動物性食品中の サルモネラ菌 をスクリーニングし、培養分離から サルモネラ菌 を確認するためのループ媒介等温増幅
2020年5月20日
ループ媒介等温増幅(LAMP)は、病原体検出分野に広く関心を集めている等温核酸増幅試験(iNAAT)です。ここでは、動物性食品中のサルモネラ菌をスクリーニングし、培養分離から推定サルモネラ菌を確認するための迅速で信頼性の高い、堅牢な方法として、マルチラボ検証されたサルモネラLAMPプロトコルを提示します。
このサルモネラLAMP法は、動物性食品のスクリーニング方法および推定サルモネラ菌分離株の確認方法として、FDAの細菌学的分析マニュアルに組み込まれています。この方法は、迅速で信頼性が高く、堅牢です。PCRと比較すると、その主な利点は、迅速な検査、シンプルな機器化、低い偽陰性率、柔軟なワークフローなどです。
サルモネラ菌などの病原体の迅速なスクリーニングは、汚染された可能性のある製品を迅速に検出する上で重要な役割を果たし、人間や動物の病気や発生を防ぐことができます。まず、LAMPアッセイ用のDNAテンプレートを調製します。DNAテンプレートの作成に使用されるサンプルには2つのタイプがあります。
動物性食品サンプルからテンプレートを調製するには、25 グラムの食品サンプルを無菌フィルターバッグに無菌的に計量します。225ミリリットルの滅菌緩衝ペプトン水をバッグに加え、摂氏35度で24時間インキュベートします。インキュベーション後、バッグのろ過側から1ミリリットルをマイクロ遠心チューブに移します。
チューブをGの900倍で1分間遠心分離します。次に、上清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。サンプルを 16, 000 倍 G で 2 分間遠心分離します。
そして、上清を捨てるには、ペレットを100マイクロリットルのサンプル調製試薬に再懸濁し、乾燥熱ブロックで摂氏100度で10分間加熱します。その後、サンプルを室温まで冷却し、マイナス20°Cで保存します。このLAMPアッセイの2番目のタイプのサンプルは、推定サルモネラ菌培養物から直接採取されます。
DNAテンプレートを調製するには、500マイクロリットルのサルモネラ菌培養物を一晩かけてマイクロ遠心チューブに移し、摂氏100度のヒートブロックで10分間加熱します。その後、サンプルを室温まで冷却し、マイナス20°Cで保存します。クロスコンタミネーションを防ぐために、LAMPマスターミックスの調製とDNAテンプレートの添加に使用する領域を物理的に分離してください。
イソプロパノールとDNAおよびDNAの分解液で作業面を洗浄します。次に、ピペットとチューブストリップホルダーを清掃します。等温Master Mix、10X Primer Mix、分子グレードの水、ポジティブコントロールDNA、DNAテンプレートを室温で解凍します。
LAMP機器の電源を入れ、関連するファイル情報を入力します。原稿の指示に従ってLAMPマスターミックスを調製し、短時間ボルテックスして遠心分離し、23マイクロリットルのマスターミックスをチューブストリップの各ウェルに分配します。すべてのDNAテンプレートをボルテックスし、短時間遠心分離します。
次に、2マイクロリットルのDNAテンプレートを適切なウェルに加え、ウェルにしっかりとキャップをします。チューブストリップをホルダーから取り外し、フリックして、すべての試薬がチューブの底に溜まっていることを確認します。チューブストリップをLAMP装置にロードし、LAMPランを開始します。
LAMP反応の進行中に、「Temperature」、「Amplification」、および「Anneal」タブをタップすると、LAMP実行中のさまざまなパラメーターの動的変化を確認できます。LAMPの結果は、LAMPインストルメントパネルにリアルタイムで表示することも、LAMPソフトウェアを使用して表示することもできます。インストルメントパネル上で結果を解釈するには、対象のLAMPランを開きます。
各実行に関連付けられている 5 つのタブを確認します。「Profile」タブと「Temperature」タブには、LAMP反応の進行に伴うサンプルウェル内のプログラムされた温度と実際の温度が表示されます。AmplificationタブとAnnealタブには、AmplificationフェーズとAnnielフェーズ中の蛍光の読み取り値と蛍光の変化がそれぞれ表示されます。
「結果」タブには、原稿の指示に従って解釈できるLAMP結果の表形式ビューが表示されます。LAMPの結果を表示する2つ目の方法は、LAMPソフトウェアを使用することです。ソフトウェアで結果を解釈するには、左側のパネルの[コンピューター]アイコンをクリックし、目的のLAMP実行をロードするファイルの場所に移動します。
各実行に関連付けられている 7 つのタブを確認します。「Profile」タブと「Temperature」タブには、LAMP反応の進行に伴うサンプルウェル内のプログラムされた温度と実際の温度が表示されます。「Amplification」タブと「Amplification Rate」タブには、Amplificationフェーズ中の蛍光測定値と蛍光の変化が表示されます。
「Anneal」タブと「Anneal Derivative」タブには、アニール期の蛍光測定値と蛍光の変化が表示されます。[結果] タブには、LAMP の結果が表形式で表示されます。グラフ名、ウェル番号、ウェル名、ピーク値の 4 つの列があります。
8つのサンプルすべてのアンペア時間とアニール微分が表示されます。結果は、原稿の指示に従って解釈することができます。LAMPインストゥルメントパネルとLAMPソフトウェアを使用して、アッセイの結果を表示することができます。
このLAMPランでは、サンプルS1からS6は、Salmonella enterica serovar Infantis ATCC 51741の10倍の段階希釈であり、反応ごとに110万から11コロニー形成単位の範囲です。ポジティブコントロール(PC)は、反応ごとに17, 000コロニー形成ユニットのサルモネラ菌腸炎チフス菌LT2であり、テンプレートコントロールなし(NTC)は分子グレードの水です。NTC井戸のLmaxとAnear温度は、LAMPインストルメントパネルに約81°C、LAMPソフトウェアではTmaxとAnear温度が空白です。
ポジティブコントロールウェルのTmaxは7分45秒で、アニーリング温度は両プラットフォームで約90°Cです。サンプルS1からS6のTmaxは6分から30秒、12分15秒で、アニーリング温度は約90°Cで、すべて陽性の検出を示しています。LAMPは非常に効果的で、大量のDNAを生成します。
そのため、クロスコンタミネーションを防ぐために、ラボのベストプラクティスを使用することが重要です。DNAテンプレートを作成する際には、汚染された動物性食品からの濃縮物にはサルモネラ菌が多く含まれる可能性があるため、同様の方法を使用してください。LAMP陽性の動物性食品サンプルスクリーニングは、FDAの細菌学的分析マニュアルの手順に従って培養分離することにより確認する必要があります。
陰性サンプルは、そのように報告できます。このLAMP法がFDAの細菌分析マニュアルに組み込まれたことで、この迅速で堅牢でユーザーフレンドリーな技術を食品安全性試験に広く適用できるようになります。
概要
この研究は、動物性食品におけるサルモネラの迅速検出のための実証済みのループ媒介等温増幅（LAMP）プロトコルを提示します。この方法は従来のPCRに比べて、結果が速く偽陰性率が低いという利点があり、潜在的な汚染を特定するための信頼できるツールとなっています。
主要な研究要素
研究分野
- 病原体検出
- 核酸増幅
- 食品安全
背景
- 食品製品における迅速な病原体検出の重要性
- サルモネラの信頼できるスクリーニング方法の必要性
- 従来のPCR方法の限界
使用された方法
- ループ媒介等温増幅（LAMP）
- サルモネラ属
- 特定のDNA準備プロトコルの使用
主要な結果
- サルモネラ検出のためのLAMPの有効性を示しました
- この方法の低い偽陰性率を強調しました
- 複数の研究所での比較を通じて検証しました
結論
- この研究は、食品製品におけるサルモネラのスクリーニングと確認のためのLAMPの実行可能な方法を確立しました。
- 食品安全性の向上と健康リスク防止のための迅速な検査の重要性を強調しています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Rapid pathogen detection in animal food is critical for preventing contamination events that could impact both animal and human health. The LAMP method provides a reliable, inhibitor-tolerant nucleic acid test that supports timely screening and confirmation workflows in food safety testing. Its incorporation into the FDA BAM underscores its value as a standardized, deployable tool for biopharma and food safety laboratories seeking to reduce false negatives and accelerate decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of Salmonella presence in complex matrices like animal food enrichments.
- Operational Value: Supports rapid hypothesis testing of contamination risk without requiring culturing timelines.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts for real-time monitoring of amplification kinetics.
- Operational Value: Delivers results in as little as 5 minutes with tolerance to inhibitors commonly found in food or culture samples.
- Strategic Value: Facilitates high-throughput screening readiness due to simple instrumentation and minimal hands-on time.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Confirms presumptive isolates from culture, bridging phenotypic and genotypic detection methods.
- Operational Value: Uses standardized DNA preparation protocols applicable to both food enrichment broths and pure cultures.
Pipeline & Workflow Integration
The LAMP method fits within food safety testing workflows as a rapid screening tool followed by culture-based confirmation when positive, supporting a tiered testing strategy.
- Discovery Biology: Enables early detection of Salmonella in pre-enriched animal food samples to inform hazard assessment.
- Screening: Provides inhibitor-resistant amplification suitable for complex food matrices after enrichment.
- Analytics: Delivers real-time fluorescence data with defined Tmax and annealing temperature thresholds for result interpretation.
- Translational Research: Confirms LAMP-positive results via culture isolation, ensuring continuity between molecular and phenotypic validation.
- Enterprise Reuse: Compatible with existing LAMP instruments and software, allowing reuse across multiple sample types and laboratories.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High specificity via invA gene targeting reduces false positives in pathogen detection.
- Operational Value: Simple workflow with minimal equipment needs (heat block, centrifuge, LAMP instrument) increases accessibility.
- Strategic Value: Low false-negative rate improves confidence in negative results, supporting release decisions.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of samples for further testing, optimizing resource use in safety programs.
Implementation Considerations
- Requires training in aseptic sample preparation and DNA template generation from enrichment broths or cultures.
- Needs access to a LAMP-capable fluorometer or real-time isothermal amplification instrument.
- Demands standardized reagent handling, including primer mixes and master mix preparation per manufacturer guidelines.
- Requires physical separation of master mix preparation and template addition zones to prevent amplicon contamination.
- Relies on proper cold storage (-20°C) of prepared DNA templates to maintain integrity between extraction and amplification.
