Name: 前眼室におけるヒト膵島移植および寄与宿主細胞のイメージングと定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学ぶ 前眼室へのヒト膵島移植と2光子顕微鏡イメージングによる移植動態の長期モニタリング法。宿主細胞の寄与評価とβ細胞置換療法の最適化に有用です。

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この研究は、スウェーデン研究評議会、戦略的研究地域Exodiab、Dnr 2009-1039、LUDC-IRC、ルンド、糖尿病フェルブンデット、バーン糖尿病フェルバンデットの王立生理学会への戦略研究DNR IRC15-0067スウェーデンの財団によって支援されました。

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著者らは開示するものは何もない。

レシピエントとドナー組織の関与を観察することによってヒト膵島細胞移植プロセスを研究する方法を提示する。免疫不全マウス眼の前房にヒトの小島を移植する最小限の侵襲手術の後、マウスは手術後数分以内に迅速に回復する。手順は片目で行われます。一般に、5~7日以降、角膜は、生体内イメージングを行うのに十分に治癒する。
このプロトコルでは、ヒトの小子移植片の品質が重要です。ヒトの小地の質およびそれに伴う移植の結果は、ドナーの年齢、BMI、および単離プロセス、ならびに到着前後の小地培養の時間によって異なる可能性がある。臨床移植のために承認された臓器提供膵臓から処理されたヒト膵島および研究目的は、ドナーの同意を得て使用された。それらは、膵臓消化のプロセス後に得られ、他の12に記載の膵島の精製。単離されたマウス小島と同様に、これらの小島は、酵素消化工程14,15,15の間に虚血、機械的ストレス、地下タンパク質の喪失、およびイレット内皮細胞...

糖尿病は、膵島ベータ細胞の喪失または機能不全からのインスリン産生不十分な結果として、血糖のレベルの上昇を特徴とする代謝疾患のグループを記述し、しばしばインスリン抵抗性を伴う。1型(T1D)および2型糖尿病(T2D)は、ベータ細胞の進行性機能障害が疾患の発症を引き起こす複雑な疾患である。T1Dはベータ細胞に対する自己免疫攻撃によって沈殿し、一方T2Dは代謝因子によって駆動されると考えられるが、低位の全身炎症の証拠は増加する1である。ドナーヒト小島の移植は、特にT1D患者に、生理的血糖コントロールを提供する可能性を提供する。しかし、組織ドナーの不足と貧しい小地の生着は、主流の治療オプションになるための小地移植を妨げている。機能的な小子移植片のかなりの割合は、低酸素、炎症性、免疫原性宿主環境22、33のために、即時の移植後期間(24〜48時間)で失われる。イレット生存率の改善のための介入方法の効率を評価するためには、このような移植の継続的なモニタリングが必要である。
移植後に移植されたヒト膵島の運命を画像化および追跡するin vivo技術は、糖尿病研究4,55に依然として4課題である。現在までに、非侵襲的イメージング技術は、陽電子放出断層撮影(PET)、磁気共鳴画像法(MRI)、または超音波(US)を含む、実験条件5における移植された小島の定量化および機能評価の可能性を示す。しかし、小さな小さな小さな小さな小さな小さい小さい小さいと、それらのモダリティによる定量的な測定は、不十分な解像度に苦しむ。眼前室(ACE)を観察用の移植部位としては、長期間にわたって効果的に高い空間分解能と頻繁なモニタリングを提供する有望な非侵襲的イメージングソリューションである。この方法は、マウスの小子生物学(ヤンら7でレビュー)、自己免疫免疫応答8、ならびにヒトの小子移植9,9、10を研究するためにうまく利用されている。
ここでACE移植法を2光子イメージング手法と組み合わせて、移植後最大10ヶ月間、個々の膵島移植片に対する連続的かつ繰り返しの記録によってヒト膵島の生着プロセスのダイナミクスを調べる。より大きな撮像深度の多光子イメージング特性と、全体的な光漂白および光損傷の減少は、共焦点顕微鏡11のイメージング限界を克服する。蛍光イメージングの定量化には、小島サンプル調製、小島移植、画像取得、島のノイズや背景を除去するための画像フィルタリング、セグメンテーション、定量、データ分析など、いくつかの段階が含まれます。最も困難な手順は、通常、イメージを複数のパーツまたはリージョンに分割または分割することです。これには、バックグラウンドノイズから信号を分離することや、色や形状の類似性に基づいてボクセルの領域をクラスタリングして、たとえば、アイレット血管系を表す3Dボリュームのボクセルを検出してラベル付けすることが含まれます。セグメント化されると、オブジェクトのボリュームサイズなどの統計は、通常、簡単に抽出できます。提供される方法は、セグメンテーションやデータ可視化などのイメージングデータの定量・抽出方法である。特に注意は、ヒト小島における自己蛍光の除去と、受け手細胞を形成する小島の血管系と小島カプセルの区別に関する。

<table><tbody><tr><td>麻酔器、例えば 麻酔ユニットU-400</td><td>Agnthos</td><td>8323001</td><td>手術中のイソフルラン麻酔に使用され、イメージング</td></tr><tr><td>誘導チャンバー 1.4 L</td><td>Agnthos</td><td>8329002</td><td>チューブを介してU-400</td></tr><tr><td>ガスルーティングスイッチ</td><td>に接続 Agnthos</td><td>8433005</td><td>チューブを介してU-400</td></tr><tr><td>AngioSense 680 EX</td><td>Percin Elmer</td><td>NEV10054EX</td><td>に接続ヒトの膵島移植片の血管の画像化に使用される注射用イメージング剤</td></tr><tr><td>アスピレーターチューブアセンブリ</td><td>シグマ</td><td>A5177-5EA</td>は<td>、手動膵島ピッキング用の引っ張られたキャピラリーピペットと接続します</td></tr><tr><td>ブプレノルフィン(Temgesic) 0.3mg/ml</td><td>シェリング・プラウ ヨーロッパ&eacute;</td><td>64022</td><td>液体、痛み緩和用</td></tr><tr><td>キャピラリーピペットVWR</td><td></td><td>321242C</td>は<td>、吸引器チューブアセンブリと一緒に使用されますデ</td></tr><tr><td>キストランテキサスレッド(TR)、70kDa</td><td>Invitrogen</td><td>D1830</td><td>注射用イメージングエージェント</td></tr><tr><td>アイカニューレ、鈍い端、25 G</td><td>BVI Visitec / BD</td><td>BD585107</td><td>テーパードハイドリネーター[Blumenthal]からカスタムメイド、寸法:0.5 x 22mm(25G x 7/8インチ)(45?)、先端は30G(0.3mm)</td></tr><tr><td>アイジェル</td><td>ノバルティス</td><td></td><td>ビスコティアーズ、カルボマー2mg / g</td></tr>ハ<tr><td>ミルトンシリンジ0.5ml、モデル1750TPLT</td><td>ハミルトン</td><td>81242</td>島<td>注射用プランジャータイプガスタイトシリンジ</td></tr><tr><td><ストロング>ヘッドホルダー</ストロング>ヘッド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>保持アダプター</td><td>ナリシゲ</td><td>SG-4N-S</td><td>を金属プレートに組み立て</td></tr>た<tr><td>ガスマスク</td><td>ナリシゲ</td><td>GM-4-S-UST-2</td><td></td></tr><tr><td>ソリッドユニバーサルジョイント</td><td>ナリシゲ</td><td>UST-2</td>を<td>金属板に組み立て</td></tr>-<tr><td>ヘッドホルダーアセンブリ</td><td></td><td></td><td></td>用のカスタムメイド金属プレート</tr><tr><td>-デュモン#5、ストレート</td><td>Agnthos</td><td>0207-5TI-PSまたは0208-5-PS</td><td>をUST-2に取り付けました(カスタムメイド)</td></tr><tr><td>加熱パッド、</td><td></td><td></td><td>定位固定装置プラットフォームにテープで固定</td></tr><tr><td>ヒト膵島培養培地</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-CMRL 1066</td><td>ICN ヒト</td><td></td><td>膵島用細胞培養培地</td></tr><tr><td>-HEPES</td><td>GIBCO BRL-L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-グルタミン</td><td>GIBCO BRL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-ゲンタマイシン</td><td>GIBCO BRL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-菌類</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-シプロキフロキサシン</td><td>バイエルヘルスケアAG-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>画像解析ソフトウェア</td><td>ビットプレーン</td><td></td><td>イマリス 9</td></tr><tr><td>画像取得ソフトウェア</td><td>ツァイス</td><td></td><td>ZEN 2010</td></tr><tr><td>赤外線ランプ</td><td>VWR</td><td>1010364937</td><td>ウェイクアップケージで動物を暖かく保つために使用されます</td></tr><tr><td>イソフルラン イソフロ</td><td>アボットスカンジナビア/アポテック</td><td></td><td>液、麻酔用</td></tr><tr><td>針 25 G (0.5 x 16mm)、メス</td> シャー<td>レとして使用する</td>オレンジ色の <td>BD</td><td>10442204</td></tr><tr><td>、90mm</td><td>VWR</td><td>391-0440</td><td></td></tr><tr><td>2-Photon/confocal microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-LSM7 MP 直立顕微鏡</td><td>Zeiss-Ti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>:Sapphire レーザー津波</td><td>Spectra-Physics, Mai Tai</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-長距離水浸レンズ 20x/NA1.0</td><td></td> Zeiss-ET710<td></td><td></td></tr><tr><td>/40m (Angiosense 680)</td><td>Chroma</td><td></td> 288003-ET645<td></td></tr><tr><td>/65m-2p (TR)</td><td>Chroma</td><td></td> NC528423-ET525<td></td></tr><tr><td>/50 (GFP)</td><td></td>Chroma-ET610<td></td><td></td></tr><tr><td>/75 (トマト)</td><td>Chroma-main</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>beamスプリッターT680lpxxr</td><td>クロマ</td><td>T680lpxxr</td><td>ダイクロイックミラーは、690nm以上を送信し、440〜650nmのサイズ25.5×36×1ミリメートル</td></tr>ポリエチレン<tr><td>チューブ(0.38ミリメートル内径、1.09ミリメートルOD)</td><td>スミスメディカルデンマーク</td><td>800/100/120</td>ハ<td>ミルトンシリンジとアイカニューレ</td></tr>に接続するニ<tr><td>コン</td><td></td><td>モデルSMZ645、島ピッキング</td><td></td></tr><tr><td>用<ストロング>ステレオ顕微鏡(蛍光)</ストロング></td><td></td><td></td><td>膵島グラフトイメージング用</td></tr><tr><td>-AZ100マルチズーム</td><td>ニコン</td><td></td><td>広視野および長距離</td></tr><tr><td>-AZプランアポ1x</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-AZプランアポ4x</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-AZ-FLエピフルオレッセンスC-LHGFIHGランプ</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-HGマニュアルニューインテンシライト</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-Epi-FLフィルターブロックTEXAS RED</td><td>ニコン</td><td></td><td>はEX540-580、DM595とBA600-660-Epi-FL</td></tr><tr><td>フィルターブロックG-2A</td><td>ニコン</td><td></td><td>(EX510-560、DM575とBA590)</td></tr><tr><td>-Epi-FLフィルターブロックB-2A</td><td>ニコン</td><td></td><td>(EX450-490、DM505とBA520)</td></tr><tr><td>-DS-Fi1カラーデジタルカメラ(5MP)</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリンジ1ミリリットル、Omnitix</td><td>ブラウン</td><td>9161406V</td><td>が含まれていますブプレノルフィン注射用、27G針で使用</td></tr><tr><td>サージカルテープ</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

前眼室におけるヒト膵島移植および寄与宿主細胞のイメージングと定量

Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber

ベータ細胞のイメージングは、小子移植を理解するための重要なステップです。ベータ細胞生物学の記録のための異なるイメージングプラットフォームが 開発され、インビボで利用されているが、それらは単一細胞分解能および連続的な縦断記録を可能にするという点で限られている。角膜の透明性のために、マウスの眼前房(ACE)は、ヒトおよびマウス膵島細胞生物学の研究に適している。ここでは、このアプローチを使用して、個々のヒト小口移植片の移植および再血管化の連続的な縦方向の記録を行うことができる方法の説明を示す。ヒトの小子移植片は、NODを使用して、ACEに挿入される。(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-マウスをレシピエントとして使用する。これにより、レシピエント対ドナー細胞の拡張の調査と、移植片のカプセル化および血管化を促進するレシピエント細胞の寄与を可能にする。また、レシピエント細胞を形成する島の体積またはセグメント化された血管系および小島カプセルの画像分析および定量化のためのステップバイステップのアプローチが概説されている。

非標識ヒト小島を8週齢の雌NODのACEに移植した。(Cg)-Gt(ローザ)26Sortm4-ラグ2-/-(NOD.ローザトマト。Rag2-/−)レシピエントマウス。ヒト組織拒絶反応を防ぐために、免疫不全Rag2ノックアウトマウスをレシピエントとして選んだ。これらのトランスジェニックマウスにおいて、全ての細胞および組織は、レシピエントおよびドナー組織の明確な同定を可能にする膜標的トマト蛍光タンパク質(mT)を発現した。高解像2光子顕微鏡による小地移植片の繰り返しイメージングは、生着プロセスおよびそれらの動的移動パターンに関与するmT+ レシピエント細胞を同定することができた。
一般に、レシピエントマウスのACEへのヒト小島の移植設定(図1a)は、小島の形状および大きさに関する同系マウス島の移植と類似していた(<strong class="xfig"...

このプロトコルの目的は、ヒト膵島の生着プロセスと寄与する宿主対ドナー細胞のダイナミクスを継続的に監視することです。これは、NODの眼の前房(ACE)にヒトの小島を移植することによって達成される。(Cg)-Gt(ローザ)26Sortm4-Rag2-/-マウスの受信者に続いて2光子イメージングを繰り返す。

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology ...

ACE は最適なイメージングのサイトです。移植状況におけるそれらの機能および生存率を研究するために、長期間インビボでのイレット細胞イメージングでそれを繰り返すことを支持する。また、リアルタイムで生理学的および病理学的条件下で他の側面を研究するために拡張することができます.ACE技術の利点は、同じ個々のヒト膵島が長期間にわたって細胞下解像度で非侵襲的に追跡することができるという事実にあります。ベータ細胞補充療法の成功率は改善し続けている。しかし、インビボでのイレット移植および生存の効率を評価することは依然として困難である。この方法は、小子移植の結果を評価し、最適化するのに役立つ可能性があります。このアプローチは膵島のみに限定されません。また、影響を受ける組織を研究するのに適しています。例えば、糖尿病性合併症では、腎臓糸球体や肝臓片のような、ほんのいくつかを挙げるように。温かい加熱パッドの上にマウスを置き始めるには、ヘッドホルダーに置き、ノーズマスクに置きます。親指と人差し指を使って頭を少し持ち上げます。側面に金属片を付けて留めます。耳の部分が耳の真下に頭を固定することを確認します。マウスの背面にブプレノルフィン溶液を皮下注射する。鈍い鉗子を使用して移植される眼のまぶたを穏やかに引き込む。目を飛び出し、ポリテーンチューブで覆われたピンセットでゆるく固定します。PBSでまぶたをペトリ皿に移した後、目のカナラに約20〜30個の小島を拾います。25ゲージの針レベルを上にして、慎重に先端を角膜に挿入し、単一の横切開を行います。カニューレをプリロードした角膜を慎重に持ち上げ、ゆっくりと小島を目に放出します。カニューレをゆっくりと引っ込め、目に目ゲルを塗布します。10分後、鉗子を取り外し、まぶたを保持し、目を通常の位置に戻します。2つの光子顕微鏡で埋め込まれたヒト小島のイメージングのために、ヘッドホルダープラットフォームを顕微鏡の下に置き、角膜とレンズの間の浸漬液として眼に目ゲルを投与する。目的の下に目を配置し、テキスト原稿に記載されているように、埋め込まれたヒト小島を画像化します。自己蛍光を除去するには、画像処理タブに移動し、チャンネルの算術を選択し、チャンネル1からチャンネル2を引いたものを入力します。これにより、新しいチャネル 4 が作成されます。血管系の名前を変更します。このプロセスを繰り返し、チャネル 3 マイナス チャンネル 2 を入力して新しいチャンネル 5 を作成し、トマトの名前を全て変更します。この小水を定義するには、手動で新しいサーフェスを作成し、ウィザードで手動で編集を選択します。ポインタを選択モードと 3D ビューに保持します。そして、セクションを視覚化するボリュームをクリックします。図面タブで輪郭を選択し、[描画]をクリックして、スライス位置1から、小地の境界線の周りに輪郭を描き始めます。次に、新しいスライス位置に移動し、描画の輪郭を繰り返します。最後のスライスを小水の上部に置き、最後に [サーフェスの作成] タブをクリックします。次のセグメントは、アイレットマスクを用いたバレーバレーの脈管及びトマトの蛍光である。以前に定義したアイレットマスクオブジェクトを選択し、編集タブに移動してマスクの[すべて]タブをクリックすると、新しいウィンドウが開きます。チャンネル選択ドロップダウンメニューで血管構造チャンネルを選択し、マスクを適用する前にオプションの重複チャンネルをアクティブにします。内部、外側、および新しいチャネル 6 を作成する 0.000 に外側のボクセルを設定します。このチャンネルの小口血管構造の名前を変更します。前の手順を繰り返し、チャンネル選択ドロップダウンメニューでトマトをすべて選択し、新しいチャンネルを作成し、名前を変更し、トマトを選択します。次に、シーンメニューで新しいサーフェスを作成し、ウィザードで自動作成を選択します。ソースチャネルを以前に作成した小海峡の脈管構造に設定し、背景減算を選択します。オプションでフィルターを使用します。たとえば、ボリュームを選択し、選択したサービスオブジェクトを削除できるウィンドウでフィルターを調整します。ウィザードを終了し、新しいサーフェス オブジェクト、小地の血管構造に名前を付けます。「小州脈管構造」サービスオブジェクトで編集タブに移動し、マスクの[すべて]タブをクリックすると、新しいウィンドウが開きます。チャンネル選択ドロップダウンメニューでアイレットトマトチャンネルを選択し、新しいチャンネルを作成する10.000に表面外のボクセルを設定します。このチャンネルの小口トマト血管系の名前を変更します。トマトカプセル蛍光信号をセグメント化するには、画像処理タブでチャンネルの算術を選択し、チャネル7マイナスチャンネル8を入力して新しいチャンネルを作成します。トマトカプセルの名前を変更します。前に説明したように新しい表面を作成し、ソースチャンネル、ウィザードでトマトの血管またはトマトカプセルを選択します。次に、バックグラウンドの減算を実行します。小子の後方散乱ファイルを開き、新しいサーフェスを作成します。ウィザードで、自動作成を選択し、対象の領域を定義します。必要に応じて、しきい値を絶対強度で調整します。サーフェス オブジェクトは、クリックしてオンまたはオフにして、対応するチャネル強度とクロスチェックできます。完了したら、ウィザードを閉じます。最後に、定量を実行し、シーンメニューで作成したサーフェスオブジェクトを選択して、統計情報タブに移動します。詳細なボリュームデータを取得するには、詳細タブを選択し、ドロップダウンメニューから特定の値とボリュームを選択します。合計ボリューム値を取得するには、詳細タブに移動し、平均値を選択します。このプロトコルは、8週齢の雌の赤い蛍光レシピエントマウスの眼の内部チャンバーに非標識ヒト小島を移植するために使用された。その後、インタラクティブイメージングソフトウェアを使用して、画像から定量的なデータを抽出しました。生体内フルオレセンス画像では、マウスの小子移植片では観察されなかった組織自己蛍光からの有意な干渉によってヒト小口移植片が損なわれた。信号対雑音比を改善するために、自己蛍光チャネルを減算した。その後、アイレットマスクと呼ばれる小子の境界と対応するチャネルを手動で定義しました。最後に、トマト信号を眼瞼の血管構造および眼瞼カプセルへのセグメンテーションと最終表面レンダリングを使用して定量的データを抽出した。ここでは、移植後2週間、2ヶ月、5ヶ月および8ヶ月で同じヒト小島移植片の代表的な縦断画像セッションとして。もともと記録された生データのMIP画像、小子自家蛍光除去後の処理画像およびセグメント化された小子オブジェクトが示されている。まぶたの注入を行う場合は、小さなボリュームで小島をプリロードし、ステレオ顕微鏡に柔軟なツインライトアームを使用して、ACEに島を正常に注入するために眼室スペースを強調してください。インビボイメージングに続いて、眼を固定し、抗体染色および従来の構造学についてさらに調査することができる。この技術は、特に血管化、生存率および代謝研究の文脈において、リアルタイムおよび生理学的条件下での個々のヒト小島の機能研究に非常に有用である。

longitudinal-vivo-imaging-quantification-human-pancreatic-islet

Research

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Medicine

医学

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マウスにおけるヒト多能性幹細胞由来膵臓内分泌細胞の筋肉内移植

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前眼室におけるヒト膵島移植および寄与宿主細胞のイメージングと定量

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