Name: 単細胞ゲノムアプリケーションのための脂肪組織核の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 学ぶ脂肪組織からの単一核分離法。成熟脂肪細胞の脆弱性を克服し、核凝集体と細胞残渣を最小化して高品質な単細胞トランスクリプトーム解析を可能にするロバストなプロトコルです。

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アルバート・アインシュタイン・ゲノミクスのコアのデビッド・レイノルズとフロー・サイトメトリー・コアのジンハン・ザンに、技術サポートを感謝します。我々は、国立衛生研究所(NIH)(DK110426)およびアインシュタインマウントシナイ糖尿病研究センター(DK020541)、ニューヨーク肥満研究センター(DK026687)(すべてK026687)からの支援を認める。.また、アルバート・アインシュタインがんセンター(CA013330)の中核的な支援に感謝したいと思います。

アルバート・アインシュタイン医科大学の制度動物ケア・使用委員会が承認した手順に従って、動物のケアと実験が行われました。
1. 組織消化・分解バッファーの調製
<ol><li>組織消化バッファーを準備します。<ol>
<li>脂肪組織のすべてのグラムのための消化バッファーの〜1 mLを調製します。</li>
		<li>1.5 U/mLコラゲナーゼDと2.4 U /mLディスパーゼIIを計量し、リン酸緩衝生理食塩分(PBS)を加えます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>核調製バッファー (NPB) を準備します。<ol>
<li>10 mM HEPES、1.5 mM塩化マグネシウム、10 mM塩化カリウム、250 mMスクロース、およびヌクレアーゼフリー水でNP-40を用意します。よく混ぜます。スクロースは、他の成分よりも溶解するのに多くの時間がかかる場合があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)溶液を調製します。<ol>
<li>EDTAを含むPBSで0.5%BSAを調製します。滅菌濾過細胞培養グレードPBSを使用することをお勧めします(資料表を参照)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 脂肪組織の酵素消化
<ol><li>Auneら13に従って脂肪組織を抽出するマウスを解剖する。PBSを含む皿の中で単離された組織を収集します。ティッシュをペーパータオルに移して乾かします。その後、きれいな皿にティッシュを置きます。</li>
	<li>消化バッファーに塩化カルシウムを加え、最終濃度の 10 mM にします。少量の消化バッファーを皿に加え、脂肪組織を十分にミンチします。必要な消化バッファーの量は、分離された組織の量に基づいています。通常~1mL以下が用いられる。</li>
	<li>調製した消化バッファーの量の約半分(例えば、5匹のマウスの場合は〜10 mL)を細かく組織に加える。血清ピペットを使用して、サンプルを50 mL円錐遠心分離管に移します。残りの量のバッファーを加えて皿を洗い、サンプルを含む50 mLチューブに移します。ピペットは数回上下します。その後、37°Cで200-210 rpmで12〜15分間振ってインキュベートします。</li>
</ol>3. アディポサイトの分離
<ol><li>インキュベーション後、0.5%のBSAをサンプルに対して1:1の比率で加えます。何度か上下にピペットを入れ、よく混ぜます。試料を室温(RT)で5分間300xgで遠心分離し、間質血管画分(SVF)をスピンダウンさせる。 g端数分数はサンプルの最上層に残ります。</li>
	<li>50 mL円錐形遠心分離チューブの上に40 μmのセルフィルターを置き、サンプルをフィルターし、最上層を採取し、チューブの底部にあるSVFの後ろに残します。フィルターをチューブの上に逆さまに反転させ、0.5%BSAを使用してフィルターを逆洗浄し、チューブ内のサンプルを収集することによって、最上層(アディポサイト分数)を新しいチューブに移します。</li>
	<li>サンプルサイズに基づいて0.5%BSAの総量を10〜15mLにし、血清ピペットでピペットを上下に動かすか、サンプルを混ぜるために一時的に上下に振ります。RTで5分間300 x gでサンプルを再び遠心分離します。</li>
</ol>4. 核分離
<ol><li>広ボアピペットチップを使用し、サンプルの最上層を氷上の新しいプレチルドチューブの上に置いた100 μmのセルフィルターに慎重に移し、残りのSVFを残します。</li>
	<li>十分な量のNPBでフィルターを洗い流す/洗浄し、フィルターを捨てます。このステップから、できるだけ頻繁に氷上のサンプルを持ち、漏れや不健康な核を避けるために迅速に作業します。氷上の将来のステップで使用されるマイクロ遠心分離管をプレチルするのに役立ちます。</li>
	<li>サンプルを氷の上に2分以上置き、チューブを断続的に穏やかに反転して混ぜます。氷上のインキュベーション時間は、サンプルサイズとアディポサイトの種類に合わせて最適化する必要があります。遠心分離機 1,000 x gで 4 °C で 10 分間</li>
	<li>上清を取り除き、NPBの1mLでペレットを再懸濁します。サンプルをきれいなマイクロ遠心チューブに移します。転写中は、破片や脂質を含むチューブの壁に触れないようにしてください。0.6 U/μL RNase阻害剤をサンプルに加え、混合します。遠心分離機は4°Cで1000xgで再び10分間遠心分離機を使用します。 g 注: 小さいサンプルの場合、このステップでは遠心分離速度と時間を減らしてください。</li>
	<li>上清を取り除き、1 mLの核洗浄バッファー(2%BSA/PBS + 0.6 U/μL RNase阻害剤)で再懸濁します。</li>
	<li>積み重ね可能な30 μmフィルターが付いているきれいな管に二重フィルター。核洗浄バッファーの少量(約300 μL)でフィルターを洗浄します。あるいは、小さいサンプルの場合は、マイクロ遠心チューブに収まる30 μmのフィルターを使用し、直接フィルターを入れます。</li>
	<li>健康な核の正常な分離を確認します。<ol>
<li>サンプルの小さなアリコートをトリパンで染色し、自動細胞カウンターを使用して平均死んだサイズと死んだ細胞の割合を評価します。主に核を含むサンプルの平均デッドサイズは7〜10μmの範囲である必要があります。</li>
		<li>DAPIでサンプルの小さなアリコートを染色し、20倍以上の目的で顕微鏡下で検査します。核膜はそのままで、核は丸くする必要があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. FACSのクリーンアップと核濃縮工程
<ol><li>核をクリーンアップし、余分な破片を除去するためにFACSステップに直ちに進みます。コレクション バッファには、核洗浄バッファーが含まれている必要があります。FACS の間にバッファは希薄化されます。ソート時の希釈を考慮して、より高濃度のBSAおよびRNase阻害剤を調製することは有用である。FACS コレクション ブロックは、冷却モードにする必要があります。</li>
	<li>核を選別した後、遠心分離機を500xgで4°Cで5分間、試料を濃縮した。 g500-1,500核/μLの濃度を達成するために核洗浄緩衝液の適切な容積で再構成する。すべての上清を取り除こうとしないでください。そうすることで核が失われます。</li>
	<li>最終的なカウントにヘモサイトメーターとDAPI染色アリコートを使用し、核を視覚化します。その後、メーカーのプロトコルに従ってsnRNA-seqをすぐに進めます。</li>
</ol>

<ol><li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+importance+of+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).</li>
<li>van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-activated+brown+adipose+tissue+in+healthy+men%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cold-activated brown adipose tissue in healthy men.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).</li>
<li>Virtanen, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+brown+adipose+tissue+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional brown adipose tissue in healthy adults.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).</li>
<li>Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+evidence+for+active+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).</li>
<li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+incidence+of+metabolically+active+brown+adipose+tissue+in+healthy+adult+humans%3A+effects+of+cold+exposure+and+adiposity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity.</a> Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).</li>
<li>Yoneshiro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruited+brown+adipose+tissue+as+an+antiobesity+agent+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).</li>
<li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+brown+adipose+tissue+by+a+%CE%B23-adrenergic+receptor+agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist.</a> Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).</li>
<li>Song, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-+and+high-thermogenic+brown+adipocyte+subpopulations+coexist+in+murine+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).</li>
<li>Cinti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CL316%2C243+and+cold+stress+induce+heterogeneous+expression+of+UCP1+mRNA+and+protein+in+rodent+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+stress+induces+glycolytic+beige+fat+formation+via+a+myogenic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state.</a> Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PloS One. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Transcriptional+and+Epigenomic+Profiling+from+Specific+Cell+Types+within+Heterogeneous+Tissues+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li>
<li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige%2Fbrite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).</li>
<li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+digital+transcriptional+profiling+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells.</a> Nature Communications. 8, 14049(2017).</li>
<li>Pollen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-coverage+single-cell+mRNA+sequencing+reveals+cellular+heterogeneity+and+activated+signaling+pathways+in+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex.</a> Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).</li>
<li>Hayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+full-length+total+RNA+sequencing+uncovers+dynamics+of+recursive+splicing+and+enhancer+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs.</a> Nature Communications. 9 (1), 619(2018).</li>
<li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+chromatin+landscapes+of+human+immune+cell+development+and+intratumoral+T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion.</a> Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+epitope+and+transcriptome+measurement+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells.</a> Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).</li>
<li>Peterson, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+quantification+of+proteins+and+transcripts+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells.</a> Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).</li>
<li>Gaublomme, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+multiplexing+with+barcoded+antibodies+for+single-nucleus+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics.</a> Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).</li>
</ol>

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

単一の核を単一の核を単離し、脂肪組織の不均一性を研究する簡単で、強い方法が提示される。このワークフローは、組織全体のRNAシーケンシングと比較して、細胞の不均一性および集団特異的マーカーの公平なビューを提供します。これは、アディポサイト生物学、分子代謝、肥満研究の進歩のために重要かつ革新的です。
このプロトコルは、snRNA-seqのダウンストリームアプリケーションに特に最適化されています。MoFlo XDP高速ソーターで健康な核の単離を達成するための「クリーンアップ」ステップは、核膜の完全性を維持しながら、粗懸濁液から破片および凝集物を完全に除去する。したがって、これは液滴形成における捕獲効率を高め、検出された遺伝子の数を失うことなく、わずか1回の実行から数千個の単核転写体を回収する。より多くの調査対象の単一核または細胞を提供する液滴ベースの単一細胞プラットフォームに加えて、ソーターベースのマイクロプレートおよびFluidigmC1プラットフォーム15も、トランスクリプトーム16のより...

研究は、茶色の脂肪組織(BAT)がエネルギーを消散する顕著な能力を有することを示している。げっ歯類とヒトの両方に、ベージュの藍胞と古典的な褐色のアディポサイトの両方に、明確な発達特徴を持つ熱原性のアディポサイトの2種類が存在する。古典的な褐色脂肪細胞は主に肩間BATデポに位置するが、ベージュ脂肪細胞は、慢性低温暴露のような特定の生理学的手がかりに応答して白い脂肪組織(WAT)に散発的に出現する、「褐変」または「ベイジング」と呼ばれるプロセスである。高度なイメージングを使用することにより、成人の人間がUCP1+ BATの実質的な拠点を持つことは明らかになっています, 特に上陸領域1,,22,3,,4.成人ヒトBATの量は、脂肪性と逆に相関し、慢性低温暴露55、6または6β3アドレナリン受容体アゴニスト7などの外部手がかりによって増加させることができる。BAT媒介エネルギー支出は、肥満と闘うための実行可能なアプローチを提供するかもしれない。
最近まで、熱原性のアディポサイトは均質な集団と考えられてきました。しかし、研究は、発達起源、基質の使用法、およびトランスクリプトーム88、9、109において明確である複数のサブタイプまたは亜集団の存在を10明らかにした。例えば、熱発生のためにグルコースを優先的に使用するベージュアディポサイトの一種である、g-ベージュアディポサイトは、最近10記載された。褐色およびベージュ脂肪組織における細胞タイプの不完全な理解と特定のマーカーの欠如は、その生物学的機能を研究するための重要な障壁を構成する。
細胞の亜集団を単離するための伝統的な方法は、少数の既知のマーカー遺伝子の発現に基づいています。単細胞ゲノミクスの最近の進歩により、単一細胞の全球遺伝子発現データを使用して、組織中の亜集団数の公平な推定値を提供することが可能です。このプロトコルの最終的な目標は、単一細胞の分解能で様々な発熱刺激の下ですべての脂肪組織サブタイプを決定することです。他の組織や細胞の種類とは対照的に、脂肪組織の細胞サブタイプを決定することは、脂質で満たされた脂肪細胞の脆弱性のために困難です。本論文では、下流の適用からsnRNAシーケンシングに対して、脂肪組織から単一核を分離するための堅牢なプロトコルを紹介する。重要なことに、よく一致した単核RNAシーケンシング(snRNA-seq)と単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)データセットを比較する最近の文献は、snRNA-seqが細胞型検出におけるscRNA-seqに匹敵し、脳11のような複雑な組織の細胞カバレッジにおいて優れていることが明らかになった。このプロトコルは、Rosenららによって脂肪組織に最適化された密度勾配遠心分離法をMoFlo XDP高速ソーターと核「クリーンアップ」ステップと組み合わせたものです。代表的な結果に見られるように、マウスの肩間ブラウン脂肪組織から7,500個の単一核の分析は、一見均質な褐色脂肪細胞内の複数の細胞タイプを同定した。全体として、この単純で堅牢なプロトコルは、脂肪細胞および脂肪居住細胞の組織レベルの組織化、サブタイプ特異的マーカー遺伝子の同定、および脂肪選択的ノックアウト/トランスジェニックマウスの開発表現型を研究するために適用することができる。

<table><tbody><tr><td>autoMACS リンス液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>PBS EDTA; 滅菌フィルター</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1595</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>セルフィルター 100 &mu;m</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>セルフィルター 40&mu;m</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics (30 &mu;m)</td><td>シスメックス</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ D</td><td>ロシュ</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL 全自動セルカウンター</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>ディスパーゼII</td><td>ロシュ</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Σ</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers(30 & マイクロ;m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td>スタッカブルフィルター</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>MoFloXDP セルソーター</td> ベ<td>ックマン・コールター</td><td>ML99030</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>プロテクター RNase 阻害剤</td><td>ロシュ</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>フィッシャー</td><td>S5-3</td><td></td></tr></tbody></table>

単細胞ゲノムアプリケーションのための脂肪組織核の分離

Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications

ブラウンとベージュの脂肪は、UCP1(アンカップリングプロテイン-1)依存性および独立経路による熱発生のためのエネルギーを放散する特殊な脂肪組織である。最近まで、熱原性アディポサイトは均質集団と考えられていた。しかし、最近の研究では、発生起源、基質使用、およびトランスクリプトームに異なる複数のサブタイプまたは亜集団が存在することを示しています。単細胞ゲノミクスの進歩にもかかわらず、脂質で満たされた脂肪細胞の脆弱な性質のために、脂肪組織を細胞サブタイプに公平に分解することは困難であった。提示されたプロトコルは、RNAシーケンシングを含む下流のアプリケーションのための脂肪組織からの単一の核の効果的な分離によってこれらの障害を回避するために開発されました。細胞の不均一性は、RNAシーケンシングおよびバイオインフォマティクス解析によって分析することができます。

未分類のアディポサイト核には、下流の単一細胞RNAシーケンシングにおいてノイズと高いバックグラウンドを生み出す破片およびダブレットが含まれています。FACS ゲート戦略の代表的な例を図 1に示します。核は、まず順方向散乱(FSC)と側面散乱(SSC)(A)に基づいて選択し、次に、SSC(B)の幅と高さの組み合わせにB基づいてシングルを選択した。最後に、DAPI 陽性イベントのみが選択され、コレクション バッファ (C) に並べ替えられました。このワークフローは、核凝集体と細胞破片を最小化した高度に精製された単核を提供する(図2)。
選別された核の完全性を確認するために、試料の小さなアリコートを、DAPI染色後に顕微鏡で検査した。核膜は...

この出版物は、成熟したアディポサイトからの核の単離、蛍光活性化分類による精製、および単一細胞レベルのトランスクリプトミクスのためのプロトコルを記述する。

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent ...

脂肪細胞の脆弱な性質のために、脂肪組織のサブタイプへの分解は困難であった。このプロトコルは、単一核の効果的な単一の単一の分離によってこれを克服するために開発されました。このワークフローは、核凝集体と細胞破片を最小限に抑えた高度に精製された単一核を提供します。これは、数千の細胞の単一細胞転写プロファイリングに有利である。このシンプルで堅牢なプロトコルは、脂肪の居住細胞における脂肪細胞の組織レベルの組織を研究するために適用することができる。そして特に、フェノタイピングの開発に、ノックアウトおよびトランスジェニックマウスを脂肪分する。このプロトコルの視覚的なデモンストレーションは、脂肪細胞の処理にあまり経験がない人が脂肪異質性を複製し、洞察できるように非常に重要です。マウスから脂肪組織を採取した後、ペーパータオルで乾かして、きれいな皿に入れます。消化バッファーに塩化カルシウムを加え、最終濃度の 10 mM にします。次に、組織に少量を加え、十分にミンチします。調製した消化バッファーの約半分の量をひき肉に加えます。そして、血清ピペットを使用して、サンプルを50 mL遠心分離管に移します。残りのバッファーで皿を洗い、50 mLチューブに加えます。サンプルを数回上下にピペットします。その後、200〜210rpmで振りながら摂氏37度で12〜15分間インキュベートします。インキュベーション後、1~1体積比でサンプルに0.5%BSAを加え、ピペットでよく混ぜます。サンプルを室温で5分間5分間遠心分離し、上にアディポサイト画分を残してストロモ血管分率を回転させる。400 m のセル フィルターを使用して、上端分を 50 mL チューブにフィルターします。次に、フィルターをチューブの上に逆さまにして、0.5%BSA を使用して新しいチューブにアディポサイトを移してフィルターを逆洗浄します。BSAの総容積を10〜15mLにし、血清ピペットでサンプルを上下にピペットします。その後、室温で5分間300 xgで再び遠心分離する。遠心分離後、広いボアピペットチップを使用して、サンプルの最上層を氷上の新しい冷蔵チューブの上にある100mセルフィルターに慎重に移します。十分な量の核調製バッファーでフィルターをリンスし、それを廃棄します。このステップから、氷の上にサンプルを保管し、迅速に作業します。サンプルを氷の上に2分間断続的に反転させ、チューブを混ぜます。その後、1000 xgで遠心分離機、摂氏4度で10分間。上清を取り除き、ペレットを1mLの核調製バッファーに再懸濁させる。古いチューブの壁に触れないように、清潔なマイクロ遠心分離チューブにサンプルを移します。L RNase阻害剤あたり0.6単位を加え、混ぜます。次いで、サンプルをさらに10分間遠心分離する。上清を取り除き、ペレットと1mLの核洗浄バッファーを再懸濁します。積み重ね可能な30 mフィルターを使用して、サンプルをクリーンチューブにダブルフィルターします。次いで、約300Lの核洗浄緩衝液でフィルターを洗浄する。健康な核の正常な単離を確認するには、サンプルの小さなアリコートをトリパンで染色し、自動細胞カウンターを使用して平均死んだ大きさと死んだ細胞の割合を評価する。DAPIを用いた試料の小さなアリコートに染色し、20倍以上の目的で顕微鏡下で検査する。核は丸く、無傷の核膜を有するべきである。白い矢印は、無傷の膜のない核を示す。FACSで核を片付けた後、摂氏4度で5分間500 xgの遠心分離機で濃縮してこのサンプルを濃縮します。次いで、それを適切な量の核洗浄緩衝液に再構成する。L濃度当たり50~1500個の核を達成し、単細胞核RNAセクを進める。細胞の破片およびダブレットを除去するために、アディポサイト核は核凝集物および多重を除外するためにサイズおよび粒度のために分類される。最後に、DAPI ポジティブイベントのために。このグレーディング戦略は、凝集および破片を最小限にする高度に精製された単核をもたらす。顕微鏡検査で検査する場合、ソートされた核は丸く、無傷の膜を持つべきである。核の精製に成功した場合、褐色のアディポサイトのマーカー遺伝子である新生Ucp1 mRNAのプライマーを用いたリアルタイムqRT-PCRでも行うことができます。クロムプラットフォームは、マウス間肩蓋ブラウン脂肪組織から7500核のトランスクリプトームを決定した。t-SNE次元低減およびk-平均クラスタリングで7種類の細胞が明らかになった。すべてのクラスターは、Fabp4、パンアディポサイト遺伝子およびサブセットを発現し、高レベルのUcp1 mRNAを発現した。核は単離され、その後確認されたが、このプロトコルは、10xゲノミクスからクロムを含む事実上任意の単細胞レベルの遺伝子発現プラットフォームに供することができる。

isolation-adipose-tissue-nuclei-for-single-cell-genomic

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

原因肥満や他の併存疾患の間で抜本的なと負の接続に、ロールの脂肪の研究は、病気で再生し、全体的な健康が保証されています。私たちは、 その場で、そしてインビトロ方法で使用して脂肪の研究を可能に脂肪デポの単離および切除するためのプロトコルを提示する。...

マウス脂肪デポのローカライズ、識別、および切除

単核単離は、細胞膜の解離および洗剤ベースの透過性、最適化を必要とし、技術的なアーティファクトを導入する傾向があるステップに依存しています。我々は、単核RNA-seq(snRNA-Seq)またはATAC-seqに適した核を得て、組織全体から直接無傷核を迅速に単離するための洗浄剤および酵素フリープロトコルを実証する。...

洗浄剤と酵素を含まない方法を用いた組織全体からの核分離

このプロトコルは、蛍光活性化細胞選別または免疫磁気ビーズ分離により、マウス腹腔内白色脂肪組織(WAT)デポから脂肪形成および線維炎症性間質細胞亜集団を単離するための技術的アプローチを説明しています。...

マウス腹腔内脂肪貯蔵所からの脂肪形成性および線維炎症性間質細胞亜集団の単離

この研究では、遺伝子およびタンパク質発現解析のためにマウス褐色脂肪細胞を単離する新しい方法について説明します。...

遺伝子およびタンパク質発現解析のためのマウス肩甲間褐色脂肪組織からの褐色脂肪細胞の単離(英語)

ここでは、髄質腎細胞タイプの表現を改善し、酵素組織解離による遺伝子発現アーティファクトを回避する凍結マウス腎臓から高品質の核を単離するためのプロトコルを提示します。...

単核RNAシーケンシングのための成体マウス腎臓からの核分離

ここでは、一核RNA-seq、ATAC-seq、およびジョイントマルチオミクス(RNA-seqおよびATAC-seq)について、瞬間凍結されたアーカイブされた肝臓組織から核を単離するためのプロトコルを紹介します。...

シングルセルマルチオミクスのための瞬間凍結肝臓組織からの核の単離

トランスジェニックレポーターマウスから単離された脂肪組織との核ソーティングを使用して、脂肪細胞上で特異的にトランスポザーゼアクセス可能なクロマチン(ATAC-seq)を核蛍光標識でアッセイするためのプロトコルを紹介します。...

蛍光活性化核ソーティングを用いた脂肪組織を用いた脂肪細胞特異的ATAC-Seq

ここでは、細胞核の調製を説明するプロトコルを提示します。心臓組織のマイクロ解剖および酵素的解離の後、前駆細胞を凍結し、続いて純粋な生細胞を単離し、単一核RNAシーケンシングおよびハイスループットシーケンシング分析によるトランスポゼーゼアクセス可能なクロマチンの単一核アッセイに使用しました。...

シングルセル分解能でのエピゲノムおよび遺伝子発現プロファイリングのためのマウス心臓前駆細胞からの核分離(英語)

この研究では、下流の単一核RNAシーケンシングのために、凍結した哺乳類組織から高品質の核を単離するための、シンプルで迅速、かつ部分的に自動化されたプロトコルについて説明しています。...

単一核の配列のための凍結した哺乳類ティッシュからの単一核の隔離のための簡単で、速く、部分的に自動化されたプロトコル

筋肉間脂肪組織(IMAT)の生物学は、ヒト組織のアクセス性が限られているため、ほとんど未踏です。ここでは、このユニークな脂肪貯蔵庫の細胞組成を特定するための単一核RNAシーケンシングのための凍結ヒトIMATの核単離とライブラリ調製のための詳細なプロトコルを紹介します。...

ヒト筋肉間脂肪組織からの核の単離と下流の単一核RNAシーケンシング

学ぶ脂肪組織からの単一核分離法。成熟脂肪細胞の脆弱性を克服し、核凝集体と細胞残渣を最小化して高品質な単細胞トランスクリプトーム解析を可能にするロバストなプロトコルです。

単細胞ゲノムアプリケーションのための脂肪組織核の分離

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