カエノハブディティス・エレガンスからのタンパク質抽出物調製と共免疫沈降

このプロトコールは、サンプル収集、抽出物調製、および免疫沈降のための段階的な手順を提供し、成功したタンパク質プルダウンの確認と目的の共免疫沈降タンパク質の検出を実現します。タンパク質抽出物の調製は、最大24のサンプルに対して行うことができ、免疫沈降やRNAプルダウン実験など、多くのダウンストリームアプリケーションに適合します。この方法は、さまざまな遺伝的背景における2つ以上の内因性、内因性、タグ付き、または過剰発現したC.elegansタンパク質間の相互作用の試験を容易にするように適応させることができます。

このプロトコルの視覚的なデモンストレーションは、研究者がタンパク質抽出物の調製と免疫沈降に慣れることを目的としており、この技術に不慣れな人々が研究でそれらを使用することを奨励することを願っています。線虫サンプルを採取するには、まず混合段階または同期線虫を必要な温度で固体線虫増殖培地プレート上に播種し、線虫を所望の段階まで増殖させる。インキュベーションの終了時に、M9バッファーを使用して線虫を15ミリリットルの円錐管に洗浄し、遠心分離により線虫をペレット

遠心分離の最後に、上清を取り除き、洗浄ごとに新しいM9バッファーでさらに3〜5回ワームを洗浄します。上清が濁らなくなったら、最後に二重蒸留水で洗浄し、ルーズワームペレットを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。追加の遠心分離機でワームをペレット化し、残りの上清を廃棄して、パックされたワームペレットを取得します。

採取したワームペレットから抽出物を調製するには、推奨容量の300 μLペレットに等量の氷冷2X溶解バッファーを加え、得られた懸濁液を激しく混合します。サンプルをスピンダウンしてチューブの底に混合物を回収し、チューブの内容物を金属ビーズを含む1.5ミリリットルのRNAseフリーチューブに移します。チューブをしっかりとキャッピングした後、サンプルがホモジナイザー内でバランスが取れているように注意しながら、サンプルを摂氏4度のビーズミルホモジナイザーに入れます。

サンプルを最高速度で4分間均質化してから、サンプルをビーズなしの新しい1.5ミリリットル微量遠心チューブに移します。サンプルをスピンダウンしてタンパク質抽出物を清澄化し、サンプル上部の白い濁った沈殿物を移さずに、上清を氷上の新しい1.5ミリリットルチューブに移します。清澄化した抽出物10マイクロリットルを取っておいて、標準的なプロトコルに従って総タンパク質濃度を決定し、すぐにサンプルを氷上で氷冷1X溶解バッファー1ミリリットルあたり5ミリグラムまたは10ミリグラムのタンパク質に希釈します。

目的のタンパク質の免疫沈降のためには、まず磁気ビーズを反転して再懸濁し、50Xビーズ懸濁液の150マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに移します。氷上のビーズを磁気スタンドに対して約1分間磁化します。溶液が透明な場合は、上清を捨てます。

チューブをマグネットスタンドから取り外し、300マイクロリットルの容量の1X溶解バッファー3個でビーズを洗浄します。最後の洗浄後、ビーズを150マイクロリットルの氷冷溶解バッファーに再懸濁し、75マイクロリットルのビーズスラリーを2ミリグラムのタンパク質抽出サンプルに移します。摂氏4度で穏やかに攪拌しながら1時間インキュベートした後、サンプルチューブを氷上の磁石に約1分間置きます。

ビーズが完全に磁化され、サンプルが透明になったら、ビーズを乱さずに上清を新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。サンプルの10%をウェスタンブロット分析用に取っておき、事前に透明化したライセートに20 μgのアフィニティー精製抗体を加えて、摂氏4度で穏やかに攪拌しながら1時間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、残りの75 μLの洗浄済みビーズ懸濁液を抗体溶解物混合物に加え、穏やかな攪拌を行いながら摂氏4度でさらに1時間のインキュベーションを行います。

インキュベーションの終了時に、サンプルを磁石に約1分間戻します。ビーズが完全に磁化され、サンプルが透明になったら、免疫沈降物を含むビーズを氷上で450マイクロリットルの洗浄バッファーで3回洗浄します。最後の洗浄後、ビーズペレットを20マイクロリットルの2X SDSベータ-メルカプトエタノールタンパク質ゲルローディングバッファーに再懸濁し、サンプルを摂氏95度で5分間煮沸します。

ウェスタンブロット解析による免疫沈降タンパク質の検出には、ビーズを移さずに変性タンパク質サンプルをSDS-PAGEゲルにロードし、目的のタンパク質に適した抗体を使用して標準プロトコルに従ってウェスタンブロット解析を行い、西洋ワサビペルオキシダーゼベースの化学発光を使用してバンドを検出します。実証されたビーズミルホモジナイザープロトコルは、核タンパク質および細胞質タンパク質の効率的な抽出のためのドンスベースの方法に総タンパク質抽出において匹敵します。この解析では、アルゴノートタンパク質は、標的メッセンジャーRNAに結合してその発現を抑制するマイクロRNA誘導サイレンシング複合体を形成するGW182タンパク質ファミリーのメンバーと相互作用することが決定されました。

実証済みの抽出物および免疫沈降プロトコルは、ALG-1およびHRPK-1特異的な共免疫沈降物を成功裏に回収するためにも使用できます。さらに、さまざまな遺伝的背景におけるALG-1:AIN-1相互作用の試験により、ALG-1:AIN-1マイクロRNA誘導サイレンシング複合体アセンブリにはHRPK-1が不要であることが明らかになりました。サンプルの安定性を維持するために、タンパク質抽出と免疫沈降が摂氏4度または氷上で行われるようにすることが重要です。

この全タンパク質抽出物調製物は、マイクロRNA相補型オリゴヌクレオチドを用いたタンパク質免疫沈降およびマイクロRNAプルダウン実験に適合し、タンパク質およびRNA成分の両方のダウンストリーム収集を容易にします。