンプルに対して 10 ~ 15 種類の異なるビジュアル フィールドを均等に選択し、CCD カメラで画像を記録します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. NPCからニューロンへの分化(第II相)
<ol><li>最も高い分化効率を持つステップ2.4で詳述されているように、プロトコル3(8日間、 表1)を使用してフェーズIの分化の下でmESC誘導体を準備する( 図3を参照)。 注:フェーズIの分化後、健康で高収率のNPCを確保するために、上記の細胞形態観察および免疫蛍光アッセイを使用して品質管理を行う必要があります。</li>
	<li>種子約5 x 105 mESC誘導体を、0.1%ゼラチンコーティング6ウェルプレート上に十分に当たり基礎分化培地Iの2 mL以内に含む。mESC誘導体を、それぞれフェーズIIプロトコル1、プロトコル2、プロトコル3として3つのグループにランダムに分割する。</li>
	<li>プレートを37°Cの5%CO2 インキュベーターに入れ、6時間取り付けます。2 mLのPBSで2回洗います。</li>
	<li>2 mLの基底分化培地I,N2B27培地I及びN2B27培地II(表2)をそれぞれ、上記群の各ウェルに加える。</li>
	<li>プレートをインキュベーターに入れ、さらに10日間分化します。対応する媒体を2日ごとに変更します。</li>
	<li>分化の状態を確認し、手順 3 で述べたように形態学的変化を記録します。</li>
	<li>18日目に、ニューロンの生成(β-tubulin III陽性)を評価し、ステップ4で使用する3つのプロトコルの分化効率を決定する。</li>
</ol>

<ol><li>Vieira, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+differentiation+into+mature+neurons%3A+mechanisms+of+regulation+and+biotechnological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications.</a> Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).</li>
<li>Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+embryonic+stem+cells+on+Parkinson%27s+disease+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Genomic+Medicine%2C+Biomarkers%2C+and+Health+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of embryonic stem cells on Parkinson's disease therapy.</a> Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).</li>
<li>Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+as+an+in+vitro+tool+for+the+study+of+the+expression+patterns+of+the+neuronal+cytoskeleton+during+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 439 (1), 154-159 (2013).</li>
<li>Khramtsova, E. A., Mezhevikina, L. M., Fesenko, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+modified+by+the+Neural+Growth+Factor+%28NGF%29+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells modified by the Neural Growth Factor (NGF) gene.</a> Biology Bulletin. 45 (3), 219-225 (2018).</li>
<li>Yoshimatsu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+efficacy+of+small+molecules+for+neural+differentiation+of+common+marmoset+ESCs+and+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs.</a> Neuroscience research. , (2019).</li>
<li>Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+matrix+microenvironment+for+targeted+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+neural+and+glial+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages.</a> Biomaterials. 34, 5995-6007 (2013).</li>
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<li>Ohnuki, Y., Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+hanging+drop+culture+conditions+on+embryoid+body+formation+and+neuronal+cell+differentiation+using+mouse+embryonic+stem+cells%3A+Optimization+of+culture+conditions+for+the+formation+of+well-controlled+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Effects of hanging drop culture conditions on embryoid body formation and neuronal cell differentiation using mouse embryonic stem cells: Optimization of culture conditions for the formation of well-controlled embryoid bodies.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (5), 571-574 (2013).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

本研究では、低コストで容易に得られる物質を用いて、mESCからの神経細胞分化の簡便かつ効果的な方法を確立した。この方法では、2日間の胚体形成後に6日間のRA誘導が行われ、MESCsのNPCへの分化を効果的に促進することができる(フェーズI-プロトコル3)。第II相分化のために、N2B27培地II(フェーズII-プロトコル3)は、NPCからニューロンへの分化を最も効果的に誘導する。成功を確実にするためには、いくつかの重要なステップにもっと注意を払う必要があります。
第一に、胚体の健全な状態は、全分化プロセスの鍵である。三次元胚体形成は、通常、ESC8の分化を指示するために使用される。本研究では、胚体の適切な懸濁培養時間を調べた。 図2に示すように、この状態で2日間の懸濁培養後に明るいコアを有する円形胚体が形成された。しかし、4日間培養すると、多くの胚体が互いに付着し、かつコアが暗くなり、コア中の細胞のアポトーシスを示す。その後の分化により、長期の胚体形成の悪化効果がさらに確認さ...

胚性幹細胞(ESC)は多能性であり、神経前駆細胞(NPC)に分化し、その後、特定の条件下でニューロンに分化することができる1。ESCベースの神経新生は、神経新生を模倣するための最良のプラットフォームを提供し、したがって、発生生物学研究のための有用なツールとして機能し、潜在的に再生医療2、3を支援する。過去数十年の間に、トランスジェニック法4のような胚性神経新生を誘導するための多くの戦略が報告されている、小分子5を用いて、3Dマトリックス微小環境6を用いて、および共培養技術7を用いた。しかし、これらのプロトコルのほとんどは、条件が制限されているか、操作が困難であるため、ほとんどの研究室での使用には適していません。
mESCからの効率的な神経分化を達成するために、操作が容易で低コストの方法を見つけるために、ここで組み合わせスクリーニング戦略を使用しました。図1に記載されているように、胚性神経新生の全過程を2相に分けた。フェーズIはmESCからNPCへの分化プロセスを指し、第II相はNPCからニューロンへのその後の分化に関連する。容易な操作、低コスト、容易に利用できる材料および高い分化効率の原則に基づいて、フェーズIの7つのプロトコルおよびフェーズIIの3つのプロトコルは、伝統的な付着単層培養システムまたは胚体形成システム8、9に基づいて選択された。両相におけるプロトコルの分化効率を、細胞形態観察および免疫蛍光アッセイを用いて評価した。各フェーズの最も効率的なプロトコルを組み合わせることで、mESCからの神経分化のための最適化された方法を確立しました。

<table><tbody><tr><td>抗ネスチン抗体 [Rat-401]</td><td>Abcam</td><td>Ab11306</td> を <td>-80 °C で保存。C、凍結と解凍の繰り返しを避ける</td></tr><tr>抗β;--80°Cで保存されたウサギ<td>Sigma Aldrich</td><td>T2200</td><td>で産生されたTubulin III抗体</td><td>;C、-</td></tr><tr>20°Cで保存された<td>Alexa Fluor 488標識ヤギ抗マウスIgG</td><td>Beyotime</td><td>A0428</td>の繰り返しの凍結と解凍を避けてください<td>。Cおよび軽い</td></tr><tr><td>B-27サプリメント(50X)から保護する、無血清の</td><td>Gibco</td><td></td><td>17504044-20°Cで保存されます。C、および光</td></tr><tr><td>CHIR-99021(CT99021)</td><td>Selleck</td><td>S1263</td>を<td>-20°Cで保管から保護します。C</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>NEST 801007</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cy3 標識ヤギ抗ウサギ IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0516</td> -<td>20 °C で保管。Cおよび光から保護する</td></tr><tr><td>DME / F-12 1:1(1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30023.01B</td>は<td>4°Cで保管されています。C</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>HyClone</td><td>SH30084.03</td><td>を -20 °C;C、凍結と解凍の繰り返しを避ける</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>Gibco</td><td>CM0635B</td><td>室温で保存</td></tr>されています <tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>4 °Cで保存されています。C</td></tr><tr><td>Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer</td><td>Beyotime</td><td>P0103</td> 4 <td>°C;C</td></tr><tr><td>ノックアウト DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12660012</td><td>4 °C で保管されています。C</td></tr><tr><td>ノックアウト血清交換</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>-20 °C で保存されています。C、</td></tr><tr>-20°Cで保存された<td>白血病抑制因子ヒト</td><td>シグマ</td><td>L5283</td>の凍結と融解の繰り返しを避けてください<td>。</td></tr><tr><td>C 埋込剤 DAPI付き - 水性フルオロシールド</td><td></td><td>Abcam ab104139</td> 4<td>°C;Cおよび光から保護する</td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td>4 °C;C</td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>-20 °C;Cと光から保護する</td></tr><tr><td>ノーマルヤギ血清</td><td>ジャクソン</td><td>005-000-121</td> -<td>20°Cで保管;C</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>4 °C で保存されています。C</td></tr><tr><td>非粘着性バクテリアディッシュ</td><td>Corning</td><td>3262</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (1X)</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01B</td><td>4 °C;C</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン溶液</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>4 °C で保存します。C</td></tr><tr><td>PD0325901(ミルダメチニブ)</td><td>セレック</td><td>S1036</td>を<td>-20°Cで保存。C</td></tr><tr><td>レチノイン酸</td><td>Sigma</td><td>R2625</td>は<td>-80°Cで保存されています。Cおよび軽い株から保護</td></tr>しなさい <tr><td>129マウス胚性幹細胞</td><td>サイヤジェン</td><td>MUAES-01001</td><td>フィーダーフリーの培養システムで維持</td></tr>される <tr><td>Stem-Cellbanker (DMSOフリー)</td><td>ZENOAQ</td><td>幹細胞バンカー DMSOフリー</td><td>-20 &deg;C、トリ</td></tr><tr><td>プシン0.25%(1X)溶液</td><td>HyClone</td><td>SH30042.01</td>を<td>4°Cで保存した凍結と解凍の繰り返しを避けてください。C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>4 °C で保管されています。Cと光から保護する</td></tr><tr><td>4% パラホルムアルデヒド</td><td>Beyotime</td><td>P0098</td> -<td>20 °で保存;C</td></tr><tr><td>6 - ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 細胞培養ディッシュ</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 遠心分離管</td><td>NUNC</td><td>339650</td><td></td></tr></tbody></table>

インビトロにおけるマウス胚性幹細胞からの神経細胞分化

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

マウス胚性幹細胞(mESC)の神経分化は、神経新生に関与する重要なメカニズムを解明し、再生医療に役立つ可能性のあるツールです。ここでは、組み合わせスクリーニングの戦略を用いて、 インビトロでのmESCからのニューロン分化のための効率的かつ低コストの方法を確立しました。ここで定義された条件の下で、2日間の胚体形成+6日間のレチノイン酸誘導プロトコルは、ネスチン陽性であるよく積み重ねられ、神経突起のようなA2loxおよび129誘導体の形成によって見られるように、mESCから神経前駆細胞(NPC)への迅速かつ効率的な分化を可能にする。胚体の健全な状態とレチノイン酸(RA)が適用される時点は、RA濃度と同様に、その過程で重要である。NPCからニューロンへのその後の分化において、N2B27培地II(神経基底培地によって補完される)は、神経細胞の長期的な維持および成熟をよりよく支えることができる。提示された方法は、高効率、低コスト、操作が容易であり、神経生物学や発生生物学の研究のための強力なツールとなり得る。

2日間の胚体形成+ 6日間のRA誘導は、MESCのNPCへの分化(フェーズI)を導くのに最適です。MESCsのNPCへの分化を最も促進する最適なプロトコル(フェーズI)を決定するために、A2loxと129 mESCsの両方で7つのプロトコルをテストし、各群の分化状況を光顕微鏡で監視した。 図3Aに示すように、ほとんどのA2loxおよび129誘導体は「2日間の胚体形成+6日間のRA誘導」処置(フェーズI-プロトコル3)の下で、よく積み重ねられた、そして神経突起様の形態を示し、NPCの形成を示した。しかし、「4日間の胚体形成+4日間のRA誘導」処置(第I-プロトコル2)を有する細胞は、不良およびアポトーシス状態を示し、これは胚体内の栄養不足に起因する可能性がある。単層培養はRA誘導(フェーズI-プロトコル4および5)と組み合わせることで、mESCの分化を指示することもできるが、神経突起様細胞の割合はフェーズI-プロトコル3ほどではなかった。一方、フェーズI-プロトコル6および7のほとんどのA2loxおよび129誘導体は、より小さな細胞体を示し、アポ...

ここでは、低コストで使いやすい方法を確立し、胚性幹細胞からニューロンへの迅速かつ効率的な分化を導く方法を確立しました。この方法は、研究室間で普及に適しており、神経学的研究のための有用なツールとなり得る。

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

マウスアッセイからのニューロン分化は、ニューロン新生に関与する主要なメカニズムを説明するための優れたモデルです。私たちは、企業のトロスクリーニング戦略を使用して、胚様神経新生の最適化された方法を示します。この手法は、高効率、低コスト、操作の容易さという利点があり、実験室での普及に適しています。これは、神経科学研究のための強力なツールです。プロトコル1を使用して分化を行うには、2ミリリットルの基礎分化培地に20,000個のマウス胚様幹細胞を0.1%ゼラチンコーティングされた6ウェルプレートの各ウェルに播種します。細胞接着後、細胞を2ミリリットルのPBSで洗浄し、各ウェルに2ミリリットルの基礎分化培地を加えてから、細胞をインキュベーターに戻します。細胞を8日間分化させ、2日ごとに培地を交換します。プロトコル2を実行するには、150万個のマウス胚様幹細胞を10ミリリットルの基礎分化培地中の非接着性細菌皿に加え、プレートを摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートして胚様体形成を可能にします。2日後、細胞凝集体を15ミリリットルの遠心分離管に移し、重力によって沈殿させます。上清を取り除き、10ミリリットルの新鮮な基礎分化培地を追加して、胚様体を再懸濁します。次に、それらを新しい非粘着性皿に植え直し、さらに2日間インキュベートします。ウェルあたり2ミリリットルの基礎分化培地に約50個の胚様体を収集し、ゼラチンでコーティングされた6ウェルプレートに播種します。レチノイン酸誘導では、各ウェルに2マイクロリットルのRAストックを添加し、最終濃度を1マイクロモルにします。プレートをインキュベーターに戻し、さらに4日間細胞を分化させます。プロトコル3を使用して分化を行うには、プロトコル2を繰り返しますが、胚体形成には2日、RA導入には6日しか許可しないでください。胚様体形成の品質管理は、顕微鏡を用いて実施すべきである。明るいコアを持つものだけが、後続のプロセスでうまく区別できます。プロトコル4のために、ゼラチンで塗られた版に井戸ごとの20、000のマウス胚性幹細胞を播種し、プロトコル1に従う。細胞を4日間分化させた後、各ウェルに全トランスRAストックを2マイクロリットル加え、さらに4日間プレートをインキュベートします。プロトコール5を実行するには、プロトコール4を繰り返しますが、分化のわずか2日後にRA導入を開始します。プロトコル6では、150万個の幹細胞を10ミリリットルのN2B27培地2の非接着性細菌皿に植え付け、プレートを摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートして胚様体の形成を可能にします。2日後、前述のように細胞凝集体を採取し、10ミリリットルの新鮮なN2B27培地2で胚体を再懸濁します。それらを新しい非粘着性の細菌皿に植え直し、さらに2日間分化させます。4日目に、ウェルあたり約50個の胚様体を収集し、ゼラチンでコーティングされた6つのウェルプレートに2ミリリットルのN2B27培地2を充填します。すべてのトランスRAストックを2マイクロリットルずつ各ウェルに加え、さらに4日間分化を誘導します。プロトコル7を実行するには、ゼラチン被覆プレート上にウェルあたり2ミリリットルの基礎分化培地に約20,000個の細胞を播種します。細胞を接着し、PBSで2回洗浄した後、各ウェルに2ミリリットルのN2B7培地を2個ずつ加え、細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%で8日間分化させます。プロトコル3を使用してフェーズ1の分化を行った後、0.1%ゼラチンコーティングされたプレートにウェルあたり2ミリリットルの基礎分化培地に約500,000マウス胚性幹細胞誘導体を播種します。誘導体をランダムに3つのグループに分けて、3つのフェーズ、2つの分化プロトコルをテストします。プレートを6時間インキュベートした後、細胞を2ミリリットルのPBSで2回洗浄し、プロトコールに応じて、2ミリリットルの基礎分化培地N2B27培地1またはN2B27培地2を各ウェルに加えます。ブレードをインキュベーターに入れ、細胞をさらに10日間分化させ、対応する培地を2日ごとに交換します。一般的な前駆細胞またはNPCにおけるマウス胚性幹細胞の分化に最適なプロトコルを決定するために、7つのプロトコルが試験されました。プロトコールは、A2loxロックスと129細胞の両方で試験され、各グループの分化状態を光学顕微鏡を用いてモニターしました。ほとんどのA2loxおよび129誘導体は、NPCの形成を示すプロトコル3の下で、よく積み重なった神経突起様の形態を示しました。しかし、プロトコル2を用いて分化した細胞は、胚様体内の栄養素の不足によるものであってもよいアポトーシスが現れた。NPCの形成をさらに確認するために、ネスチン陽性細胞を免疫蛍光アッセイを用いて検出した。プロトコル3は、ネスチン陽性細胞の最高の割合をもたらし、A2loxおよび129誘導体でそれぞれ最大78および69%に達しました。NPCのニューロンへの分化について、3つのプロトコルがテストされました。プロトコル3が最も効果的に分化を誘導すると判断されました。フェーズ2プロトコル3のほとんどのA2loxおよび129誘導体は、明確な神経突起と細胞体の伸長を伴う長期のニューロン様構造を持っていました。免疫蛍光アッセイはさらに、プロトコル3を使用して、βチューブリン3陽性細胞の割合がA2loxおよび129誘導体でそれぞれ最大68および59%のニューロンの生成を確認しました。この手順を試みるときは、分化する前にマウスアッセイが健康で未分化であることを確認することが重要です。さらに、厳密な品質管理は穴あけボディの形成の後でそして段階2の分化の前に遂行されるべきである。この手法は、神経生物学や発生生物学の研究者に標準的なモデルを提供し、神経新生に関与する主要なメカニズムを説明するための強力なツールになると期待されています。

neuronal-differentiation-from-mouse-embryonic-stem-cells-in-vitro

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は運動ニューロンにマウス胚性幹細胞のインビトロ分化の効率を改善するための新しいプロトコルを開発しました。として免疫組織化学的手法を用いてニューロンと運動ニューロンマーカーの発現によって証明機能を分化したES細胞は運動ニューロンを取得しました。...

運動ニューロンにマウス胚性幹細胞の効率的な分化

このビデオでは、マウス胚性幹細胞(mESC)から神経前駆細胞(NPC)をin...

マウス胚性幹細胞から神経前駆細胞を作製する技術

このビデオでは、神経前駆細胞をニューロンに分化させる細胞培養方法を紹介しました。成長因子を補充した栄養豊富な培地で細胞をインキュベートすることにより、前駆細胞は発達した軸索と樹状突起を持つニューロンに成熟しました。安定化剤は、細胞の生存率を確保し、分化プロセス全体を通じて酸化的損傷から保護します。...

神経前駆細胞のニューロンへの分化

このビデオは、胚性幹細胞を機能しているシナプスを持つニューロンのネットワーク集団に分化する技術を示しています。胚性幹細胞のニューロンへの分化、ニューロンネットワーク形成の誘導、およびネットワーク化されたニューロンによる培養の濃縮に関与するステップを概説しています。...

マウス胚性幹細胞のネットワーク化ニューロン集団への分化

マウスES細胞を、機能的なシナプスと創発的なネットワーク挙動を示す高純度ニューロンの集団に分化するためのカスタムプロトコルが記述されています。電気生理学的分析は、ボツリヌス神経毒血清型/ A-/...

幹細胞由来の中枢神経系ニューロンのネットワーク化培養における生物学的神経毒の機能評価

このプロトコルは、無血清単層法を使用して胚性幹細胞から神経前駆細胞を生成する方法を詳細に説明しています。これらの前駆細胞は、成熟した神経細胞タイプの誘導や神経仕様のプロセスの研究に使用でき、化合物スクリーニングのためのマルチウェルフォーマットスケーリングに適しています。...

無血清単層培養中のマウス胚性幹細胞の神経分化

我々は2人のまたは3次元の胚様体を生成するために、マウスの胚性幹細胞を使用するためのテクニックを説明します。私たちは、その後、レチノイン酸によって胚様体細胞の神経分化を誘導する方法を説明し、どのように前駆細胞マーカーの免疫蛍光およびイムノブロッティングによりそれらの分化の状態を分析します。...

2および3次元の胚様体中のマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の分析

このプロトコルでは、変更された胚様体-単層法を用いたマウス胚性幹細胞から皮質介在ニューロン前駆細胞と後細胞分裂の介在ニューロン前駆体を生成するためのメソッドについて説明します。これらの前駆細胞/前駆体生体外で使用することができますまたは蛍光ソート運命決定を研究するため新生児大脳新皮質に移植や治療への応用で使用されます。...

マウス胚性幹細胞の皮質介在ニューロン前駆細胞への分化

E13マウス胚神経節隆起から顕微鏡下神経幹細胞の分離法を紹介します。...

マウス萌芽期の神経幹細胞の分離と培養

ここで提示するプロトコルは、ヒト胚性幹細胞の単細胞培養の生成とその後の神経前駆細胞への分化のためのプロトコルである。プロトコルは、シンプルで堅牢でスケーラブルで、薬物スクリーニングや再生医療用途に適しています。...

ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化

吊り下げドロップ法を用いて、マウス胚性幹細胞を神経細胞に分化する手順について説明する。また、RT-qPCR、免疫蛍光、RNA-seq、フローサイトメトリーを通して包括的なフェノミック解析を行っています。...

マウス胚性幹細胞からの神経前駆細胞とニューロンの分化と特徴付け

学ぶマウス胚性幹細胞からの神経細胞分化法。ネスチン陽性前駆細胞78%、β-チューブリンIII陽性ニューロン68%の高効率を達成。神経発生メカニズム研究の標準ツールとして広く活用可能です。

インビトロにおけるマウス胚性幹細胞からの神経細胞分化

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