Name: ナノ材料やその他の難しい物質の藻類毒性試験のための小規模なセットアップ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 学ぶ LEVITATTプラットフォームを用いた藻類毒性試験法。LED照明で熱発生を抑制し、均一な光場を実現。ナノ材料や着色物質などの難しい物質の生態毒性評価に適したコンパクトな試験システムです。

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この研究は、Horizon 2020の研究およびイノベーションプログラムの下で、PATROLS - ナノセーフティテストのための高度なツール、グラント契約760813によって資金提供されました。

1. LEVITATT 設定の説明
<ol><li>20 mLシンチレーションガラスバイアル(図1、挿入1)を使用して光の浸透を可能にします。あるいは、光貫通性プラスチックバイアルを使用することができます。光量計を使用して光強度を定量化します。</li>
	<li>試験の開始時に少なくとも4 mLの試験懸濁液を使用して、バイオマスの定量化とインキュベーション中およびインキュベーション後のナノ材料の特性評価/定量化を可能にします(図1、挿入2)。</li>
	<li>20 mLのシンチレーションバイアルにキャップ(図1、インサート3)を合わせ、小さな穴を開けて(直径約1mm)、大気とのCO2 交換を可能にします。この交換は、テスト中に安定したpHとCO2 レベルを確保するために重要です。</li>
	<li>揮発性物質の場合、気密性テフロンコートキャップを使用して、濃縮重炭酸ナトリウム(NaHCO3)緩衝システム10によってCO2が溶液中に維持される気相を有さないシリンジ39または完全閉フラスコを使用してヘッドスペースのCO2濃縮を可能にする。</li>
	<li>外装に取り付けられたクランプでバイアルを固定します(図1、挿入4)。</li>
	<li>テストバイアルの下にあるLED光源(図1、挿入5)は、「クールホワイト」または「昼光」タイプの均一な蛍光照明と光強度を400nm〜700 nmの光合成有効波長範囲で測定した60〜120 μE∙m-2∙s-1の範囲で提供します。-2-1このセットアップでは、光源に光調光器を取り付け、5~160 μE∙m-2の範囲で調整可能な光強度を採用します。これにより、高い光強度と低い光強度でのテストが可能になります。</li>
	<li>試験の間、サンプルを攪拌するために軌道シェーカーにセットアップを取り付けます。これにより、細胞を自由な懸濁液に保ち、空気から水へのCO2 物質移動を容易にします(図1、6を挿入)。</li>
	<li>温度制御された部屋またはサーモスタットキャビネットにセットアップを置き、テストを通して安定した温度を維持します(図1、挿入7)。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61209/61209fig1v2.jpg"> 図1:藻類毒性試験用LED垂直照明表(LEVITATT)の画像1)インキュベーション用20 mLガラスシンチレーションバイアル、2)4 mLサンプルを分析し、3)CO2交換用の2穴を開けた蓋、4)規定された光条件のケース、5)ケーシングの中央に位置するLED光源、6)実験中の攪拌のための軌道シェーカー、および7)サーモスタットキャビネット。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61209/61209fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
2. 藻類増殖培地の調製
<ol><li>ISO 8692藻類の成長媒体は4つの異なったストックの解決で成っている。 表1に従って、塩の適切な量を計量し、超純水で希釈する。</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ストックソリューション</td>
			<td>栄養</td>
			<td>ストック溶液中の濃度</td>
			<td>試験溶液中の濃度</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">1:マクロ栄養素</td>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>1.5 g/L</td>
			<td>15 mg/L (N: 3.9 mg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2∙6H2O</td>
			<td>1.2 g/L</td>
			<td>12 mg/L (Mg: 2.9 mg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2∙2H2O</td>
			<td>1.8 g/L</td>
			<td>18 mg/L (Ca: 4.9 mg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4∙7H2O</td>
			<td>1.5 g/L</td>
			<td>15 mg/L (S: 1.95 mg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>0.16 g/L</td>
			<td>1.6 mg/L (P: 0,36 mg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">2: フェ・エドタ</td>
			<td>3∙6H2O3</td>
			<td>64 mg/L</td>
			<td>64 μg/L (Fe: 13 μg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ナ2EDTA∙2H2O</td>
			<td>100 mg/L</td>
			<td>100 μg/L</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">3: 要素をトレースする</td>
			<td>H3BO3a
</td>
			<td>185 mg/L</td>
			<td>185 μg/L (B: 32 μg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MnCl2∙4H2O</td>
			<td>415 mg/L</td>
			<td>415 μg/L (Mn: 115 μg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZnCl2
</td>
			<td>3 mg/L</td>
			<td>3 μg/L(Zn:1.4 μg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>コクル2∙6H2O</td>
			<td>1.5 mg/L</td>
			<td>1.5 μg/L(Co:0.37 μg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CuCl2∙2H2O</td>
			<td>0.01 mg/L</td>
			<td>0.01 μg/L (Cu: 3.7 ng/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2MoO4∙2H2O</td>
			<td>7 mg/L</td>
			<td>7 μg/L(Mo:2.8 μg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4: ナフコ3</td>
			<td>ナフコ3
</td>
			<td>50 g/L</td>
			<td>50 mg/L (C: 7.14 mg/L)</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:藻類増殖培地用ストック液中の栄養素濃度
注:H3BO3 は0.1 M NaOHを加えることによって溶解することができる。金属イオンによる複雑化を避けるために、金属を試験する際にはEDTAを取り除く必要があります。膜濾過(平均細孔径0.2μm)またはオートクレーブ(120°C、15分)によってストック液を滅菌します。オートクレーブストック溶液2と4は使用しないでくださいが、膜ろ過によって滅菌してください。4°Cで暗闇の中でソリューションを保存します。
<ol start="2"><li>藻類成長培地の1 Lを製造するには、500 mL滅菌化された超純水を1 L滅菌された体積フラスコに移し、10 mLのストック溶液1を加える:マクロ栄養素、1 mLのストック溶液2:Fe-EDTA、1 mLのストック溶液3:微量元素、および1 mLのストック溶液4:NaHCO3.</li>
	<li>滅菌された超純水で1 Lまで満たし、フラスコをストッパーし、十分に振って藻類の成長培地を均質化します。</li>
	<li>空気と接触して一晩放置するか、滅菌、ろ過空気を30分間泡立て、使用前に溶液を平衡化します。平衡後、pHを必要に応じてpHを0.2±、1 M HClまたは1 M NaOHで調整します。</li>
</ol>3. 藻類試験の設定
注: 藻類試験手順のフロー図を 図 2に示します。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61209/61209fig2v6.jpg"> 図2:藻類試験の設定の流れ図。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61209/61209fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<ol><li>ステップ2に従って調製した藻類増殖培地において所望の最高試験濃度で試験化合物のストック溶液を調製する。ストックソリューション/サスペンションの調製については、OECD 201(可溶性化合物の場合)またはOECD 318(ナノ材料用)に従ってください。</li>
	<li>ストック溶液中のpHを測定します。藻類増殖培地から複数の単位がずれる場合は、pHを1 M HClまたは1 M NaOHのいずれかで8に調整します。</li>
	<li>25 mL試験溶液で1 x 104 細胞/mLの最終的な細胞濃度に到達するために必要な接種量を計算します。 注:接種は、LEVITATTセットアップを使用して成長した汚染されていない指数関数的に成長している ラフィドセリスの潜在性 から来る必要があります。</li>
	<li>各25 mL体積フラスコに添加するストック溶液の量を計算し、所望の試験濃度を求める。各濃度間の係数は3.2を超えてはなりません。</li>
	<li>選択した濃度ごとに1つの25 mL体積フラスコと、さらに25 mLの体積フラスコをマークコントロールします。</li>
	<li>25 mL体積フラスコに所望の濃度に達するために必要な試験化合物のストック溶液の量を加える。コントロールにストック ソリューションを追加 しないでください 。</li>
	<li>各25 mL容積フラスコに培地を加えると、約20mLの体積に達します。</li>
	<li>ステップ3.3で計算した接種量を各25mL体積フラスコに加えます。各25 mL容積フラスコに培地を加える 25 mL の最終総容積に.</li>
	<li>フラスコをストッパーし、フラスコを2回垂直に回して十分に混ぜます。</li>
	<li>各フラスコから0.4mLを個々のスクリューキャップバイアルに移し、1.6mLのアセトン(MgCO3で飽和)を加える): 試験濃度と制御ごとに1サンプル。蓋をしっかりと閉じ、蛍光測定(セクション4)まで室温で暗闇の中に保管します。</li>
	<li>各試験溶液のピペット4 mLを20 mLシンチレーションバイアル(濃度あたり3回の反復、対照用に5回の反復)。シンチレーションバイアルのネジ蓋。Remember CO2交換を可能にするために、蓋には穴(直径約1mm)が必要です。</li>
	<li>24時間、48時間、72時間後、各バイアルからスクリューキャップバイアルに0.4mLをピペットし、1.6mLのアセトン(MgCO3で飽和)を加える。蓋をしっかりと閉じ、蛍光測定(セクション4)まで室温で暗闇の中に保管します。</li>
	<li>最後のサンプルが72時間で採取された後、1つのバイアルに与えられた濃度のために3つの複製物を静かにプールし、pHを測定する。すべての濃度とコントロールに対して繰り返します。pHは、測定されたサンプルの初期pHから1.5単位以上逸脱してはならない。</li>
	<li>残りの液体を、お客様の制度上の規則および規制に従って、廃液容器に排出します。</li>
</ol>4. 藻類試験サンプルの分析
<ol><li>蛍光分光光度計を使用して、藻類バイオマスを測定する(ここではクロロフィルAとして表す)。クロロフィルAのピーク発光は励起波長で420nm、発光波長で671nmです。</li>
	<li>個々のサンプルの蛍光を3回測定し、各サンプルの平均値を計算します。</li>
	<li>成長速度を計算するには、式 1 を使用します。測定された蛍光(相対単位)を、式1のバイオマスパラメータとして直接使用することができる。 式 1: μ = (ln Nt – ln N0)/ t ここでμは成長率(d-1)、N0は初期バイオマス、Ntはt時間t、tは試験期間(d)の長さである。0なお、N0とNtは同じ単位で表現する必要があります。</li>
	<li>非線形回帰曲線(例えば、対数ロジスティックまたはワイブル関数)を増殖率データに適合させる統計ソフトウェアを使用して、10%、20%、および50%阻害で有効濃度値を得る。補足情報では、DRCパッケージ11 を用いた統計ソフトウェアRに適合するためのコードの例が与えられている。</li>
</ol>

<ol><li>European Chemicals Agency. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+on+Registration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Chemicals+Agency%22%5BJournal%5D)">Guidance on Registration.</a> European Chemicals Agency. , Helsinki, Finland. (2016).</li>
<li>Organisation for Economic Cooperation and Development. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+Document+on+Aquatic+Toxicity+Testing+of+Difficult+Substances+and+Mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Organisation+for+Economic+Cooperation+and+Development%22%5BJournal%5D)">Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures.</a> Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2019).</li>
<li>Blaise, C., Legault, R., Bermingham, N., Van Coillie, R., Vasseur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+microplate+algal+assay+technique+for+aquatic+toxicity+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicity+Assessment%22%5BJournal%5D)">A simple microplate algal assay technique for aquatic toxicity assessment.</a> Toxicity Assessment. 1 (3), 261-281 (1986).</li>
<li>Hjorth, R., Sorensen, S. N., Olsson, M. E., Baun, A., Hartmann, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+certain+shade+of+green%3A+can+algal+pigments+reveal+shading+effects+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Integrated+Environmental+Assessment+and+Management%22%5BJournal%5D)">A certain shade of green: can algal pigments reveal shading effects of nanoparticles.</a> Integrated Environmental Assessment and Management. 12 (1), 200-202 (2016).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algae+response+to+engineered+nanoparticles%3A+current+understanding%7B%2C%7D+mechanisms+and+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science%3A+Nano%22%5BJournal%5D)">Algae response to engineered nanoparticles: current understanding{,} mechanisms and implications.</a> Environmental Science: Nano. 6 (4), 1026-1042 (2019).</li>
<li>Arensberg, P., Hemmingsen, V. H., Nyholm, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miniscale+algal+toxicity+test%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">A miniscale algal toxicity test.</a> Chemosphere. 30 (11), 2103-2115 (1995).</li>
<li>Organisation for Economic Cooperation and Development. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Test+No.+201%3A+Freshwater+Alga+and+Cyanobacteria%2C+Growth+Inhibition+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Organisation+for+Economic+Cooperation+and+Development%22%5BJournal%5D)">Test No. 201: Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test.</a> Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2011).</li>
<li>International Organization for Standardization (ISO). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+Quality+-+Fresh+Water+Algal+Growth+Inhibition+Test+with+Unicellular+Green+Algae%5BTitle%5D)+AND+%22International+Organization+for+Standardization+%28ISO%29%22%5BJournal%5D)">Water Quality - Fresh Water Algal Growth Inhibition Test with Unicellular Green Algae.</a> International Organization for Standardization (ISO). , (2012).</li>
<li>Halling-Sørensen, B., Nyhohn, N., Baun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algal+toxicity+tests+with+volatile+and+hazardous+compounds+in+air-tight+test+flasks+with+CO2+enriched+headspace%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Algal toxicity tests with volatile and hazardous compounds in air-tight test flasks with CO2 enriched headspace.</a> Chemosphere. 32 (8), 1513-1526 (1996).</li>
<li>Mayer, P., Nyholm, N., Verbruggen, E. M. J., Hermens, J. L. M., Tolls, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algal+growth+inhibition+test+in+filled%2C+closed+bottles+for+volatile+and+sorptive+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Algal growth inhibition test in filled, closed bottles for volatile and sorptive materials.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (10), 2551-2556 (2000).</li>
<li>Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-response+analysis+using+R%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Dose-response analysis using R.</a> PloS One. 10 (12), 0146021(2015).</li>
<li>Birch, H., Kramer, N. I., Mayer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+freely+dissolved+concentrations+of+semivolatile+and+hydrophobic+test+chemicals+in+in+vitro+assays-measuring+high+losses+and+crossover+by+headspace+solid-phase+microextraction%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Time-resolved freely dissolved concentrations of semivolatile and hydrophobic test chemicals in in vitro assays-measuring high losses and crossover by headspace solid-phase microextraction.</a> Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1780-1790 (2019).</li>
<li>Trac, L. N., Schmidt, S. N., Mayer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Headspace+passive+dosing+of+volatile+hydrophobic+chemicals+-+toxicity+testing+exactly+at+the+saturation+level%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Headspace passive dosing of volatile hydrophobic chemicals - toxicity testing exactly at the saturation level.</a> Chemosphere. 211, 694-700 (2018).</li>
<li>Eisentraeger, A., Dott, W., Klein, J., Hahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+studies+on+algal+toxicity+testing+using+fluorometric+microplate+and+Erlenmeyer+flask+growth-inhibition+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Comparative studies on algal toxicity testing using fluorometric microplate and Erlenmeyer flask growth-inhibition assays.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 54 (3), 346-354 (2003).</li>
<li>Paixao, S. M., Silva, L., Fernandes, A., O'Rourke, K., Mendonca, E., Picado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+a+miniaturized+algal+bioassay+in+phytotoxicity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">Performance of a miniaturized algal bioassay in phytotoxicity screening.</a> Ecotoxicology. 17 (3), 165-171 (2008).</li>
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<li>Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+fluorometric+microplate+algal+toxicity+assay+for+riverine+periphytic+algal+species%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 94, 37-44 (2013).</li>
<li>Lee, W. M., An, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+zinc+oxide+and+titanium+dioxide+nanoparticles+on+green+algae+under+visible%2C+UVA%2C+and+UVB+irradiations%3A+no+evidence+of+enhanced+algal+toxicity+under+UV+pre-irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Effects of zinc oxide and titanium dioxide nanoparticles on green algae under visible, UVA, and UVB irradiations: no evidence of enhanced algal toxicity under UV pre-irradiation.</a> Chemosphere. 91 (4), 536-544 (2013).</li>
<li>Samei, M., Sarrafzadeh, M. H., Faramarzi, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+morphology+and+size+of+zinc+oxide+nanoparticles+on+its+toxicity+to+the+freshwater+microalga%2C+Raphidocelis+subcapitata%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+and+Pollution+Research%22%5BJournal%5D)">The impact of morphology and size of zinc oxide nanoparticles on its toxicity to the freshwater microalga, Raphidocelis subcapitata.</a> Environmental Science and Pollution Research. 26 (3), 2409-2420 (2019).</li>
<li>Neale, P. A., Jaemting, A. K., O'Malley, E., Herrmann, J., Escher, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behaviour+of+titanium+dioxide+and+zinc+oxide+nanoparticles+in+the+presence+of+wastewater-derived+organic+matter+and+implications+for+algal+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science%3A+Nano%22%5BJournal%5D)">Behaviour of titanium dioxide and zinc oxide nanoparticles in the presence of wastewater-derived organic matter and implications for algal toxicity.</a> Environmental Science: Nano. 2 (1), 86-93 (2015).</li>
<li>Hartmann, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenges+of+testing+metal+and+metal+oxide+nanoparticles+in+algal+bioassays%3A+titanium+dioxide+and+gold+nanoparticles+as+case+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">The challenges of testing metal and metal oxide nanoparticles in algal bioassays: titanium dioxide and gold nanoparticles as case studies.</a> Nanotoxicology. 7 (6), 1082-1094 (2013).</li>
<li>Farkas, J., Booth, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+fluorescence-based+chlorophyll+quantification+methods+suitable+for+algae+toxicity+assessment+of+carbon+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Are fluorescence-based chlorophyll quantification methods suitable for algae toxicity assessment of carbon nanomaterials.</a> Nanotoxicology. 11 (4), 569-577 (2017).</li>
<li>Handy, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+for+conducting+ecotoxicity+test+methods+with+manufactured+nanomaterials%3A+what+have+we+learnt+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">Practical considerations for conducting ecotoxicity test methods with manufactured nanomaterials: what have we learnt so far.</a> Ecotoxicology. 21 (4), 933-972 (2012).</li>
<li>Handy, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecotoxicity+test+methods+for+engineered+nanomaterials%3A+practical+experiences+and+recommendations+from+the+bench%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ecotoxicity test methods for engineered nanomaterials: practical experiences and recommendations from the bench.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 31 (1), 15-31 (2012).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

植物プランクトンは太陽エネルギーと二酸化炭素を有機物に変換し、水生生態系において極めて重要な役割を果たしています。このため、藻類増殖率阻害試験は、化学物質の規制リスク評価に必要な3つの必須の水生毒性試験の1つとして含まれています。信頼性が高く再現可能な藻類毒性試験を行う能力は、この点において重要です。アーレンマイヤーフラスコを使用したテスト設定では、導入に記載されているように、さまざまな変動性と不便性が導入されています。この問題を回避するために、マイクロティタープレートは3を提案されている。マイクロタイタープレートは、テストに必要な体積とスペースを最小限に抑える一方で、試験ガイドライン6の試験有効性基準を用いたそのようなセットアップの遵守に関して文献で懸念が提起されている。例えば、細胞成長培地における37°Cのマイクロタイタープレートにおける半揮発性化学物質の有意な損失および他のウェルへのクロスオーバー(DMEMグルテマックス、オプティ-MEM、およびハムF12グルタマックス)は、最近、バーチららによって実証<sup class="xref"...

藻類毒性試験は、欧州および国際的な規制(REACH1およびTSCA(米国)による化学物質の市場前および後の登録に必要な生態毒性データを生成するために使用される3つの必須試験のうちの1つです。このため、標準化された藻類試験ガイドラインは、国際機関(ISOおよびOECDなど)によって開発されています。これらの試験基準とガイドラインは、pH、温度、二酸化炭素レベルおよび光強度の点で理想的な試験条件を規定する。しかし、藻類試験中の安定した試験条件の維持は、実際には困難であり、その結果、化学物質やナノ材料(しばしば「難しい物質」と呼ばれる)の範囲に対する再現性と信頼性に関する問題に苦しむ2。既存の藻類毒性試験の設定のほとんどは、インキュベーター内の軌道シェーカー上に位置する比較的大量(100〜250 mL)で動作します。このようなセットアップは、テスト濃度の数を制限し、達成可能な、藻類培養物および試験材料の大量を複製します。さらに、これらの設定は、均一な光場を持つことはほとんどなく、信頼性の高い照明条件は、光強度が指数関数的に減少し、一部は、フラスコの形状に起因する一部として、大きなフラスコで得ることはさらに困難です。代替設定は、pH、追加のバイオマス測定、顔料抽出または破壊的なサンプリングを必要とする他の分析を測定するのに十分なサンプリング量を許容しない小さなサンプル量を含むプラスチックマイクロチター3プレートを含む。着色懸濁液を形成するナノ材料および物質の藻類毒性試験のための既存の設定を用いた特定の課題の1つは、藻類細胞に利用可能な光の干渉または遮断であり、しばしば「シェーディング」4,5,5と呼ばれる。シェーディングは、試験材料および/または試験材料と藻体細胞との間の相互作用によってバイアル内で発生する可能性があり、または互いに対する位置と光源のためにバイアル間でシェーディングが発生する可能性があります。
この方法は、OECD 2017、およびISO8692 8などの規格に準拠した試験を可能にする、アレンスバーグら6によって導入された小規模藻類毒性試験セットアップに基づいている。この方法は、上記の制限に対処するためにさらに最適化されています: 1)LED光技術を利用して最小限の発熱で均一な光条件を確保し、2)一定のpH、CO2レベル、および3)揮発性2物質の試験や高い被光電位を有する汎用性の高い試験容器材料の使用を可能にしながら、化学的/生物学的分析のための十分なサンプル量を提供する。

<table><tbody><tr><td>アセトン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V179124</td><td></td></tr><tr><td>塩化アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254134</td><td></td></tr><tr><td>BlueCap ボトル (1L)</td><td>Buch &ホルムA/S</td><td>&nbsp;</td><td></td>9072335</tr><tr><td>ホウ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0394</td><td></td></tr>塩化<tr><td>カルシウム二水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208290</td><td></td></tr><tr><td>透明アクリルシート(40x40 cm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化コバルト(II)六水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255599</td><td></td></tr>銅<tr><td>(II)塩化物二水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>307483</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp;E5134</td><td></td></tr><tr><td>蛍光分光光度計 F-7000</td><td>日立</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>塩化鉄(III) 六水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>LED 光源</td><td>Helmholt Elektronik A/S</td><td>H35161</td><td>ニュートラルホワイト、6500K</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>塩化マンガン(II) 四水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>IKA</td><td>2980200</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Raphidocelis subcapitata</td><td>NORCCA</td><td></td><td>NIVA-CHL1菌株</td></tr><tr><td>シンチレーションバイアル(20 mL)</td><td>Fisherscientific</td><td>11526325</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td></td></tr><tr><td>モリブデン酸ナトリウム二水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>331058&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>スプリングクランプ</td><td>フレデリクセンサイエンティフィック A/S</td><td>472002</td><td></td></tr><tr><td>サーモスタットキャビネット</td><td>VWR</td><td>WTWA208450</td><td>代替:温度制御された部屋</td></tr><tr><td>換気パイプ (&Oslash;125 mm)</td><td>Silvan</td><td>22605630165</td><td></td></tr><tr><td>メスフラスコ (25 mL)</td><td>DWK Life Sciences</td><td>246781455</td><td></td></tr><tr><td>塩化亜鉛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr></tbody></table>

ナノ材料やその他の難しい物質の藻類毒性試験のための小規模なセットアップ

A Small-Scale Setup for Algal Toxicity Testing of Nanomaterials and Other Difficult Substances

エコ毒性データは、欧州および国際規制(REACHなど)による化学物質の市場前および市場後の登録の要件です。藻類毒性試験は、化学物質の規制リスク評価に頻繁に使用されます。高い信頼性と再現性を実現するためには、標準化されたガイドラインの開発が不可欠です。藻類毒性試験では、ガイドラインには、pH、温度、二酸化炭素レベル、光強度などのパラメータの安定した均一な条件が必要です。ナノ材料やその他のいわゆる難しい物質は、光を妨げ、その規制の受け入れを妨げる結果の大きな変動を引き起こす可能性があります。これらの課題に対処するために、我々は、LEVITATT(藻類毒性試験用LED垂直照明テーブル)を開発しました。このセットアップでは、下からのLED照明を利用して、均質な光の分布と温度制御を可能にする一方で、サンプル内シェーディングを最小限に抑えます。このセットアップは、バイオマス定量のためにサンプル量を最適化し、同時に藻類の指数成長をサポートするために十分なCO2流入を保証します。さらに、テスト容器の材料は吸着および揮発を最小にするように合わせることができる。着色物質や粒子懸濁液をテストする場合、LEDライトの使用はまた、追加の発熱なしに光強度を増加させることができます。コンパクトデザインと最小限の設備要件により、幅広い研究所でのLEVITATTの実装の可能性が高まります。また、藻類毒性試験の標準化されたISOおよびOECDガイドラインに準拠する一方で、LEVITATTは、エルレンマイヤーフラスコおよびマイクロタイタープレートと比較して、2つの基準物質(3,5-ジホロロフェノールおよびK2 Cr2O7)および3ナノ材料(ZnO、CeO2、およびBaSO4)に対して、より低いサンプル間変動性を示した。2

基準物質を用いた初期試験を行い、藻類株の感度を判定する。R.サブペタに定期的に使用される基準物質は、ジクロメートカリウムおよび3,5-ジクロルフェノール77,88である。図3および表2は、R中のDRCパッケージが成長率に適用された場合の曲線適合および統計出力を含む藻類試験の代表的な結果を示す。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61209/61209fig03.jpg"> 図3:藻類への化学化合物の72時間曝露に対する代表的な濃度応答曲線(R.首下子)。実線は対数ロジスティック適合を表し、シェーディング領域は適合度の 95% 信頼区間です。開いた円は、...

LEDで垂直に照射されたセットアップを用いて、難しい物質(着色物質やナノ材料など)に対する藻類毒性試験を実証しています。

Ecotoxicity data is a requirement for pre- and post-market registration of chemicals by European and international regulations (e.g., REACH). The algal ...

化学会社が新しい化学物質や他の材料を市場に投入したいと考えている場合、一連の環境毒性試験からデータを提供する必要があります。藻類検定は、実行する必要がある3つの必須テストの1つです。藻類のテストは、実行するのが非常に困難であるという事実に苦しんでいます。このため、我々は、LEVITATTのテストプラットフォームを開発しました。LEVITATTは、LEDライトを使用して、過度の発熱の問題を回避します。さらに、均一な光場を保証します。これは、藻類のテストを実行するために多くのスペースを必要としないことを意味し、コンパクトなサイズを有するが、同時に、それは、試験の前、中、および後に化学分析と特性を実行するのに十分なサンプル量を使用することができます。これは、ナノ材料をテストする際に特に重要です。本ビデオでは、ナノ材料やその他の難しい物質の藻類毒性試験に対するLEVITATTの使用について説明します。デモは、次の 4 つの手順で構成されます。まず、LEVITATT のコンポーネントについて説明します。第2のステップは、藻類増殖培地用の溶液を調製することです。そして第3のステップは、藻類毒性試験を行う方法の手順の概要を示す。最後のステップは、フルオロメーターによる藻類バイオマスの増加を測定することです。レビタットは部屋の温度管理されたキャビネットに置くことができる。これにより、露光を通して安定した温度を実現します。この設定は、試験中にサンプルの回転を可能にするために軌道シェーカーに配置されます。試験は、4ミリリットル露光媒体を含む20ミリリットルシンチレーションバイアルで行われる。穴が開けたネジキャップは、露光時に空気とCO2交換を可能にします。LEDソースは2つのプラスチックシートに挟まれ、各ケーシングの中央に位置しています。配置により、均一な照明フィールドが作成され、サンプル間のシェーディングが最小限に抑えられます。各ケースはクランプと取付けられ、5つまでのサンプルを握ることができる。コンパクトサイズにより、実験の実行に必要なスペースを最小限に抑えることができます。ストック溶液を調製するには、各化合物の適切な量を計量する。ストック溶液は、藻類の成長に不可欠な様々な塩で構成されています。適切な量の塩を計量すると、超純水で希釈されます。ストック溶液は、濾過またはオートクレーブによって滅菌されます。滅菌後、ストック液は摂氏4度で暗闇の中に貯蔵することができる。一連の暴露濃度を準備する。露光濃度間の係数は3.2を超えてはなりません。指数関数的に成長する藻類の適切な量は、各試験濃度に追加されます。最終的な細胞密度は、ミリリットル当たり約10,000藻類細胞である必要があります。テストの有効性基準を満たすために、プレカルチャーが指数関数的に成長していることが重要です。測定バイアルは、サンプリング前に藻類と化合物の均質な分布を可能にするために混合される。サンプルはビーカーに注がれ、4ミリリットルは20ミリリットルのシンチレーションバイアルにピッピングされる。シンチレーションバイアルは現在キャップされています。各濃度からピペット0.4ミリリットル。1.6ミリリットルのアセトンを加え、細胞壁を破壊し、クロロフィルを液相に放出します。各ガラスバイアルは、現在、保存中にアセトンの蒸発を避けるためにしっかりと近づいています。キャップシンチレーションバイアルは現在、LEVITATTでランダムに分布し、72時間インキュベートされています。インキュベーションの開始と終了時の光強度と温度を測定し、希望するガイドラインに準拠していることを確認します。サブサンプリングは、各シンチレーションバイアルからガラスバイアルに0.4ミリリットルをピペット処理することによって24時間間隔で行われます。細胞壁を破壊し、クロロフィルを液相に放出するために160万アセトンを加えます。アセトンを加えた後、しっかりと蓋をねじ込み、分析するまでサンプルを暗闇の中に置きます。蛍光計を使用して、試験期間を通じて取得したサンプル中のバイオマスを定量化します。蛍光計の設定は、励起波長として420ナノメートル、発光波長は671ナノメートルでなければなりません。個々のサンプルは3回測定され、相対値が示されます。フルオロメーターからの相対値は、さらなるデータ処理に使用される成長率を計算するために使用されます。統計ソフトウェアを使用して、計算された成長率データに非線形回帰曲線を適合させます。非線形回帰曲線の例として、実行可能関数の対数ロジスティックが挙げられます。関連付けられた 95% 信頼区間は、モデル適合と共に表示されます。10、20、50%非効率などの定期的に有効な濃度値を使用して、環境毒性試験の結果を報告します。結論として、LEVITATTは国際的な標準化されたガイドラインに準拠した規則的な化学薬品の藻類毒性試験のための密集したプラットホームを提供する。さらに、セットアップは、ナノ材料や着色された物質などの藻類に向かって光の通過を妨げる困難な物質のテストのための堅牢なプラットフォームを提供します。

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&gt;jove_content&lt;微細藻類の培養と工業用煙道ガスの統合は、最終的に重金属と他の無機化合物を成長培地に導入します。この研究は、フォトバイオリアクターで成長したNannochloropsis...

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中性脂質のバブル列フォトバイオリアクターとアッセイで緑の微細藻類の栽培

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長期ナノ材料暴露後のインビトロ遺伝子毒性試験のための高度な3D肝モデル

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アルテミアサリナLを用いた致死性バイオアッセイ。

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ナノ材料やその他の難しい物質の藻類毒性試験のための小規模なセットアップ

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