Name: カエノハブディティス・エレガンスからのタンパク質抽出物調製と共免疫沈降 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: 学ぶ Caenorhabditis elegansからのタンパク質抽出物調製と共免疫沈降法。このプロトコルは最大24サンプルの高スループット処理が可能で、タンパク質相互作用の研究に有用です。

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この研究の一部はカンザスINBRE、P20GM103418、李とジノビエバ、R35GM124828からジノビエバにサポートされていました。抗AIN-1抗体を寛大に共有してくれたミン・ハンに感謝します。この研究の過程で使用される株のいくつかは、研究インフラプログラムのNIH事務所(P40 OD010440)が資金を提供する カエノールハブディティス 遺伝学センター(CGC)によって提供されました。

1. ワームサンプルコレクション
<ol><li>種子混合ステージまたは必要な温度でNGM固体プレート上の13ワームを同期させ、ワームが所望の段階まで成長することを可能にする。基本的なC.エレガンスの成長とメンテナンスについては、Stiernagleらおよびポルタ・ド・ラ・リヴァら14,13を参照してください。</li>
	<li>M9バッファーでワームプレートを洗浄することにより、15 mLの円錐遠心管にワームを収集します。</li>
	<li>ペレットは、室温(RT)で400xgで2分間遠心して虫を捨て、上清を捨てる。 注:抽出の準備のためのワームペレットのサイズは100 μLから500 μLの間です。パックされたワームの300 μLのペレットは下流の免疫沈降実験に推奨され、通常は総タンパク質の約4.5mgを生み出し、500 μLペレットは総タンパク質の約7.5mgを生み出します。</li>
	<li>M9 バッファを使用して 3 ~ 5 の追加のステーブルを実行するか( 表 1を参照)、または上清が曇りでなくなるまで実行します。</li>
	<li>ddH2Oで1回の最終洗浄を行います。</li>
	<li>緩いワームペレットを1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移動し、RTで400 x g で2分間スピンダウンします。残りの上清を捨ててパックされたワームペレットを得て、抽出調製に進む。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。ワームペレットは、液体窒素中ですぐにフラッシュ冷凍し、−80°Cまたは液体窒素で保存することができる。ワームペレットは一度だけ解凍でき、再凍結することはできませんのでご注意ください。</li>
</ol>2. 虫ペレットの抽出準備
注:抽出物の調製は、氷上または4°Cで行う必要があります。
<ol><li>凍結した場合は、氷の上にワームペレットを解凍します。 注:サンプル採取中に300μLの所望のパックされたワームペレットサイズが得られなければ、さらなる抽出のために十分な材料が存在するまで、複数の小さいペレットを組み合わせることができます。</li>
	<li>氷冷2xリシスバッファー(60 mM HEPES、pH = 7.4、100 mM塩化カリウム、0.1%トリトンX、4 mM塩化マグネシウム、10%グリセロール、RNase阻害剤を有する2mM DTT、プロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、およびホスファターゼ阻害剤 を参照)およびvtexasase阻害剤を均等に添加します。チューブを下に回転させ、チューブの下部に混合物を集めます。</li>
	<li>金属ビーズを含む1.5 mL RNaseフリーチューブに混合液を移動し( 材料表を参照)、4°Cのビーズミルホモジナイザー( 材料表を参照)にサンプルを入れます。 チューブキャップが締め付けられており、サンプルがホモジナイザー内でバランスが取れていることを確認します。</li>
	<li>最高速度(設定12)で4分間、サンプルを均質化します。</li>
	<li>ビーズからサンプルを取り出し、新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れ。あるいは、ホモジナイザーを備えた磁石を使用して、サンプルからビーズを除去することができる。</li>
	<li>4°Cで20分間19,000xgで抽出物をスピンダウンし、タンパク質抽出物を明確にします。 </li>
	<li>上清を氷上の新鮮な1.5 mLチューブに移し、サンプルの上に形成される白い曇りの沈殿物の持ち越しを避けます。上清は現在、明確化された抽出物です。 注:全タンパク質濃度を決定するために、明確化された抽出物の10 μLを保存します。</li>
	<li>次の実験に直ちに抽出物を使用するか、液体窒素中の抽出物をフラッシュフリーズし、-80°Cで保存してください。 注: プロトコルはここで一時停止される場合があります。抽出物は、超低温(-80°C冷凍庫または液体窒素〜6ヶ月間)で保存することができます。凍結抽出物は一度解凍され、再凍結することはできません。</li>
	<li>メーカーの指示に従って、洗浄剤と互換性のあるタンパク質濃度アッセイキット( 材料表を参照)を使用して、抽出物の総タンパク質濃度を決定します。</li>
</ol>3. 免疫沈降
注:抽出物調製のためのすべての免疫沈降ステップは、氷上または4°Cで行う必要があります。 各免疫沈降に対して2mgの総タンパク質を使用することが推奨されます。しかし、0.8~1mgの全タンパク質を用いた免疫沈降が成功している。常に新鮮なまたは解凍したタンパク質抽出物を使用してください。以下のプロトコルは、2mgの全タンパク質から免疫沈降を行う、または単一の免疫沈降実験を行う方法について概説する。ビーズおよび抗体の量は、複数のサンプルに対して、または異なる量のタンパク質抽出物が使用される場合に、それに応じて増加または減少し得る。
<ol><li>タンパク質抽出物を氷の上に置くか解凍します。試料は、氷冷1xリシスバッファーで10mg/mLまたは5mg/mLに希釈することができる( 表1参照)。</li>
	<li>反転によって磁気ビーズを再中断し、50%ビーズ懸濁液の150 μLを1.5 mLチューブに移します。1分間、または溶液が透明になるまで、氷上のビーズを磁気スタンドにマグネティックします。上清を捨てます。</li>
	<li>マグネットスタンドからチューブを取り出し、ビーズスラリーの2つのボリューム(すなわち、300 μL)を使用して1xのリシスバッファーでビーズを洗浄します。洗浄を2倍にして、合計3回の洗浄を繰り返します。</li>
	<li>150 μL の氷冷ライシスバッファーでビーズを再懸濁します。</li>
	<li>75 μLのビーズスラリーを2mgのタンパク質抽出物に移し、4°Cで1時間、穏やかな攪拌でインキュベートします。後で使用するために氷の上に残りのビーズサスペンションを保存します。 注:このステップは、免疫沈降工程中にビーズに対する非特異的タンパク質結合を低減するために行われます。</li>
	<li>サンプルを入れたチューブを氷の上の磁気スタンドに1分間置くか、ビーズが完全に磁化されてサンプルが透明になるまで置きます。上清を新しい1.5 mLチューブに移します。ビーズを邪魔しないでください。これは、予めクリアされたタンパク質のライセートです。ウェスタンブロット分析のためにサンプルの10%を保存します。</li>
	<li>20 μgのアフィニティー精製抗体を予めクリアしたライゼートに加え、穏やかな攪拌で4°Cで1時間インキュベートします。 注:免疫沈降に使用される抗体の量は、抗体およびタンパク質に特異的であり、標的タンパク質の有効な免疫沈降を確実にするために経験的に決定されるべきである。</li>
	<li>洗浄済みビーズ懸濁液の残りの75μL(ステップ3.5)を抗体/ライセート混合物に加え、緩やかな攪拌で4°Cで1時間インキュベートします。</li>
	<li>チューブを氷の上の磁気スタンドに1分間、またはビーズが完全に磁化され、サンプルが透明になるまで置きます。ウェスタンブロット分析用に上清を保存します(オプション)。</li>
	<li>450 μL の洗浄バッファー (30 mM HEPES, pH = 7.4, 100 mM 塩化カリウム, 0.1% トリトン X, 2 mM 塩化マグネシウム, 10% グリセロール, 1 mM DTT; 表 1)氷上で免疫沈降3x を含むビーズを洗浄します。 注:より厳しい洗浄条件が好ましい場合は、追加の洗浄が行われることがあります。</li>
	<li>2x SDS/BMEタンパク質ゲルローディングバッファー( 材料表を参照)の20 μLでビーズペレットを再懸濁し、SDS-PAGEゲルにロードする前に95 °Cで5分間沸騰して変性します。あるいは、変性したサンプルは、数ヶ月間-20°Cで保存することができる。 注:ビーズ免疫沈降物の一部は、必要に応じて下流RNAの分離のために保存することができます。</li>
</ol>4. IPサンプルのウェスタンブロット検出
<ol><li>IP サンプルを SDS-PAGE ゲルにロードします ( 資料表を参照)。サンプルの吸引前に1分間、IPチューブを磁気スタンドに置くことによってビーズを移すことを避けてください。</li>
	<li>ウェスタンブロッティング15,16および抗体染色16を次の変更で行います: ALG-1 抗体17 1:500 を 5% 非脂肪乾燥乳 (NFDM) で希釈します。HRPK-1抗体2を5%NFDMで希釈する。5%NFDMでAIN-1抗体18 1:10,000を希釈する。二次抗体(材料表を参照)は、メーカーの指示に従って使用されました。</li>
	<li>HRP ベースの化学発光でバンドを検出します ( 材料表を参照)。</li>
</ol>

<ol><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+AP-MS-+and+BioID-compatible+MAC-tag+enables+comprehensive+mapping+of+protein+interactions+and+subcellular+localizations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations.</a> Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).</li>
<li>Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HRPK-1%2C+a+conserved+KH-domain+protein%2C+modulates+microRNA+activity+during+Caenorhabditis+elegans+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development.</a> PLoS Genetics. 15 (10), 1008067(2019).</li>
<li>Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+ALG-1+antimorphic+mutations+uncover+functions+for+Argonaute+in+microRNA+guide+strand+selection+and+passenger+strand+disposal%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).</li>
<li>Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nhl-2+Modulates+microRNA+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 136 (5), 926-938 (2009).</li>
<li>Zou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+decline+in+neuronal+regeneration+by+the+progressive+change+of+two+intrinsic+timers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers.</a> Science. 340 (6130), 372-376 (2013).</li>
<li>Zanin, E., Dumont, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+protein+complexes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of protein complexes in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).</li>
<li>Bhaskaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+Caenorhabditis+elegans+the+easy+way+using+the+Balch+homogenizer%3A+an+old+tool+for+a+new+application%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application.</a> Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).</li>
<li>Kohl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plate-based+Large-scale+Cultivation+of+Caenorhabditis+elegans%3A+Sample+Preparation+for+the+Study+of+Metabolic+Alterations+in+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58117(2018).</li>
<li>Larance, M., Bailly, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable-isotope+labeling+with+amino+acids+in+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes.</a> Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).</li>
<li>Ding, L., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GW182+family+proteins+are+crucial+for+microRNA-mediated+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing.</a> Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).</li>
<li>Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Developmental+Timing+Regulator+AIN-1+Interacts+with+miRISCs+and+May+Target+the+Argonaute+Protein+ALG-1+to+Cytoplasmic+P+Bodies+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans.</a> Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).</li>
<li>Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute+Pull-Down+and+RISC+Analysis+Using+2%E2%80%99-O-Methylated+Oligonucleotides+Affinity+Matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2’-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices.</a> Methods in Molecular Biology. 725, Chapter 16 233-249 (2011).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e759(2008).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359(2010).</li>
<li>Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+conserved+residues+of+the+C.+elegans+microRNA+Argonaute+ALG-1+identify+separable+functions+in+ALG-1+miRISC+loading+and+target+repression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression.</a> PLoS Genetics. 10 (4), 1004286(2014).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Identification+of+C.+miRISC+Proteins%2C+miRNAs%2C+and+mRNA+Targets+by+Their+Interactions+with+GW182+Proteins+AIN-1+and+AIN-2%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2.</a> Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).</li>
<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+Window+into+Biology%3A+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li>
<li>Farboud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Genome+Editing+with+Cas9+Ribonucleoprotein+in+Diverse+Cells+and+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57350(2018).</li>
<li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

C. エレガンスは細胞、分子、および発生生物学19の基本的な質問を研究するための優れたモデルです。遺伝的モデルシステムとしての力に加えて、C.エレガンスは、タンパク質免疫沈降および共免疫沈降を含むがこれらに限定されない生化学的アプローチに適している。免疫沈降実験を行う際の潜在的なハードルの1つは、目的のタンパク質に特異的な抗体の欠如です。抗体が利用できない場合、カスタムポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生成できます。しかし、最近のゲノム編集技術の革新により、研究者は遺伝子とコードタンパク質の間の遺伝的、機能的、物理的相互作用を解明する研究を容易にする突然変異を導入したり、内因性のC.エレガンス遺伝子20,21にタグ付けすることが可能になった。具体的には、内因性遺伝子におけるC.エレガンス遺伝子のCRISPR/Cas9媒介タグ付けは、抗体の入手可能性に対する免疫沈降実験の依存性を低下させ、共免疫沈降実験をはるかに実現可能にしている。C. エレガンス遺伝子は、GFPやmCherryなどの蛍光タグからFLAGやHAなどの小さなタグまで、さまざまなタグでタグ付けできます。これらのタグを認識する抗体は、市販され、免疫沈降法を介したタンパク質とタンパク質相互作用の研究を促進する。
図 1に示すプロトコルは、少数のサンプルに対して実行することも、スケールアップして、一度に最大 24 個のサンプル準備を行うことができます。免疫沈降によるタンパク質相互作用の初期特徴付けは、通常、通常の成長条件下で野生型のバックグラウンドで行われますが、フォローアップ研究では、さまざまな遺伝的背景または異なる成長条件下でタンパク質とタンパク質の相互作用をテストする必要がしばしばあります。同時に複数の抽出物を準備する機能は時間を節約し、重要なことに、異なるサンプル間の抽出準備の一貫性を保証します。目的の免疫沈降タンパク質をコードする遺伝子のヌル突然変異が理想的な制御を使用して、陰性制御が常に必要です(例については、図3および図4を参照)。
この抽出プロトコルは 、C.エレガンス サンプルからの迅速なタンパク質抽出調製を可能にし、ジルコニウムビーズベースの均質化8に匹敵する。一般的にビード均質化は、さまざまなビーズミルホモジナイザーまたは類似の機器を使用して、複数の同時サンプル調製物にスケールアップすることができます。しかし、より経済的なビーズミルホモジナイザーの中には、同時に処理できるサンプルの数を減らすことができるものもあります。あるいは、提示された抽出プロトコルは、経済的な代替を表すdounceベースの抽出調製物と互換性がある。異なるビーズミルホモジナイザーはテストされなかったが 、C.エレガンス サンプルの完全な破壊が達成される限り、ほとんどがこのタンパク質抽出プロトコルと互換性がある可能性が高い。
提示されたように、この抽出調製プロトコルは、タンパク質免疫沈降2およびmicroRNAプルダウン12を含む複数の下流実験と互換性があり、タンパク質およびRNA成分の両方の下流コレクションを可能にする。また、核タンパク質と細胞質タンパク質の両方を効率的に抽出します(図2、図3、および図4)。同様に、提示された免疫沈降プロトコルは、タンパク質関連免疫沈降物からのRNA単離を可能にする。免疫沈降プロトコルはもともとALG-1タンパク質インターアクターを同定するために開発されましたが、この方法は、関心のあるタンパク質間の相互作用をテストするために適応することができます。実際、使用される免疫沈降条件は、ALG-1(図3)およびHRPK-1の免疫沈降に対して同様にうまく機能した(図4)。このプロトコルは、RNA結合タンパク質の免疫精製の出発点として優れています。しかし、バッファー組成のいくつかの変更が、関心のある他のタンパク質に必要な場合もあることに留意すべきである。この変化は、目的のタンパク質の物理的および生化学的特性に依存する可能性があり、ケースバイケースで実装する必要があります。
標的タンパク質(ここでは、ALG-1またはHRPK-1)が免疫沈降したら、ウェスタンブロッティングを使用して、特定のタンパク質インターアクターに対する共免疫沈降物を試験することができる。
あるいは、このコ精製免疫沈降物を質量分析法解析を行い、全ての推定相互作用タンパク質を同定することができる。確認された共免疫沈降相互作用は、その後、特定の相互作用の潜在的な調節を識別するために、様々な遺伝的背景または条件で調べることができます。例えば、hrpk-1がALG-1/AIN-1 miRISCアセンブリで役割を果たしているかどうかを判断するために、ALG-1-AIN-1共降は野生型のバックグラウンドとHRPK-1の不在の両方で評価した(図3)。hrpk-1はALG-1/AIN-1インタラクション2(図3)に対して欠かせないことが判明した。さらに、CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用いて、目的のタンパク質に単一点またはドメイン欠失変異を生成することができます。生成された変異体がタンパク質インターアクターと共沈殿する能力を再テストすることで、どのドメインまたは残基が物理的相互作用を媒介するかを明らかにすることができる。このような将来の研究は、タンパク質機能および調節のメカニズムに関する貴重な情報を生み出すことができる。これらのアプローチは、C.エレガンス遺伝学の力と組み合わせることで、動物の発達と細胞機能を支配する基本的な分子プロセスに関する重要な洞察を提供することができる。

関心のあるタンパク質の高分子相互作用を特定することは、その機能についてもっと学ぶ鍵となる可能性があります。免疫沈降法および共免疫沈降実験は、大規模なプロテオームアプローチ1を介してタンパク質の相互作用体全体を同定したり、仮説を立て相互作用器と共沈殿させるタンパク質の能力を特異的に試験するために使用することができる。C.エレガンスでは、遺伝子発現を調節するためにmicroRNAと密接に機能するものを含む様々なタンパク質の活性についての詳細を学ぶために、両方の方法がうまく採用されている。共免疫沈降実験は、ネイティブの細胞環境でタンパク質とタンパク質の相互作用をテストするという利点がありますが、抽出物の調製は困難で時間がかかる可能性があります。サンプルの効率的なリシスが必要ですが、タンパク質とタンパク質の相互作用の中断を最小限に抑えるために注意する必要があります。5、超音波処理6、バルチ均質化7、ジルコニアビーズ均質化8、9などの方法は、C.エレガンス全タンパク質抽出物を正常に調製するために使用されています。これらの方法は、ジルコニアビーズ均質化を除き、同時に処理できるサンプル数の点で制限がある。提示は、C.エレガンスサンプルから高スループット、迅速なタンパク質抽出物調製を可能にするために容易にスケールアップすることができ、その後に共免疫沈降を行う代替方法である。具体的には、この方法は一度に最大24個のサンプルを調製でき、抽出調製に要する時間を大幅に短縮できる。対照的に、例えば、douncing は一度に 1 つのサンプル調製しか許可しません。この抽出方法は、C. elegansの任意の発達段階からの抽出を準備するために使用できます。
記載されているのは、対象となる共同免疫沈降タンパク質の正常なタンパク質プルダウンおよび検出を確認するための、動物試料の採取、抽出物の調製、免疫沈降、およびウェスタンブロットデータの提示のためのステップバイステップの手順である。プロトコルの有効性を実証するために、2つの共免疫沈降実験を1)マイクロRNAアルゴノーテALG-1とAIN-1、GW182ホモログの間で行った。2) ALG-1およびHRPK-1,新たに同定されたALG-1インタークター2.ALG-1およびAIN-1は、マイクロRNA誘導サイレンシング複合体(miRISC)を構成するコアタンパク質であり、これら2つのタンパク質間の相互作用は10,11に十分に確立されている。この抽出調製プロトコルは、ALG-1-AIN-1共免疫沈降実験において有効であった。このプロトコルは、ALG-1 とその新たに同定されたインタータラクタ HRPK-1 2 との相互作用も確認することに成功しました。
要約すると、原稿は、タンパク質間の新しい相互作用を同定または確認するために使用できる共免疫沈降プロトコルと共に24個のサンプルを同時に処理するためにスケールアップすることができる C.エレガンス 抽出準備プロトコルを記述しています。抽出調製プロトコルは、タンパク質免疫沈降2およびmicroRNAプルダウン12を含む多くの下流実験と互換性がある。さらに、免疫沈降プロトコルは、さまざまな遺伝的背景における任意の2つ以上の内因性、内因的にタグ付けされた、または過剰発現 C.エレガンス タンパク質間の相互作用をテストするために適応することができる。

<table><tbody><tr><td>15 mLチューブ</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td>STEP 1.2</td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample Buffer</td><td>BioRed</td><td>1610737</td><td>STEP 3.11</td></tr><tr><td>4&ndash;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td><td>BioRed</td><td>4561096</td><td>STEP 4.1</td></tr><tr><td>anti-AIN-1 monoclonal antibody</td><td>custom generated</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2, 参照 Zhang et al. 2007</td></tr><tr><td>anti-ALG-1 monoclonal antibody</td><td>custom generated by PRF&LN</td><td>/ a</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>抗HRPK-1モノクローナル抗体</td><td>カスタムPRFおよびPRFによって生成されるモノクローナル抗体L</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>Bullet Blender Storm Homogenizer</td><td>MidSci</td><td>BBY24M</td><td>STEP 2.3</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779-5G</td><td>表 1</td></tr><tr><td>免疫沈降用Dynabeads Protein A</td><td>Thermo Fisher</td><td>10002D</td><td>STEP 3.2</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermo Fisher</td><td>12321D</td><td>STEP 3.2</td></tr><tr><td>EDTAフリープロテアーゼ阻害剤</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>表 1</td></tr><tr><td>GFP 抗体 (FL)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8334</td><td>Figure 2</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher</td><td>G33-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ二次抗体、HRP</td><td>BioRed</td><td>1662408</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>ヤギ抗ラット IgG (H+L) 二次抗体、HRP</td><td>Thermo Fisher</td><td>31470</td><td>ステップ 4.2</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034-500G</td><td>表 1</td></tr><tr><td>LICOR WesternSure PREMIUM 化学発光基質、100 mL キット</td><td>LI-COR</td><td>926-95000</td><td>ステップ 4.3</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物 ACS</td><td>VWR</td><td>VWRV0288-500G</td><td>表 1</td></tr><tr><td>無水硫酸マグネシウム</td><td>サーモフィッシャー</td><td>M65-500</td><td>表 1</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ、1.5 mL</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td>STEP 1.6</td></tr><tr><td>N2 野生型</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Navy RINO RNA Lysis Kit 50パック (1.5mL)</td><td>MidSci</td><td>NAVYR1-RNA</td><td>STEP 2.3</td></tr><tr><td>ホスファターゼ阻害剤カクテル 2</td><td>Sigma</td><td>P5726-1ML</td><td>表1</td></tr><tr><td>ホスファターゼ阻害剤カクテル 3</td><td>Sigma</td><td>P0044-1ML</td><td>表1</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>サーモフィッシャー</td><td>P217-500</td><td>表1</td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーP285-3</td><td>表1</td></tr><tr><td>RC DCタンパク質アッセイキットI</td><td>BioRed</td><td>5000121</td><td>STEP 2.9</td></tr><tr><td>RNaseOUT組換えリボヌクレアーゼ阻害剤</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10777019</td><td>表1</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーS271-500</td><td>表1</td></tr><tr><td>リン酸二塩基性無水</td><td>サーモフィッシャー</td><td>S374-500</td><td>表1</td></tr><tr><td>TritionX-100</td><td>Σ</td><td>X100-500ML</td><td>表1</td></tr><tr><td>UY38 hrpk-1(zen17)</td><td>ご要望</td><td></td><td></td>に応じて対応可能</tr><tr><td>VT1367 col-19::gfp(maIS105)</td><td>ご要望に応じて</td><td></td><td></td>対応可能</tr><tr><td>VT3841 alg-1(tm492)</td><td>ご要望に応じて</td><td></td><td></td>対応可能</tr></tbody></table>

カエノハブディティス・エレガンスからのタンパク質抽出物調製と共免疫沈降

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

共免疫沈降法は、タンパク質とタンパク質の相互作用を研究するために頻繁に使用されます。仮説タンパク質相互作用の確認または新しいタンパク質の同定は、関心のあるタンパク質の機能に関する貴重な情報を提供することができます。抽出の準備のための伝統的な方法のいくつかは、多くの場合、労働集約的で時間のかかる技術を必要とします.ここで、ビーズミルホモジナイザーおよび金属ビーズを用いた改変抽出物調製プロトコルは、従来のタンパク質調製方法に代わる迅速な代替手段として記載されている。この抽出調製方法は、下流の共免疫沈降試験と互換性がある。一例として、この方法は、C.エレガンス マイクロRNAアルゴノーテALG-1と2つの既知のALG-1インターアクターであるAIN-1およびHRPK-1を共同免疫沈降させるために使用された。このプロトコルには、動物のサンプル採取、抽出物の調製、抽出物の明確化、およびタンパク質免疫沈降法の記述が含まれる。記載されたプロトコルは、様々な遺伝的背景における任意の2つ以上の内因性、内因的にタグ付けされた、または過剰発現 C.エレガンス タンパク質間の相互作用をテストするために適応することができる。

このプロトコル(図1でスキーマ化)は、いくつかのタンパク質2の下流免疫沈降に対するC.エレガンス全タンパク質抽出物(図2)を得るために正常に使用された(図3および図4)。提示されたビーズミルホモジナイザープロトコルは、全タンパク質抽出とdounceベースの方法(図2)と効率的に抽出された核(COL-19:::GFP(NLS))および細胞質タンパク質(図3および図4)に匹敵する。様々なサイズの複数のサンプルを同時に抽出した(図2)。アルゴノートタンパク質はGW182タンパク質ファミリーのメンバーと相互作用し、標的メッセンジャーRNAに結合するmiRISCを形成し、その発現を10にリプレスする。図3は、コアmiRISC成分ALG-1およびAIN-1の共免疫沈降が成功したことを示しており、以前の報告11,17と一致する。最近では、microRNAの生物生成と活性が補助因子によってどのように調節されるかについての詳細を学ぶために、アルゴノーテALG-13の追加タンパク質インターアクターを同定する努力がなされました。RNA結合タンパク質HRPK-1をALG-1免疫沈降物3で同定した。この相互作用は、最近、逆HRPK-1免疫沈降実験2で確認された。提示された抽出物および免疫沈降プロトはHRPK-1特異的共免疫沈降物中のALG-1を正常に回復した(図4)。また、ALG-1-AIN-1相互作用は様々な遺伝的バックグラウンドでテストされ、HRPK-1はALG-1/AIN-1 miRISCアセンブリ2には不要であることが示された(図3)。補足的な数値は、全膜をプローブする(補足図1)を示すために提供される。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig1.jpg"> 図1:C.エレガンス抽出製剤および免疫沈降のワークフロー概略図。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig2.jpg"> 図2:核局在GFPのウェスタンブロット比較、COL-19::GFP(NLS)、250 μLおよび100 μLのワームペレットからの日当り調製および均質化されたサンプルのレベル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig3.jpg"> 図3:GW182ホモログAIN-1共免疫沈降をALG-1と共に行う。 ALG-1免疫沈降物中のALG-1およびAIN-1タンパク質のウェスタンブロッティング。ALG-1/AIN-1共免疫沈降は 、hrpk-1 の不在の影響を受けなかった。入力 = IP の 10% です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig4.jpg"> 図4:ALG-1はHRPK-1と共に免疫沈降する。 HRPK-1免疫沈降物におけるHRPK-1およびALG-1に対するウェスタンブロッティングが示されている。入力 = IP の 10% です。*は、抗体重鎖を示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/61243fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">M9 バッファ (1 L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>3 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2HPO4
</td>
			<td>6 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>ナクル</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>1 Lまで</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2x リシスバッファー (5 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヘペス (pH 7.4)</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% トリトンX</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>100%グリセロール</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>5 mLまで</td>
		</tr>
<tr>
<td>新鮮な追加:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M DTT</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTAフリープロテアーゼ阻害剤</td>
			<td>1タブレット</td>
		</tr>
<tr>
<td>ホスファターゼ阻害剤カクテル2</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ホスファターゼ阻害剤カクテル3</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x リシスバッファー</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2xリシスバッファーを同量のddH20で希釈します。</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x洗浄緩衝液10mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヘペス (pH 7.4)</td>
			<td>300 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% トリトンX</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>100%グリセロール</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>10 mLまで</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M DTT</td>
			<td>20 μL(フレッシュ追加)</td>
		</tr>
</tbody></table>表1: レシピ
補足図 1. 図2~4を生成するために使用される完全なプローブされたウェスタンブロット膜を示す。(A) 図2に対するプローブ膜。なお、膜はGFPとチューブリンの同時プローブを可能にするため切断され、全体的なブロットサイズを小さくした。図3の(B)プローブ膜。(C) 図3のプローブ膜。*は抗体重鎖を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61243/Supplemental_Figure_1.pdf" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

この方法は、 カエノハブディティス・エレガンス 試料およびその後の共免疫沈降からの高スループットタンパク質抽出物調製のためのプロトコルについて説明する。

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or ...

このプロトコールは、サンプル収集、抽出物調製、および免疫沈降のための段階的な手順を提供し、成功したタンパク質プルダウンの確認と目的の共免疫沈降タンパク質の検出を実現します。タンパク質抽出物の調製は、最大24のサンプルに対して行うことができ、免疫沈降やRNAプルダウン実験など、多くのダウンストリームアプリケーションに適合します。この方法は、さまざまな遺伝的背景における2つ以上の内因性、内因性、タグ付き、または過剰発現したC.elegansタンパク質間の相互作用の試験を容易にするように適応させることができます。このプロトコルの視覚的なデモンストレーションは、研究者がタンパク質抽出物の調製と免疫沈降に慣れることを目的としており、この技術に不慣れな人々が研究でそれらを使用することを奨励することを願っています。線虫サンプルを採取するには、まず混合段階または同期線虫を必要な温度で固体線虫増殖培地プレート上に播種し、線虫を所望の段階まで増殖させる。インキュベーションの終了時に、M9バッファーを使用して線虫を15ミリリットルの円錐管に洗浄し、遠心分離により線虫をペレット化します。遠心分離の最後に、上清を取り除き、洗浄ごとに新しいM9バッファーでさらに3〜5回ワームを洗浄します。上清が濁らなくなったら、最後に二重蒸留水で洗浄し、ルーズワームペレットを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。追加の遠心分離機でワームをペレット化し、残りの上清を廃棄して、パックされたワームペレットを取得します。採取したワームペレットから抽出物を調製するには、推奨容量の300 μLペレットに等量の氷冷2X溶解バッファーを加え、得られた懸濁液を激しく混合します。サンプルをスピンダウンしてチューブの底に混合物を回収し、チューブの内容物を金属ビーズを含む1.5ミリリットルのRNAseフリーチューブに移します。チューブをしっかりとキャッピングした後、サンプルがホモジナイザー内でバランスが取れているように注意しながら、サンプルを摂氏4度のビーズミルホモジナイザーに入れます。サンプルを最高速度で4分間均質化してから、サンプルをビーズなしの新しい1.5ミリリットル微量遠心チューブに移します。サンプルをスピンダウンしてタンパク質抽出物を清澄化し、サンプル上部の白い濁った沈殿物を移さずに、上清を氷上の新しい1.5ミリリットルチューブに移します。清澄化した抽出物10マイクロリットルを取っておいて、標準的なプロトコルに従って総タンパク質濃度を決定し、すぐにサンプルを氷上で氷冷1X溶解バッファー1ミリリットルあたり5ミリグラムまたは10ミリグラムのタンパク質に希釈します。目的のタンパク質の免疫沈降のためには、まず磁気ビーズを反転して再懸濁し、50Xビーズ懸濁液の150マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに移します。氷上のビーズを磁気スタンドに対して約1分間磁化します。溶液が透明な場合は、上清を捨てます。チューブをマグネットスタンドから取り外し、300マイクロリットルの容量の1X溶解バッファー3個でビーズを洗浄します。最後の洗浄後、ビーズを150マイクロリットルの氷冷溶解バッファーに再懸濁し、75マイクロリットルのビーズスラリーを2ミリグラムのタンパク質抽出サンプルに移します。摂氏4度で穏やかに攪拌しながら1時間インキュベートした後、サンプルチューブを氷上の磁石に約1分間置きます。ビーズが完全に磁化され、サンプルが透明になったら、ビーズを乱さずに上清を新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。サンプルの10%をウェスタンブロット分析用に取っておき、事前に透明化したライセートに20 μgのアフィニティー精製抗体を加えて、摂氏4度で穏やかに攪拌しながら1時間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、残りの75 μLの洗浄済みビーズ懸濁液を抗体溶解物混合物に加え、穏やかな攪拌を行いながら摂氏4度でさらに1時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終了時に、サンプルを磁石に約1分間戻します。ビーズが完全に磁化され、サンプルが透明になったら、免疫沈降物を含むビーズを氷上で450マイクロリットルの洗浄バッファーで3回洗浄します。最後の洗浄後、ビーズペレットを20マイクロリットルの2X SDSベータ-メルカプトエタノールタンパク質ゲルローディングバッファーに再懸濁し、サンプルを摂氏95度で5分間煮沸します。ウェスタンブロット解析による免疫沈降タンパク質の検出には、ビーズを移さずに変性タンパク質サンプルをSDS-PAGEゲルにロードし、目的のタンパク質に適した抗体を使用して標準プロトコルに従ってウェスタンブロット解析を行い、西洋ワサビペルオキシダーゼベースの化学発光を使用してバンドを検出します。実証されたビーズミルホモジナイザープロトコルは、核タンパク質および細胞質タンパク質の効率的な抽出のためのドンスベースの方法に総タンパク質抽出において匹敵します。この解析では、アルゴノートタンパク質は、標的メッセンジャーRNAに結合してその発現を抑制するマイクロRNA誘導サイレンシング複合体を形成するGW182タンパク質ファミリーのメンバーと相互作用することが決定されました。実証済みの抽出物および免疫沈降プロトコルは、ALG-1およびHRPK-1特異的な共免疫沈降物を成功裏に回収するためにも使用できます。さらに、さまざまな遺伝的背景におけるALG-1:AIN-1相互作用の試験により、ALG-1:AIN-1マイクロRNA誘導サイレンシング複合体アセンブリにはHRPK-1が不要であることが明らかになりました。サンプルの安定性を維持するために、タンパク質抽出と免疫沈降が摂氏4度または氷上で行われるようにすることが重要です。この全タンパク質抽出物調製物は、マイクロRNA相補型オリゴヌクレオチドを用いたタンパク質免疫沈降およびマイクロRNAプルダウン実験に適合し、タンパク質およびRNA成分の両方のダウンストリーム収集を容易にします。

protein-extract-preparation-co-immunoprecipitation-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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カエノハブディティス・エレガンスからのタンパク質抽出物調製と共免疫沈降

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