生体内心筋修復用ヒトiPS細胞由来のメッシュ状の設計心臓組織の調製
2020年6月9日
本プロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞由来の心血管細胞を含むメッシュ状の人工心臓組織を生成し、心臓病の細胞移植療法の調査を可能にする。
このプロトコルは、ヒト誘発身体部分およびSTEM細胞由来の心臓細胞に由来するメッシュ状の人工心臓組織を作成するための高貴で容易な方法を記述する。組織形状の柔軟性と保存された組織機能のスケーラビリティは、この技術の主な利点です。埋め込まれたメッシュ形状ETは、ラット心筋梗塞モデルにおける心臓構造および機能を回復させることができる。
心臓再生療法での使用のためのその実現可能性を確認する。これらの技術は、再現性のあるヒトSTEM細胞処理と一貫した結果のための組織培養スキルを必要とします。硬化したPDMSシートを適切なサイズに切断して、シリコーン接着剤でシートを接着し、幅0.5ミリメートル幅7ミリメートル、高さ2.5ミリメートルの長方形ポストをずらした位置で21~20.5ミリメートルの長方形トレイを製造できるようにします。
2 行の柱の間の水平方向の間隔は 2.5 ミリメートルにする必要があります。PBSで1%ポロクサマー407で金型を1時間コーティングする前に、20分間120°Cでトレイをオートクレーブします。その後、PBSで鋳型を十分に洗い流し、金型を6ウェルプレートの1つの井戸に入れます。
系統解析では、心筋細胞の細胞と内皮および血管壁細胞プロトコルを組み合わせます。壁画細胞の最終的な濃度が、構成毎に6倍の細胞数の合計10〜20%となるようにする。酸溶性ラットテールコラーゲンタイプ1溶液の133マイクロリットルとアルカリバッファーの17マイクロリットルを氷の上の10倍最小必須培地の17マイクロリットルに混合します。
その後、コラーゲン溶液に67マイクロリットルの基部膜マトリックスを加えます。次に、細胞を遠心分離し、胎児ウシ血清と抗生物質を添加した高グルコースダルベックコのミニマルエッセンシャル培地の167マイクロリットルでペレットを再懸濁する。マトリックス溶液上の細胞を氷の上で混ぜます。
次に、細胞マトリックス懸濁液の400マイクロリットルをポロクサマー407被覆PDMS組織型に慎重に注ぎ込んだ。セルマトリックス混合物を標準細胞培養インキュベーターで摂氏37度、炭酸ガス5%で60分間インキュベートします。組織が形成されたら、4ミリリットルのECT培養培地で慎重にモールドを浸し、14日間細胞培養インキュベーターにプレートを戻す。
ECTの注入の前に、あなたは慎重に負荷のポストからECTを取除くために細かい鉗子を殺菌した。組織金型は、さまざまなパターン、ポスト長、ポスト間隔で製造され、異なる最終的なECT形状を生成することができます。この解析では、幅が 2.5 ミリメートルの長さ 7 ミリの長いポストを持つ金型を使用しました。
ポロクサマー407は、細胞のカビへの接着を防止し、14日間での急激なゲル圧縮に続く特徴的なメッシュ構造の形成を可能にする。この構造は、ECTが金型から解放された後も維持されます。作製された組織の構造は、幅約1.5センチメートル、厚さ0.5ミリメートルです。
そして、メッシュ内の各バンドルの幅は平均で約0.5ミリメートルです。同じずれたポスト設計で4倍の大きな金型から2400万個の細胞を含む3センチメートルの最終幅メッシュECTを生成することが可能です。この大きなメッシュECTは、金型から容易に除去することができ、より小さなメッシュECTと同等の力のローカル行為を生成します。
最終的なゲルの欠陥を感じないように気泡を発生させることなく、細胞マトリックス混合物を組織型に均等に注ぐことが重要です。契約者の機能特性。4 番目の周波数関係は、内蔵システムを使用して実行できます。
私たちの究極の目標は、ECTパラダイムを大規模な動物前臨床試験を利用した臨床療法への翻訳です。
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概要
本プロトコルでは、ヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）由来のメッシュ状エンジニアード心筋組織を作製するための、新規かつ簡便な手法について解説します。この技術により、心疾患に対する細胞移植療法の研究、特にラット心筋梗塞モデルを用いた検討が可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 心臓組織工学
- 幹細胞治療
- 再生医療
背景
- エンジニアリングされた心臓組織は、心臓の構造および機能を回復させることができます。
- ヒト人工多能性幹細胞は、心臓細胞誘導のための貴重なリソースとなります。
- 組織形状の柔軟性は、効果的な移植を行う上で極めて重要です。
- 一貫した結果を得るためには、幹細胞処理における再現性が不可欠です。
研究目的
- メッシュ状の構築心組織を作製する方法を開発すること。
- 心臓再生治療におけるこれらの組織の実現可能性を評価すること。
- 移植後の心機能の回復について検討すること。
使用方法
- PDMSおよびシリコン接着剤を用いた長方形トレイの作製。
- 構築組織を支持するためのポストの作製。
- ラットモデルへの構築心臓組織の移植。
- 心臓の構造および機能回復の評価。
主な結果
- メッシュ状に作製された心臓組織によって、心機能の回復に成功した。
- 本手法は、組織の形状における拡張性と柔軟性を実証した。
- 再現性のある幹細胞処理により、一貫した結果が得られた。
- 本技術は、心臓再生療法への応用が可能である。
結論
- 本プロトコルは、エンジニアリング心臓組織を作成するための信頼性の高い手法を提供します。
- メッシュ状の組織は、心筋梗塞モデルにおいて心機能を効果的に回復させることができます。
- このアプローチは、将来の心臓再生治療への展望をひらきます。
よくある質問
産業界における重要性
本プロトコルでは、ヒトiPSC由来の心血管細胞を用いて、メッシュ状のエンジニアリング心筋組織をスケールアップして作製する方法を提示しており、心筋修復戦略のための再現性のあるプラットフォームを提供します。この手法は、虚血性損傷モデルにおける組織統合と機能回復の前臨床評価を可能にし、再生循環器学における重要な課題を解決します。幾何学的な調整が可能でスケーラブルな構築物を提供することで、心不全に対する幹細胞療法のトランスレーショナルなリスク軽減を促進します。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： hiPSC由来心細胞のin vivoにおける構造的および機能的統合を評価することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 実用的価値： 標準化され再現性のある組織フォーマットを提供し、研究間での一貫した前臨床的なアウトカム測定を可能にする。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 機能的アッセイの開発に向けて、定量可能な構造的指標（例：筋線維束の配向、同期収縮）を算出できる。
- 運用の価値： より大きな構造体（最大 3.0 cm）へのスケールアップに対応しており、用量反応試験やバッチ間の一貫性試験が可能となる。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： ラット心筋梗塞モデルにおいて心臓の構造および機能の回復が可能であることを実証し、メカニズム上のリスク低減を裏付けている。
- 運用上の価値： 標準化された移植および機能評価ワークフローを通じて、基礎研究から前臨床検証への橋渡しを行う。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、メッシュ状のECTを探索から前臨床への架け橋として位置づけており、拡張可能で再現性のある組織作製を通じて、初期探索段階での仮説検証および前臨床段階での機能的妥当性の検証を可能にします。
- 探索生物学：hiPSC由来心筋細胞の統合および電気機械的機能の制御された評価を可能にし、パスウェイの解明と生物学的リスクの低減を支援します。
- スクリーニング：化合物や条件の比較に向け、定量可能な出力（拍動の同調性、配向性）を備えた、アッセイ準備済みの標準化組織を提供します。
- 分析：構造的および機能的なリードアウト（構成体の寸法、筋線維径、収縮の同調性）を提供し、実験群間の比較分析を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：in vitroでの成熟からin vivoでの機能回復までの連続性を確保し、リスク調整に基づいた進展決定を支援します。
- エンタープライズ再利用：さまざまな形状やスケールに適応可能なプラットフォーム技術を確立し、プロジェクトを横断した再現性とリソース効率を向上させます。
運用および企業への影響
- 科学的価値：幹細胞の生着および心臓修復への機能的寄与におけるメカニズム的な曖昧さを低減することで、予測の信頼性を高めます。
- 運用の価値：定義された細胞比率、マトリックス組成、およびモールド形状を通じて、標準化とスケーラビリティを確保します。
- 戦略的価値：再現性のある前臨床有効性データを提供することで、Go/No-go判断を改善し、後期段階における生物学的リスクを低減します。
- ポートフォリオへの影響：検証済みの組織性能とスケーラビリティに基づき、心筋再生候補物質のリスク調整済み優先順位付けを可能にします。
実施上の考慮事項
- ヒトiPSC分化、心血管系への系統分化、および3D組織培養技術に関する専門知識が必要です。
- PDMSモールド作成設備、滅菌設備、およびマトリックスと細胞の混合のための精密な液体ハンドリングへのアクセスに依存します。
- バッチ間の整合性を確保するため、細胞調達、マトリックス調製、およびインキュベーションプロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- より大きな構造体や異なる形状にスケールアップする場合、特に栄養素の拡散と電気的結合に関する適応上の検討が必要となります。
- 機能検証を現在のげっ歯類モデルに依存していることに制限があり、臨床応用に向けたより大規模な前臨床システムが必要となります。
