Name: シロイヌナズナのm5C修飾を研究するメチル化RNA免疫沈降アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 学ぶメチル化RNA免疫沈降アッセイ（MeRIP）を用いてシロイヌナズナのm5C修飾を探索する方法。アンチM5C抗体による免疫沈降と次世代シーケンスで、メチル化転写産物を効率的に同定し、RNA修飾の機能解析に役立つ。

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この研究は、EUのホライズン2020研究・イノベーションプログラム(グラント・フィレション)の下で欧州研究評議会(ERC)から資金を受け取ったプロジェクトであるPLAMORFを通じて、F.K.へのEMBO長期フェローシップであるE.S.へのIMPRS PhD奨学金、およびMPI-MPP内部資金によって支されました。著者らは、フェデリコ・アペルトのバイオインフォマティクス分析と原稿に関するコメント、バイオインフォマティクス分析にマチュー・バハインとアミラ・クラムディに感謝したいと考えている。

1. RNAの準備
<ol><li>200mgの植物組織を液体窒素で粉末状に粉砕し、手順全体を通して組織が凍結したままであることを確認します。</li>
	<li>酸グアニジニウムチオシアネートフェノール-クロロホルム抽出プロトコルに従って所望の植物組織からRNAを抽出します。相分離中にRNAをDNAで汚染する可能性を減らすには、クロロホルムの代わりに1-ブロモ-3-クロロプロパンを使用してください。<ol>
<li>グアニジンチオシアネートと酸フェノールを含むRNA抽出試薬を1mL加え、粉砕した植物組織(100mg組織あたり500μL)を加える。反転してよく混ぜ、すべての組織が濡れているかどうかを確認します。室温で10分間インキュベートし、リボヌクレオプロテイン複合体を解約する。</li>
		<li>4°Cで12,000 x g で10分間遠心分離機を使用し、上清を新しい1.5 mLチューブに移します。</li>
		<li>1-ブロモ-3-クロロプロパン(500 μL RNA抽出試薬あたり100 μL)とボルテックスを200 μL激しく加えます。</li>
		<li>遠心分離機は4°Cで12,000 x g で15分間、上水相(約500μL)を新しい1.5 mLチューブに移します。</li>
		<li>イソプロパノール(500μL)1ボリューム、3M酢酸ナトリウムpH5.5(50μL)の0.1容量を加え、反転して10分を-20°Cで沈殿させることでよく混ぜます。 注: RNA沈殿を高めるために酢酸ナトリウム(NaOAc)の使用をお勧めします。このプロトコルは、数時間または一晩にわたってRNAの沈殿を延長することによって、この時点で一時停止することができます。</li>
		<li>4°Cで12,000xgで30分間遠心分離機を出し、上清を捨てます。</li>
		<li>ペレットを80%のEtOHの500 μLで2回洗浄し、遠心分離機を4°Cで12,000 x g で5分間洗浄し、廃棄します。</li>
		<li>ペレットを500 μL 99%のEtOHで1回洗浄し、遠心分離機を4°Cで12,000 x g で5分間洗浄し、廃棄します。</li>
		<li>ペレットを5~10分間乾燥させ、RNaseフリーH2Oの30μLに溶解します。 注: 代わりに、任意の RNA 抽出プロトコル (カラムベースのシステムなど) を使用します。DNase のダイジェストがプロトコルに含まれている場合は、次の手順でスキップします (ステップ 1.3)。</li>
	</ol></li>
	<li>RNA濃度を測定し(分光光度計を使用して)、DNaseでRNAを20μg消化します。 注:DNAはm5Cに富んでおり、抗体はDNAとRNAを区別しません。<ol>
<li>典型的なDNase反応では、10μgのRNAを50μL反応で処理します。以下の成分を混合し、37°Cで30分間反応をインキュベートします。 10 μg の RNA x μL 10x DNaseバッファ5 μL DNase 1 μL (2単位) RNaseフリーH2O最大50 μL</li>
		<li>適切な量のDNase不活性化試薬を添加するか(DNaseキットに含まれている場合、製造元の指示に従って)、またはクリーンアップ手順(例えば、カラム精製またはフェノール/クロロホルム抽出)を行うことにより、酵素を除去します。</li>
	</ol></li>
	<li>毛細管電気泳動により単離されたRNAの品質と純度を確認し、RNA完全性数(RIN)が7より高い場合に進み、サンプルが良好な品質であることを確認します。</li>
	<li>オプション:リボソームRNAを除去し、rRNA除去キットを使用し、製造業者のプロトコルに従ってmRNA含有量のサンプルを濃縮します。<ol>
<li>rRNAの枯渇反応のために前のステップからDNase処理されたRNAを使用してください。RNAの総量が反応に示唆された最大量を超える場合は、複数の反応を行う。</li>
		<li>なお、rRNA枯渇後に回収されるのは、入力量の5~10%に過ぎないことに注意してください。rRNAが枯渇したRNA(全サンプルの量)を続行し、合計RNAを指すため、以下のステップで言及されている量を無視します。 注: 使用可能な rRNA 枯渇方法の比較と説明については、参照38,39,40を参照してください。rRNAは、総RNAの主要な部分であり、多くの生物で5Cメチル化されています。</li>
	</ol></li>
	<li>コントロールRNA配列として使用するインビトロ転写物(IVT)を事前に準備し、サンプルに追加します。<ol>
<li>インビトロ転写キットを使用して2つの異なるIVTを生成し、1つは非メチル化ヌクレオシドを有し、もう1つはrCTPが5-メチル-rCTPに置き換えられ、それぞれMeRIPで陰性および陽性の対照として機能する。調製された転写物は 、EGFP および レニラ ルシファーゼのものである。 注:ITは、あなたが調べている生物のトランスクリプトームに存在してはいけません。もし、IVT が同じテンプレート(例えば、両方の EGFP)からのものなら、2 つの異なるサンプルに正と負のコントロールを加えます。それらの配列が異なる場合(例えば、EGFPとレニラ)、それらは同じサンプルに加えることができます。</li>
		<li>各サンプルのスパイクは、コントロールとして、RNAの3μgあたり0.1 ng IVTあたり。</li>
	</ol></li>
	<li>RNAを約100nt断片に超音波処理します。 注:RNAせん断の条件は事前に調整する必要があり、それらは各超音波処理器によって異なります。ここで使用されるモデルの場合、超音波処理は、次の条件で行われます:ピーク電力174、デューティファクター10、サイクル/バースト200、17分。<ol>
<li>全サンプルに対して同量のRNAを超音波処理し、サンプル当たり少なくとも12 μgのRNAを80 μLの総容積(最小60 μL、最大100 μL)で、RNaseフリーH2Oで満たします。</li>
	</ol></li>
	<li>毛細管電気泳動により、超音波処理の効率とRNAサンプルの濃度を確認します。断片化したRNAの平均サイズは約100ntでなければなりません。</li>
</ol>2. メチル化RNA免疫沈降(MeRIP)
<ol><li>低結合チューブでは、9 μgの超音波処理された RNA と RNase フリー H2O を 60 μL まで加えます(濃度に応じてそれ以上)。</li>
	<li>水浴中のRNAを70°Cで10分間加熱し、氷水ミックスでさらに10分間冷却して二次構造を解約します。</li>
	<li>サンプルを3つの部分に分割します:3分の1(ステップ2.1で60 μLを取った場合は20μL)を入力サンプルとして-80°Cの別のチューブに保存します。残りの40 μLをRNaseフリーH2Oで860 μLまで充填し、次にIP用とモックコントロール用(各430μL)の2つの低結合チューブに分割します。</li>
	<li>両方のチューブに追加: 50 μL の 10x MeRIP バッファ 10 μL の RNase 阻害剤 モックサンプル中のH2Oの10 μL当たりIPサンプルのα-m5C抗体(10 μg)の10 μL 注:以前に使用した抗体クローンは、もはや市販されていません。しかし、任意の抗5-メチルシトシンモノクローナル抗体は、同様に動作する必要があります。抗体は、MeRIP11,23に使用する前に特異性についてテストする必要があります。</li>
	<li>チューブをパラフィルムで密封し、4°Cで12〜14時間インキュベートし、頭上の回転を行います。</li>
	<li>翌日、結合のためにプロテインG磁気ビーズを調製する。<ol>
<li>各チューブ(IPまたはモックコントロール)に40 μLのビーズを使用します。15 mLチューブにビーズの合計量(例えば、2つのIPと2つのモックサンプルの場合は160 μLが必要)を15 mLチューブに加え、サンプルあたり800 μLの1x MeRIPバッファー(チューブx 800 μLバッファーの#、例えば、2.2mL、および2 IP 2およびIP 2)で3回洗浄します。</li>
		<li>頭上の回転で5分間室温で洗浄を行い、磁気ラックの助けを借りてビーズを収集し、洗浄バッファーを廃棄します。3回目の洗浄後、ビーズを取り込んだビーズの初期量と同じ体積の1x MeRIPバッファ(例えば、1x MeRIPバッファの160 μLの160 μL、2つのIPおよび2つのMockサンプル)でビーズを再中断します。 注:使用されるプロテインGビーズの量は、特定の抗体タイプのビーズの結合能と使用される抗体の量によって決定されます。この場合、ビーズは約8μgのマウスIgGのビーズ1mgおよび30mg/mL濃度の結合能力を有する。したがって、40 μL は約 9.6 μg の抗体を結合するのに十分です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>各IPおよびMockサンプルに40μLの再懸濁ビーズを加え、オーバーヘッド回転で4°Cでさらに2時間インキュベートします。</li>
	<li>チューブを磁気ラックに1分間置き、上清を捨てるか、コントロール(非結合RNAサンプル)として保存します。</li>
	<li>0.01%Tween 20に供給される1x MeRIPバッファーの700 μLで再懸濁し、オーバーヘッド回転で室温で10分間インキュベートしてビーズを5回洗浄します。</li>
	<li>洗浄したビーズを200 μLのプロテイナーゼK消化バッファーに再懸濁し、3.5 μLのプロテナーゼ K. インキュベートを50°Cで3時間加え、800 rpmで振る。時折、インキュベーション中にビーズの堆積物が形成されている場合は、チューブの底部を手動でフリックします。</li>
	<li>800μLのRNA抽出試薬を添加し、酸グアニジニウムチオシアネートフェノール-クロロホルム抽出プロトコルを添加してRNAを抽出し、ステップ1.2のように継続する。RNAペレットの視認性を高めるために、沈殿工程でイソプロパノールに着色共沈殿剤を添加することができる。RNaseフリーH2Oの20 μL(またはステップ2.3で保持される入力ボリュームと等しい)でペレットを再懸濁します。</li>
</ol>3. ダウンストリーム解析
<ol><li>50 の底読み取り長さ (SE50) を持つシングル エンドシーケンスの入力および IP サンプルを送信します。</li>
	<li>カットアダプト41 を使用してトリム3'エンドアダプタと48 nt未満の読み取りを破棄します。</li>
	<li>ミスマッチの場合は6%、最大イントロンサイズは10 kbのSTAR42 を使用して、トリミングされた読み取りをシロイヌナズナシスゲノム(TAIR10アノテーション)にマッピングします。さらに分析するために、一意にマップされた読み取りを保持します。</li>
	<li>2つの異なる方法を使用して入力と比較してIPサンプル中の濃縮されたRNA断片を同定し、両方によって有意に濃縮されたものを考慮する。<ol>
<li>まず、プールされた IP と入力の MACS2 ピーク呼び出し元43 を使用して MeRIP-seq ピークを検出します。</li>
		<li>第二に、マイヤーら22 およびヤンら17に記載されているMeRIP-seqピークコールの分析に従ってください。<ol>
<li>カスタム R スクリプトを使用して、ゲノムを別の 25 nt ウィンドウに分割し、最後にマップされたヌクレオチドの位置に基づいて各ウィンドウの一意にマッピングされた読み取りの数をカウントします (読み取りは 100 nt RNA フラグメントから発生するため)。</li>
			<li>フィッシャー正確検定で入力と比較して、IPサンプルで大幅に富んだウィンドウを計算します。</li>
			<li>少なくとも 2 つの連続したウィンドウにまたがる大幅に豊かなピークを維持し、1 つのウィンドウだけをカバーするピークを破棄します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>両方の方法で見つかった有意に富んだピークを持つゲノムのアポイントトされた領域(トランスクリプト)を特定する。</li>
	<li>または補完的に、特定のRNA標的のIPサンプル内の濃縮をテストします。<ol>
<li>ランダムな六角形でRNA(入力、IP、モックサンプルの同じボリューム)を逆に書き起こします。</li>
		<li>ΔΔCt法を用いて入力、IP、モックを比較して、選択したターゲットに対して定量的リアルタイムPCRを実行します。 注: 生成された製品は、平均フラグメンテーションサイズであるため、100 bp 以下でなければなりません。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示する利益相反を持っていません。

RNAはエピトランスクリプトーム44を形成する100以上の異なる塩基修飾4を運ぶ。これらの変更は、翻訳と信号の規制の追加の層を追加します(5、6,8,20,45,46でレビュー).初期の研究では、RNA28,47上の転写後修飾の存在を検出することができたが、エピトランスクリプトロミクスの役割を理解するために特異的な改変RNAを同定する必要がある。MeRIPは、転写物全体の21,22をRNAメチル化部位をマッピングする方法として設計された。特定の抗体が利用可能な場合は、任意の修飾に適合させることができます。
このプロトコルの主な強みは、RNAとユーザーにとって比較的単純で安全であること(例えば、5-azaCは植物およびヒトにとって非常に有毒である)、配列または酵素情報を修飾する必要がなさることです。さらに、IPによるメチル化RNAの濃縮は、濃縮工程を含まない亜硫酸塩シーケンシングとは異なり、検出される低い豊富なmRNAの可能性を高める。MeRIPの2つの連続ラウンドが行われると、メチル化部位を含むRNA断片の濃縮がさらに22に増加する。MeRIPの限界の1つは、特にmRNAメチル化試験に適用される場合、アッセイの入力として必要な大量のRNAです。リボ枯渇(またはポリ(A)濃縮- ステップは、重く修飾リボソームRNAによって引き起こされる背景を減少させますが、それは総RNAの90%以上を除去します。DNAは、5メチル化されたシトシンが豊富であるため、完全に除去する必要があります。もう一つの欠点は、メチル化の正確な位置の低い解像度です。抗体によるインキュベーション前のRNAの超音波処理は、100〜200ヌクレオチドへの修飾を含む領域を絞り込むことによって、この方向に向かって役立ちます。MeRIPを深いシーケンシングと組み合わせると、シーケンス読み取りが潜在的なメチル化部位の周りにガウス分布を形成するにつれて、m5Cサイト予測の解像度が高くなります。さらに、抗体の特異性は、アッセイの前に確認する必要があり(例えば、RNAドットブロットアッセイで、修飾されたヌクレオチドで合成されたオリゴで行われる)が、しかし、抗体が実際に密接に関連する修飾(例えば、m6Aおよびm6Am)を区別できる範囲は、フィールド48、49の議論のポイントである。さらに、高度に構造化されたRNAは、抗体-抗原相互作用を妨げる可能性があり、IP以前のRNAの断片化と変性に主に対処される別の制限である。それどころか、二次構造によっても影響を受ける亜硫酸塩シーケンシングは、断片化ステップを含まないし、これは、バイサルファイトシーケンシング16、16によって予測されるm5C部位とmRNAとの間に不一致を引き起こす理由の1つかもしれない。他のシトシン修飾(例えば、hm5C)も、亜硫酸水素塩媒介脱アミノ化35に対して耐性である。
MeRIP-seqの改変には、光活性化可能なリボヌクレオシド(光架橋支援m6A-seq、PA-m6A-seq 50)の導入により架橋ステップが含まれるか、またはUV光を使用してIP後に抗体RNA架橋を作成する(miCLIP49、個々のヌクレオチドリューション分解能とは異なる方法)将来的には、RNAメチル化に関する知識が蓄積するにつれて、修飾酵素および/またはメチル化が出現するコンセンサス配列に基づいて、よりターゲットを絞ったアプローチが望ましいかもしれません。リーダータンパク質の同定は、転写後修飾の分子およびシグナル伝達機能の理解に不可欠です。ナノポアシーケンシング技術は、RNA17の事前処理を行うことなく改変ヌクレオチドを直接同定することが可能であるが、配列深度およびバイオインフォマティクス解析に関する改善の余地はまだある。全体として、MeRIP-seqは現在、メチル化RNA転写物を同定するための確立された、信頼性の高い、公平なアプローチです。

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61231">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis</a>. The author list was updated.
The author list was updated from:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua
to:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Vincent Colot3, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua 
3Biologie de l&#39;Ecole Normale Sup&#233;rieure (IBENS),&#160;Paris, France

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61231">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis</a>. The author list was updated.

Erratum: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

生命の3つの王国すべてにおいて、RNA種は転写後修飾を受け、これらの機能的に関連する生化学的修飾に関する研究を「エピトランスクリプノミクス」と呼ぶ。エピトランスクリプトミクスは成長分野であり、RNA分子の修飾を研究し、マッピングするために様々な方法が開発されている(1,2でレビュー)。100以上のRNA修飾が発見され、rRNA、tRNA、その他のncRNA、ならびにmRNA3、4で検出された。tRNAおよびrRNAにおける化学的に多様な転写後修飾の存在および機能は5、6、7、8に広く研究されているが、最近になってmRNA修飾が特徴付けられている。植物において、キャップ構造9、m1A10、hm5 C11、12、および排尿13においてm7Gを含む多くのmRNA修飾がこれまでに同定されている。しかし、唯一のm6A A10、14、15、m5C11、16、17、およびシロイヌナでは写写し全体にマッピングされている。転写後mRNA塩基修飾は、いくつかの発達過程に関与する19,20.
エピトランスクリプソミクスで最も一般的に使用されるアプローチの1つは、メチル化されたRNA免疫沈降と深いシーケンシング(MeRIP-seq)です。MeRIP-seqは、哺乳類細胞21,22においてm6Aを研究するために2012年に開発された。所望の修飾のために抗体を使用する必要があり、修飾されたヌクレオチドを運ぶRNA断片を濃縮することを目的とする。通常、深いシーケンシングを行い、濃縮フラグメントまたは定量PCRを同定してマッピングし、特定のRNA標的を検証します。MeRIPの精度は、同様の修飾に対して修飾されたヌクレオチドを認識する抗体の特異性に基づいている(例えば、m5Cおよびhm5C11、23)。m6Aに加えて、MeRIP-seqは、いくつかの生物11、17、23、24、25のm1Aおよびm5C RNAメチル化を研究するためにも適用されている。
第5炭素位(m5C)におけるシトシンのメチル化は、最も一般的なDNA修飾26,27であり、最も一般的なRNA修飾の1つも3,4である。m5Cは1975年28年に真核生物mRNAで検出されたが、最近になってようやく、修飾転写をマッピングすることに焦点を当てた研究を行い、コーディング中および非コーディングRNA11、16、17、23、29、30、31、32、33、34をコーディングした。
m5 CRNA研究で使用される代替方法としては、非メチル化シトシンからウラシルへの化学変換(バイサルファイトシーケンシング)および既知のRNAシトシンメチルトランスファー酵素のRNA標的への不可逆的結合(miCLIP、アザ-IP)に基づく免疫沈降アッセイが含まれます。簡単に言えば、バイサルファイトシーケンシングは、5メチル化シトシンの特徴を利用して、未改変シトシンをウラシルに脱アミノ化する亜硫酸ナトリウム処理に耐性を持つ。この方法は、最初にDNA用に開発されたが、RNAにも適応しており、多くの研究は、RNA16、23、29、32、34、35のm5C部位を検出するためにこのアプローチを選択した。miCLIPとaza-IPの両方が、RNAシトシンメチルトランスフェリン酵素の以前の知識とそれぞれの抗体の使用を必要とします。miCLIP(メチル化個別-ヌクレオチド分解能架橋および免疫沈降)の場合、メチルトランスセリン酵素は、RNA基質に結合するが、放出できない30になるように単一のアミノ酸変異を運ぶ。アザ-IP(5-アザシチジン媒介RNA免疫沈降)において、外因的に提供された5-azaCがRNAポリメラーゼによって標的RNA分子31に組み込まれるとき、5-azaCヌクレオシドとRNAシトシンメチルトランスシロール酵素との間に不可逆的結合が形成される。
これらの3つの方法の主な利点は、m5Cの単一塩基分解能マッピングを可能にする点である。さらに、miCLIPおよびaza-IPは、選択したRNAシトシンメチルトランスレシナーゼの特異的標的に関する情報を提供し、転写後RNA修飾のメカニズムおよび役割を深く解読する。しかし、MeRIP-seqアプローチは、以前の知識が必要なくトランスクリプトーム全体のm5C領域を同定することができ、亜硫酸水素塩処理や5azaCによるインキュベーションなどの過酷な化学的および温度条件を回避します。MeRIPおよびバイサルファイトシーケンシングは、二次RNA構造36によって阻害され得る。免疫沈降前のMeRIPアッセイに含まれる断片化ステップは、抗体結合を容易にし、m5C同定の分解能を高めることを目的としています。
言及する価値のあるもう一つの方法は、RNAヌクレオシドの質量分析(MS)である。MSはDNAとRNAの両方であらゆるタイプの修飾を検出し、区別することができます。簡単に言えば、RNAを抽出してDNaseを消化し、脱塩して単一のヌクレオシドに消化する。RNAヌクレオシドは、質量分析計によって分析される。この方法は、各修飾のレベルを定量化するために使用することができ、それは抗体または化学変換に依存しません。しかし、大きな欠点は、RNA修飾の存在に関するバルク情報を提供することです。改変をマッピングするためには、ヒトtRNALeu(CAA)37の場合のように、MSは、特定のRNA分子に関するRNase消化およびシーケンシング情報と組み合わせる必要がある。
ここでは、シロイヌナズナシス17におけるm5C RNAメチル化を研究するために用いられるMeRIPアッセイについて説明し、議論する。

<table><tbody><tr><td>抗m5C抗体</td><td>ZymoResearch</td><td>A3001(販売終了)、A3002が利用可能</td><td>Clone 10G4(販売終了)、7D21が利用可能</td></tr><tr><td>キャピラリー電気泳動用チップと試薬</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>RNA 6000 Nano kit</td></tr><tr><td>Dnase</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td>TURBO DNAフリーキット</td></tr><tr><td>核酸の共沈剤</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td>グリコブルー、15 mg/mL</td></tr><tr><td>In vitro転写キット</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td>T7 RiboMAX 大規模RNA産生システム</td></tr><tr><td>低結合反応チューブ</td><td>Kisker Biotech</td><td>G017</td><td>1.7 ml 微量遠心チューブ</td></tr><tr><td>プロテインG磁気ビーズ</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td>Dynabeads プロテインG</td></tr><tr><td>プロテインアーゼK</td><td>アンビオン</td><td>AM2546</td><td>20mg/mLストック溶液、RNAグレード</td></tr><tr><td>RNase阻害剤</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td>RNasin Plus 40 U/&mu;l</td></tr><tr><td>rRNA除去キット</td><td>Epicentre</td><td>RZPL11016</td><td>Ribo-Zero rRNA除去キット(植物の葉)</td></tr><tr><td>超音波処理チューブ</td><td>Covaris 520045</td><td></td><td>マイクロチューブ AFA ファイバープレスリット スナップキャップ 6x16mm</td></tr><tr><td>RNA抽出試薬</td><td>Ambion</td><td>15596018</td><td>TRIzol reagent</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>キャピラリー電気泳動装置</td><td>Agilent</td><td></td><td>G2939BA 2100 バイオアナライザー</td></tr><tr><td>システム 磁気ラック</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>DynaMag-2</td></tr><tr><td>微量遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>製造中止</td><td>5417R モデル</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Benchmark</td><td>R4040</td><td>RotoBot Mini</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td>S220 集束超音波装置</td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ND-ONEC-W</td><td>NanoDrop OneC</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>GFL</td><td>1012</td><td>1012 インキュベーションバス</td></tr></tbody></table>

シロイヌナズナのm5c修飾を研究するメチル化rna免疫沈降アッセイ

Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

m5 CなどのRNA上の二次塩基修飾は、修飾されたRNA分子の構造および機能に影響を与える。メチル化RNA免疫沈降およびシーケンシング(MeRIP-seq)は、メチル化RNAを濃縮し、最終的に改変されたトランスクリプトを同定することを目的とした方法です。簡単に言えば、超音波処理されたRNAは、5メチル化シトシンの抗体でインキュベートされ、タンパク質Gビーズの助けを借りて沈殿する。濃縮フラグメントは、次にシーケンスされ、潜在的なメチル化部位は、読み取りとピーク検出の分布に基づいてマッピングされます。MeRIPは、任意の事前配列または酵素の知識を修飾する必要はありませんので、任意の生物に適用することができます。さらに、断片化の他に、RNAは他の化学的または温度処理を受けないようにします。しかし、MeRIP-seqは、メチル化領域を少数のヌクレオチドに絞り込むことができるが、他の方法のようにメチル化部位の単一ヌクレオチド予測を提供しない。異なる修飾特異的抗体を使用することで、RNAに存在するさまざまな塩基修飾に対してMeRIPを調整することができ、この方法の可能な用途を拡大することができます。

この方法の概略を図 1に示します。プロトコルの最初の重要なステップは、良好な品質のRNA(RIN≥7)を取得し、約100 ntフラグメントにそれを超音波処理することです。両方のステップの効率は、チップベースのキャピラリー電気泳動機によって調べられる。 図2Aでは、良好なRNAサンプルの代表的なランが示されている。サンプルは、使用するキットの検出範囲(5-500 ng/μL)の範囲内にある濃度を有するために、チップにロードする前に1:10希釈されます。同じサンプルも超音波処理後に実行され、図 2Bに示されています。1つの均一なピークが図の左側にシフトし、約100ヌクレオチドの大きさであることに注意してください。低濃度は、断片化中のRNAの損失によって引き起こされるだけでなく、サンプルの体積が増加したため(60-100 μL、ステップ1.7.1)の両方が原因です。
IPおよびモックサンプルの品質はqRT-PCRによって評価することができる。この目的のために、スパイクインIVTは正と負のコントロールとして機能します:メチル化IVTは、すべてのシトシン位置にm5Cがあり、IPサンプルで高度に濃縮されると予想されます。逆に、非メチル化IVTはIPとモックの間に違いを持つべきではありません。2つのコントロールIVT(EGFP および レニラ ルシメラーゼ)のqRT-PCRアッセイで使用されるプライマーを 表1に示します。実際、 図3に示すように、メチル化IVTの約80%がIPサンプルで回収され、モックでは約2%しか回収されなかった。非メチル化制御では、IPサンプルとMockサンプルの両方で回収率が1%を下回った。これにより、メチル化RNAフラグメントが沈殿し濃縮されたMeRIPの効率が検証され、サンプルを下流分析に使用できることを示す優れた指標となります。さらに、非メチル化IVTのフォールド濃縮(IP対モック比)を閾値として適用して、qRT-PCRアッセイにおける濃縮の有意性を推定することができる。
読み取りをゲノムに合わせた後 (図 4)、ステップ 3.4.1 および 3.4.2 で説明されているピーク呼び出しアルゴリズムが適用され、入力と比較して IP サンプル内で富化された統計的に有意なウィンドウを識別します。これらの窓に対応する配列はさらに、保存されたメチル化関連モチーフ11、17を検索するためにさらに使用することができる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig01.jpg"> 図1:MeRIP-seqプロトコルの概略表現 RNAサンプルは5メチル化シトシンの抗体でインキュベートされ、複合体は結合RNAと一緒に抗体を捕捉するプロテインG磁気ビーズで引き抜かれる。溶出したRNAサンプルは、深いシーケンシングおよびqRT-PCRによって分析されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig02.jpg"> 図2:RNAサンプルの品質分析から代表的な結果を得た。 (A) 修飾された全RNA植物サンプルの代表的なプロファイル。(B)100ntフラグメントへの超音波処理後のRNAサンプルの代表的なプロファイル。毛管電気泳動ソフトウェアからの出力ファイル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig03.jpg"> 図3:コントロールIVTのqRT-PCR分析 メチル化および非メチル化インビトロ転写物は、それぞれMeRIPアッセイの陽性および陰性対照として使用された。免疫沈降後、メチル化されたIVTはIPサンプル(緑色)では高く濃縮されますが、Mockサンプル(抗m5C抗体なし;紫色)には含まれません。非メチル化IVTは、IPとモックの間に濃縮と違いを示さなかった。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig04.jpg"> 図 4: 代表的なトランスクリプトの前後の MeRIP の配置を読み取る。 入力サンプル (上の行) と 2 つの IP 反復 (中央と下の行) 内の特定のトランスクリプトに位置合わせされた読み取り。ブラックボックスは、MACS243 とMeRIP-seq22 ピークコール分析に基づいて、識別された濃縮された50 nt長いウィンドウを示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ターゲット</td>
			<td colspan="2">プライマーペア</td>
			<td colspan="2">製品順序</td>
			<td>製品長</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">エグFP</td>
			<td colspan="2">のために:5'- GGCAACTACAAGACCCGCC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">グッカアカカアガACCCGCGッカガグ グガードトCGAGGGCGACACCCTG グガアッチャクチャクガグガグッガグ</td>
			<td rowspan="2">72 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">レヴ: 5'- GCCCTTCAGCCgATGCGGTT -3'</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">レニラルシメラーゼ</td>
			<td colspan="2">対象: 5'- ガガアタクトクトグガーアック -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">ガガタータアクテクトグガアアク アクトットカッカサーアアトカガガア アクトガアカガアガトテッカGCGC</td>
			<td rowspan="2">75 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">レヴ: 5'- GCTGCAATTCTTGGTCTCTCtAA -3'</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:qRT-PCR分析用のプライマーおよび生成産物に関する情報。
バッファレシピ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/Buffer%20Recipes%20MeRIP.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

メチル化されたRNA免疫沈降アッセイは、メチル化RNAフラグメントを濃縮するために使用される抗体ベースの方法です。深いシーケンシングと結合して、それはm5C修飾を運ぶ転写物の同定をもたらす。

シロイヌナズナのm5C修飾を研究するメチル化RNA免疫沈降アッセイ

Secondary base modifications on RNA, such as m5C, affect the structure and function of the modified RNA molecules. Methylated RNA Immunoprecipitation and ...

メチル化RNA免疫沈降法は、MeRIPとも呼ばれ、全トランスクリプトーム中のメチル化基を同定するために設計された方法です。多くのモデル生物のRNA抽出物に適応させることができます。この方法は簡単で、過酷な化学処理を必要とせず、特定の変数であれば任意のRNA修飾をマッピングするために使用できます。RNAサンプルを抽出するには、まず目的の植物組織サンプル200ミリグラムを液体窒素で粉末に粉砕し、手順全体で組織が凍結したままになるように注意します。次に、グアニジンチオシアン酸と酸性フェノールを含むRNA抽出試薬を1ミリリットルの粉砕植物組織に加え、すべての組織が濡れていることを確認するために反転してよく混合します。室温で10分後、サンプルを遠心分離し、上清を新しい1.5ミリリットルチューブに移します。上清に200マイクロリットルの1-ブロモ-3-クロロプロパンを加え、サンプルを激しくボルテックスします。遠心分離により相を分離し、上部水相の約500マイクロリットルを新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。500マイクロリットルのイソプロパノールと50マイクロリットルの3モル酢酸ナトリウムをサンプルに加え、反転してよく混合します。サンプルをマイナス20°Cで10分間インキュベートしてから、遠心分離によりRNAを沈殿させます。上清を捨てた後、ペレットを500マイクロリットルの80%エタノールで2回、500マイクロリットルの99%エタノールで1回洗浄します。最後の洗浄後、ペレットを5〜10分間乾燥させてから、30マイクロリットルのRNaseフリー水に溶解します。分光光度計でRNA濃度を測定し、DNase水と緩衝液中で20マイクログラムのRNAサンプルを消化します。摂氏37度で30分間インキュベートした後、適切な量のDNase不活性化試薬を使用して酵素を除去し、標準的なプロトコルに従ってキャピラリー電気泳動により単離されたRNAの品質と純度を確認します。DNase消化されたサンプルのRNA完全性数が7より大きい場合は、各RNAサンプルの少なくとも12マイクログラムを新しいチューブに加えます。RNAサンプル3マイクログラムあたり、事前に調製したin vitro転写産物(メチル化転写産物と非メチル化転写産物1つずつ)をそれぞれ0.1ナノグラムにスパイクし、各チューブの最終容量をRNaseフリー水で80マイクロリットルにします。次に、個々の超音波処理チューブで各RNAサンプルの全量を超音波処理し、キャピラリー電気泳動により超音波処理の効率とRNAサンプルの濃度を確認します。断片化されたRNAの平均サイズは、約100ヌクレオチドである必要があります。メチル化RNA免疫沈降のためには、各超音波処理されたRNAサンプルの9マイクログラムと最大60マイクロリットルのRNaseフリー水を新しい個々の低結合チューブに加え、水浴中でRNAを摂氏70度に10分間加熱します。インキュベーションの最後に、サンプルを氷水浴で10分間冷却し、各サンプルの20マイクロリットルを新しい低結合チューブに移し、摂氏マイナス80度で保存します。各サンプルの残りの40マイクロリットルにRNaseフリー水を加えて最終容量860マイクロリットルにし、各サンプルを免疫沈降用の低結合チューブ1本と模擬サンプル用の低結合チューブ1本に分割します。各サンプルに50マイクロリットルの10X MeRIPバッファーと10マイクロリットルのRNase阻害剤を添加します。次に、免疫沈降チューブに10マイクロリットルの抗M5C抗体を、モックチューブに10マイクロリットルの水を追加します。チューブをパラフィルムで密封し、頭上回転させて摂氏4度で12〜14時間サンプルをインキュベートします。翌朝、サンプルごとに15ミリリットルのチューブ1本に40マイクロリットルのビーズを追加します。800マイクロリットルのMeRIPバッファーとオーバーヘッド回転を使用して、1回の洗浄ごとにサンプルごとにオーバーヘッド回転を使用して、ビーズを5分間の洗浄を3回行い、各洗浄後にビーズを磁石に集めてバッファーを廃棄できるようにします。3回目の洗浄後、サンプルあたり40マイクロリットルの新鮮なMeRIPバッファーにビーズを再懸濁し、40マイクロリットルの再懸濁ビーズを免疫沈降チューブと模擬サンプルチューブに加えて、頭上回転で摂氏4度で2時間インキュベーションします。インキュベーションの最後に、チューブを磁気ラックに1分間置いてから、ビーズを乱さずに上清を慎重に捨てます。0.01%Tween-20を添加した700マイクロリットルのMeRIPバッファーで、オーバーヘッド回転を伴う室温で1回の洗浄につき10分間、ビーズを5回洗浄します。最後の洗浄後、ビーズを200マイクロリットルのプロテイナーゼK消化緩衝液と3.5マイクロリットルのプロテイナーゼKに再懸濁し、摂氏50度で3時間インキュベートし、毎分800回転で振とうします。インキュベーションの終わりに、800マイクロリットルのRNA抽出試薬と、実証されているように酸性グアニジニウムチオシアン酸フェノールクロロホルム抽出プロトコルでRNAを抽出します。抽出後、抽出したRNAペレットをちょうど20マイクロリットルのRNaseフリー水に再懸濁します。この図では、良好な RNA サンプルの代表的な分析を示しています。超音波処理後の同じサンプルでは、約100ヌクレオチドのサイズで左にシフトした1つの均一なピークの存在が観察できます。濃度の低下は、フラグメンテーション中のRNAの損失とサンプルの量の増加の両方によって引き起こされます。免疫沈降サンプルと模擬サンプルの品質は、定量的逆転写酵素PCRによって評価できます。この代表的な解析では、免疫沈降サンプルではメチル化in vitro転写産物の約80%が回収されたのに対し、模擬サンプルでは約2%しか回収されませんでした。非メチル化コントロールの場合、免疫沈降サンプルと模擬サンプルの両方で回収率は1%未満でした。ディープシーケンシングを行い、リードをゲノムにアライメントした後、ピークコールアルゴリズムを適用して、インプットと比較して免疫沈降サンプルに濃縮された統計的に有意なウィンドウを特定できます。シーケンシングデータを使用して、RNAメチル化が最も頻繁に発生する動機を特定でき、この動機は特定の結合タンパク質を引き下げるための餌として機能します。

methylated-rna-immunoprecipitation-assay-to-study-m5c-modification

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

刷り込みは、植物と哺乳類の生殖の現象です。...

のインプリント遺伝子のDNAメチル化の定量シロイヌナズナ胚乳

特定の植物遺伝子上にヒストン修飾を検出するために信頼性の高い有用なアプローチが説明されています。アプローチは、クロマチン免疫沈降（ChIP）とリアルタイム定量PCRを兼ね備えています。それは、多様な生理学的プロセスにおいて役割を持つ特定の遺伝子のヒストン修飾の検出を可能にする。...

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シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン<em&gt;インビボ</em

N 6 -methyladenosine（メートル6 A）RNAに修飾を測定するための修正されたノーザンブロット法が記載されています。現在の方法は、様々な実験デザインの下で多様なRNAおよびコントロールで変更を検出することができます。...

RNAの測定方法<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup細胞や組織における&gt; -methyladenosine変更

新たに発見された 5-メチルシトシン (oxi mCs), 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) の酸化フォームと 5-carboxylcytosine (5caC) は、独自の機能的役割の異なる DNA 変更を表す場合があります。ここの可視化から oxi mCs...

DNA 変更染色: 共焦点画像の数値解析

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RNAメチルトランスフェラーゼ活性分析のための抗体フリーアッセイ

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次世代シーケンシングのためのmRNAおよび亜硫酸水素-mRNAライブラリー調製の濃縮

ここでは、ドットブロットを用いて全体のm⁶Aレベルを半定量的に評価するプロトコルを提示します。全RNAは抽出され、変性され、ナイロン膜に斑点を検出し、抗m⁶A抗体でプローブされ、化学発光によって可視化されます。ImageJグレースケール解析で定量化された信号強度は相対的なメチル化存在比を反映し、研究のための再現性のあるワークフローを提供します。...

グローバルN6-メチルアデノシンRNA修飾レベル検出のためのドットブロットアッセイ

このプロトコルは、MeRIP-qPCRを用いて特定のRNAのm6A修飾レベルを評価する詳細なアプローチを提供します。...

骨肉腫細胞における特異的RNAのm6A修飾レベル検出のためのMeRIP-qPCRアッセイ

学ぶメチル化RNA免疫沈降アッセイ（MeRIP）を用いてシロイヌナズナのm5C修飾を探索する方法。アンチM5C抗体による免疫沈降と次世代シーケンスで、メチル化転写産物を効率的に同定し、RNA修飾の機能解析に役立つ。

シロイヌナズナの^m5C修飾を研究するメチル化RNA免疫沈降アッセイ

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