シロイヌナズナの^m5C修飾を研究するメチル化RNA免疫沈降アッセイ

メチル化RNA免疫沈降法は、MeRIPとも呼ばれ、全トランスクリプトーム中のメチル化基を同定するために設計された方法です。多くのモデル生物のRNA抽出物に適応させることができます。この方法は簡単で、過酷な化学処理を必要とせず、特定の変数であれば任意のRNA修飾をマッピングするために使用できます。

RNAサンプルを抽出するには、まず目的の植物組織サンプル200ミリグラムを液体窒素で粉末に粉砕し、手順全体で組織が凍結したままになるように注意します。次に、グアニジンチオシアン酸と酸性フェノールを含むRNA抽出試薬を1ミリリットルの粉砕植物組織に加え、すべての組織が濡れていることを確認するために反転してよく混合します。室温で10分後、サンプルを遠心分離し、上清を新しい1.5ミリリットルチューブに移します。

上清に200マイクロリットルの1-ブロモ-3-クロロプロパンを加え、サンプルを激しくボルテックスします。遠心分離により相を分離し、上部水相の約500マイクロリットルを新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。500マイクロリットルのイソプロパノールと50マイクロリットルの3モル酢酸ナトリウムをサンプルに加え、反転してよく混合します。

サンプルをマイナス20°Cで10分間インキュベートしてから、遠心分離によりRNAを沈殿させます。上清を捨てた後、ペレットを500マイクロリットルの80%エタノールで2回、500マイクロリットルの99%エタノールで1回洗浄します。最後の洗浄後、ペレットを5〜10分間乾燥させてから、30マイクロリットルのRNaseフリー水に溶解します。

分光光度計でRNA濃度を測定し、DNase水と緩衝液中で20マイクログラムのRNAサンプルを消化します。摂氏37度で30分間インキュベートした後、適切な量のDNase不活性化試薬を使用して酵素を除去し、標準的なプロトコルに従ってキャピラリー電気泳動により単離されたRNAの品質と純度を確認します。DNase消化されたサンプルのRNA完全性数が7より大きい場合は、各RNAサンプルの少なくとも12マイクログラムを新しいチューブに加えます。

RNAサンプル3マイクログラムあたり、事前に調製したin vitro転写産物(メチル化転写産物と非メチル化転写産物1つずつ)をそれぞれ0.1ナノグラムにスパイクし、各チューブの最終容量をRNaseフリー水で80マイクロリットルにします。次に、個々の超音波処理チューブで各RNAサンプルの全量を超音波処理し、キャピラリー電気泳動により超音波処理の効率とRNAサンプルの濃度を確認します。断片化されたRNAの平均サイズは、約100ヌクレオチドである必要があります。

メチル化RNA免疫沈降のためには、各超音波処理されたRNAサンプルの9マイクログラムと最大60マイクロリットルのRNaseフリー水を新しい個々の低結合チューブに加え、水浴中でRNAを摂氏70度に10分間加熱します。インキュベーションの最後に、サンプルを氷水浴で10分間冷却し、各サンプルの20マイクロリットルを新しい低結合チューブに移し、摂氏マイナス80度で保存します。各サンプルの残りの40マイクロリットルにRNaseフリー水を加えて最終容量860マイクロリットルにし、各サンプルを免疫沈降用の低結合チューブ1本と模擬サンプル用の低結合チューブ1本に分割します。

各サンプルに50マイクロリットルの10X MeRIPバッファーと10マイクロリットルのRNase阻害剤を添加します。次に、免疫沈降チューブに10マイクロリットルの抗M5C抗体を、モックチューブに10マイクロリットルの水を追加します。チューブをパラフィルムで密封し、頭上回転させて摂氏4度で12〜14時間サンプルをインキュベートします。

翌朝、サンプルごとに15ミリリットルのチューブ1本に40マイクロリットルのビーズを追加します。800マイクロリットルのMeRIPバッファーとオーバーヘッド回転を使用して、1回の洗浄ごとにサンプルごとにオーバーヘッド回転を使用して、ビーズを5分間の洗浄を3回行い、各洗浄後にビーズを磁石に集めてバッファーを廃棄できるようにします。3回目の洗浄後、サンプルあたり40マイクロリットルの新鮮なMeRIPバッファーにビーズを再懸濁し、40マイクロリットルの再懸濁ビーズを免疫沈降チューブと模擬サンプルチューブに加えて、頭上回転で摂氏4度で2時間インキュベーションします。

インキュベーションの最後に、チューブを磁気ラックに1分間置いてから、ビーズを乱さずに上清を慎重に捨てます。0.01%Tween-20を添加した700マイクロリットルのMeRIPバッファーで、オーバーヘッド回転を伴う室温で1回の洗浄につき10分間、ビーズを5回洗浄します。最後の洗浄後、ビーズを200マイクロリットルのプロテイナーゼK消化緩衝液と3.5マイクロリットルのプロテイナーゼKに再懸濁し、摂氏50度で3時間インキュベートし、毎分800回転で振とうします。

インキュベーションの終わりに、800マイクロリットルのRNA抽出試薬と、実証されているように酸性グアニジニウムチオシアン酸フェノールクロロホルム抽出プロトコルでRNAを抽出します。抽出後、抽出したRNAペレットをちょうど20マイクロリットルのRNaseフリー水に再懸濁します。この図では、良好な RNA サンプルの代表的な分析を示しています。

超音波処理後の同じサンプルでは、約100ヌクレオチドのサイズで左にシフトした1つの均一なピークの存在が観察できます。濃度の低下は、フラグメンテーション中のRNAの損失とサンプルの量の増加の両方によって引き起こされます。免疫沈降サンプルと模擬サンプルの品質は、定量的逆転写酵素PCRによって評価できます。

この代表的な解析では、免疫沈降サンプルではメチル化in vitro転写産物の約80%が回収されたのに対し、模擬サンプルでは約2%しか回収されませんでした。非メチル化コントロールの場合、免疫沈降サンプルと模擬サンプルの両方で回収率は1%未満でした。ディープシーケンシングを行い、リードをゲノムにアライメントした後、ピークコールアルゴリズムを適用して、インプットと比較して免疫沈降サンプルに濃縮された統計的に有意なウィンドウを特定できます。

シーケンシングデータを使用して、RNAメチル化が最も頻繁に発生する動機を特定でき、この動機は特定の結合タンパク質を引き下げるための餌として機能します。