Name: 創傷による多重化を研究する ショウジョウバエ モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 学ぶ創傷誘導多倍体化のメカニズムをショウジョウバエ上皮組織で。ステンレス鋼ピンによる穿孔傷を用いて、細胞サイズとDNA含量を評価し、組織修復における多倍体化の重要性を解明する方法です。

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ボストン・カレッジでは、イメージング用のラボのカメラとステレオスコープの顕微鏡のセットアップ、ボストン・カレッジ・イメージング・コアのブレット・ジャドソンのインフラとサポートに対するエリック・フォークサー博士に感謝したいと思います。また、ブルーミントン・ショウジョウバエストックセンター(NIH P40OD018537)、ウィーン・ショウジョウバエ資源センター、ハーバード大学医学部TRiPセンター(NIH/NIGMS R01-GM01-GM01-GM084947)のフライコミュニティリソースに感謝します。マウスFasIII抗体は、NIHのNICHDによってサポートされている発生研究ハイブリドーマ銀行から得られ、アイオワ大学、アイオワシティ、アイオワシティ、アイオワシティ、アイオワ市で維持されました。本論文で報告された研究は、賞番号R35GM124691の下で国立衛生研究所の国立一般医学研究所によってサポートされました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

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<li>Galko, M. J., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+genetic+analysis+of+wound+healing+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae.</a> PLoS Biology. 2 (8), E239(2004).</li>
<li>Losick, V. P., Fox, D. T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidization+and+cell+fusion+contribute+to+wound+healing+in+the+adult+Drosophila+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Polyploidization and cell fusion contribute to wound healing in the adult Drosophila epithelium.</a> Current Biology. 23 (22), 2224-2232 (2013).</li>
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<li>Losick, V. P., Jun, A. S., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound-Induced+Polyploidization%3A+Regulation+by+Hippo+and+JNK+Signaling+and+Conservation+in+Mammals%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Wound-Induced Polyploidization: Regulation by Hippo and JNK Signaling and Conservation in Mammals.</a> PLoS One. 11 (3), e0151251(2016).</li>
<li>Tamori, Y., Deng, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+repair+through+cell+competition+and+compensatory+cellular+hypertrophy+in+postmitotic+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue repair through cell competition and compensatory cellular hypertrophy in postmitotic epithelia.</a> Developmental Cell. 25 (4), 350-363 (2013).</li>
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本講演は、創傷修復16の間に再上皮化および内用複製を改変して遺伝子がどのようにWIPを調節するかを研究するために、成人D.メラノガスター腹上皮を解剖し、使用する方法についての詳細なプロトコルである。この方法を用いて、プロトオンコジーンMycは最近、WIPの主要な調節因子として同定された。Mycは、上皮細胞が傷害後に内分化するために必要であり、静止した上皮細胞が成人フライ上皮および付属腺16,22,22の両方で内輪に充分である。また、stgの発現により上皮細胞を有糸分裂細胞周期に切り替えることは、fzrRNAiが創傷修復に有害であることも明らかになった。この方法を用いた継続的な研究は、WIP中の再上皮化および内用複製を調節するために必要な他の遺伝子を同定し、多富高化がどのように調節され、様々な組織において機能するのとの類似性と相違点を明らかにする。
このモデルと方法は、機械的穿刺による多倍数の容易な誘導や、4日目に多倍細胞が生成されるという事実を含む、ユニークな利点を提供する。組織解剖および準備プロトコルは幼虫解離技術23に基づいているが、成人の飛ぶ腹部はより硬く、したがって容易に摂動される。その結果、このプロトコルは、WIPを研究するために無傷の組織を分離するための練習と精度を必要とします。しかし、いったん解剖されると、上皮ははっきりと見え、容易に画像化され、創傷治癒過程のスナップショットを得る。この方法は、成体フライの上皮組織、細胞およびシンクティウムサイズ、および細胞および個々の核の策略に関する豊富な情報を提供する。その不透明なキューティクルによる無傷のフルーツフライ内でのライブイメージングはまだ不可能であるが、このプロトコルは、D.メラノガスターで使用される現在利用可能なex vivo培養条件を含むように適応することができる。
今後、Gal4/UASシステムを用いて他の細胞タイプの関心を持つ遺伝子発現を調節することで、細胞間クロストークや他の細胞タイプのWIPへの寄与を研究するのに理想的なモデルとなるでしょう。同様の質問は、さまざまな遺伝的背景と変異背景を使用して答えることもできます。解剖された成体の飛ぶ腹部には、脂肪体やオエノサイト、横筋線維、感覚ニューロン、気管、マクロファージ様血球など、この方法を用いて容易に可視化できる様々な細胞タイプが含まれています。さらに、このモデルは、生理学的変数が性、食事、感染、年齢、環境ストレッサーを含むWIPにどのような影響を与えるかを調査することを可能にする。プロトコルは、その大きなサイズのために成人の女性のハエを使用していますが、WIPはまた、男性のフルーツフライ(ジェルスヴィークとロシック、未発表)で発生します。多倍化細胞は、哺乳類の肝臓、脳、眼、および心臓12における老化および加齢に伴う疾患の間に生じることが判明した。フルーツフライモデルは、ヒト疾患関連遺伝子が高度に保存されているため、生理学的および疾患の文脈における多重化を研究することを可能にする。

ショウジョウバエメラノガスターは、上皮創傷修復の細胞および分子機構を研究する魅力的なモデルシステムです。哺乳類と同様に、使用される組織修復機構は、組織とその発達段階の両方に依存する。上皮のリーディングエッジでアクトミオシン「財布ひも」が形成されるフルーツフライ胚では瘢痕のない創傷治癒が起こり、創傷をシームレスに11,22に閉じ込めてしまう。幼虫、子犬、および成体果実ハエにおける胚後創傷治癒は、細胞外マトリックスリモデリング、メラニン瘢痕形成、および上皮細胞増殖33、4、5、64,5,6をもたらす。上皮細胞は、細胞融合と内輪によって大きさが大きくなり、有糸分裂33、4、7、84,7,をバイパスする不完全な細胞周期である。その結果、細胞損失は細胞分裂の代わりに多倍体細胞増殖によって補償される。成人のハエ後腸、中腸、および濾胞上皮も、組織損傷後の細胞喪失を補償するために多発性細胞増殖に依存している99,10,,11.
多倍率は植物や昆虫の生物発達の有名な側面であるが、ここ数年で多プロイディは脊椎動物12の保存された組織修復戦略であるということがより明らかになってきた。その心臓を再生する能力を有するゼブラフィッシュは、損傷した外心13を治癒するために多倍体細胞増殖に依存している。多倍数はまた、急性傷害後の哺乳類の肝臓再生および腎尿細管上皮修復に寄与する14,15。,15これらの例では、多倍体細胞は、エンドサイクルまたはエンドミトーシスのいずれかを介してエンドレプリケーションによって生成され、これはサイトカネシス12のブロックによる二核細胞をもたらす。謎は、創傷修復中に多倍化細胞が生じる理由と、多プロイドが組織機能にどのように影響するかである。最近の研究は、多倍化が治癒の利点または欠点を提供するかどうかの問題に新しい洞察を提供しています。ゼブラフィッシュの外皮において、多倍化は創傷治癒13の速度を高める。D. メラノガスター後腸および哺乳動物の肝臓において、多プロイディは発癌性増殖11,14,14に対する保護であることが判明した。成体のハエ上皮では、最近、多プロイドが遺伝子毒性ストレス16の存在下で創傷修復を可能にすることが分かった。内用複製はDNA損傷に対して耐性があり、細胞増殖が損なわれると創傷治癒が可能になる17.しかし、マウスおよびゼブラフィッシュの心臓における心筋細胞の場合、多倍化は治癒を遅らせ、瘢痕形成18、19,19を増強する。したがって、臓器および/または細胞の種類に応じて、多倍化は有益または有害な組織修復戦略であり得る。D.メラノガスター遺伝学のアクセシビリティと創傷による多重化(WIP)応答の分析により、この創傷治癒戦略を導く分子および細胞機構を解明するための理想的なモデルシステムとなっています。
ここでは、成人 D.メラノガスター 上皮におけるWIPを分析するためのプロトコルを提示する。フルーツフライの損傷、解剖、免疫染色、取り付け、イメージング、および再上皮化、細胞融合、および内用複製(ploidy)の分析のための指示が含まれています。イメージングおよびプロイド解析は、WIPが発生するかどうかをテストするために他のモデルに適応することもできます。なお、核DNA含有量の増加に伴い、核サイズの増加が多い。しかし、生物学では、核の大きさがプロイド20の対応する変化を反映していない例が多くあります。細胞がしばしば広がったり、創傷部位を覆うために伸縮したりする創傷環境の文脈で核の大きさを解釈する場合は、さらに注意する必要があります。したがって、プロイドの変化の唯一の決定的な証拠は、この方法(または全ゲノムシーケンシングのような他の人)21によってDNA含有量を測定することにある。この方法は、創傷修復における多倍数の役割および調節を研究するモデルとして、成人 D.メラノガスター 腹部上皮の適合性を高める。

<table><tbody><tr><td>35 mm シャー</td>レ <td>フィッシャー・サイエンティフィック</td>・サイエンティフィック・<td>イFB0875713</td> 50 mL コニカル遠心チューブ<td>で解剖するプレートの作成</td></tr><tr><td></td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>14-432-22</td> アクシオイメージr M2 with Apotome Zeiss NA で<td>染色試薬を調製</td></tr>するため <tr><td></td><td></td><td></td><td>イメージングサンプル</td></tr><tr><td>用 ブローガンミニ</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>54-104M</td><td>D.メラノガスターの麻酔用株</td></tr><tr><td>ウシ 血清 アルブミン、30%</td><td>Sigma</td><td>A7284-500ML</td><td>免疫維持用</td></tr><tr><td>二酸化炭素タンク</td><td>各種ディストリビューター</td><td>N/A</td><td>麻酔用 D. melanogaster株</td></tr><tr><td>Click-iT EdU 594 キット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>C10339</td><td>EdUアッセイ用</td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>3406</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>シグマ</td><td>を取り付けるためD9542-10MG</td> 解剖プレートの<td>免疫維持用</td></tr><tr><td>(Sylgard 184 Sil Elastic Kitを使用)</td><td>エルスワース接着剤</td><td>184SIL</td><td>解剖用のプレート作成用。指示に従ってエポキシを混合し、一晩乾燥させます</td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 488コンジュゲート</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーA21206</td><td>二次免疫ロ</td></tr><tr><td>バ抗ウサギIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 568コンジュゲート</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーA10042</td><td>ショ</td></tr><tr><td>ウジョウバエのチューブおよびフィッティング</td>二次免疫化用 <td>Genesee Scientific</td><td>59-124C、59-123、59-140</td><td>For anethesizing D. melanogaster strains</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>For dissecting</td></tr><tr><td>epi-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (b)</td><td>b38793</td><td>Losick et al. Current Biology, 2013</td></tr><tr><td>epi-Gal4, UAS-mCD8.RFP</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (b)</td><td>b38793, b27392</td><td>Losick et al. Current Biology, 2013</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>倍数性計算の実行用</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ (画像解析ソフトウェア)</td><td>NIH</td><td><a href="https://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij</a></td><td>画像解析用</td></tr><tr><td>Fly food</td><td>Archon Scientific</td><td>N/A</td><td>コーンシロップ/大豆食品</td></tr><tr><td>Flystuff Flypad</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td>麻酔用 D.メラノガスター菌</td></tr><tr><td>ガラス解剖皿</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>13-748B</td> スライド<td>ガラスの解剖を行うため</td></tr><tr><td></td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>12-518-104C</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG(H+L)二次抗体、Alexa Fluor 488コンジュゲート</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーA11001</td><td>ヤ</td></tr><tr><td>ギ抗マウスIgG(H+L)二次抗体、Alexa Fluor 568の取り付け用抱合</td>型<td>サーモフィッシャー</td><td>A11031</td><td>二次免疫剤用</td></tr><tr><td>グレースの昆虫媒体、未補充</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11595030</td> 昆虫ピン<td>の解剖用</td></tr><tr><td></td><td>ファインサイエンスツール</td><td>26002-10</td><td>フライ腹部の傷とピン留め用</td></tr><tr><td>フラットマウス抗ファシクリンIII(ショウジョウバエ) 一次抗体</td><td>開発研究 ハイブリドーマバンク</td><td>7G10</td><td>上皮細胞間接合部の免疫染色用</td></tr><tr><td>Mouting 培地</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>イメージング中の光漂白を防ぐための退色防止封入剤</td></tr><tr><td>マニキュア</td><td>電子顕微鏡 Sciences</td><td>72180</td><td>シーリングスライド用</td></tr><tr><td>オルチバルシェーカー</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-217-988</td><td>免疫染色用</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水、PH 7.4</td><td>シグマ</td><td>P3813-10PAK</td><td>染色用</td></tr><tr><td>ピンホルダー</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>91606-07</td><td>傷害用</td></tr><tr><td>ウサギ 抗グレニーヘッド 一次抗体</td><td>N/A</td><td>N/</td><td>A 上皮核の免疫染色用。抗体作製プロトコールが見つかる(文献#4および8)</td></tr><tr><td>ウサギ抗RFP一次抗体</td><td>MBL</td><td>PM005</td><td>mCD8-RFPハエ上皮の免疫染色用</td></tr> 実<tr><td>体顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>SZ51</td><td>ハエ組織の解剖と装着用</td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>シグマ</td><td>10789704001</td><td></td></tr><tr><td>UAS-E2F RNAi、UAS-RacDN</td><td>VDRC (v)、ブルーミントンショウジョウバエストックセンター (b)</td><td>v108837, b6292</td><td>Losick et al. Current Biology, 2013</td></tr><tr><td>UAS-fzr RNAi, UAS-Stg</td><td>VDRC (v) and Bloomington Drosophila Stock Center (b)</td><td>v25550, b56562</td><td>Grendler et al. Development, 2019</td></tr><tr><td>UAS-Myc</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (b)</td><td>b9674</td><td>Grendler et al. Development, 2019</td></tr><tr><td>UAS-myc RNAi</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (b)</td><td>b36123</td><td>Grendler et al.開発、2019</td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td>解剖用</td></tr></tbody></table>

創傷による多重化を研究する ショウジョウバエ モデル

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

多倍数は、生物の健康と病気への影響がまだ十分に理解されていない頻繁な現象です。細胞は、その染色体の二倍体コピー以上を含む場合、多倍体として定義されます。組織修復では、創傷誘発性多重化(WIP)は、フルーツハエから脊椎動物への保存治癒戦略であることが判明している。WIPは、細胞増殖に対していくつかの利点を有する, 発癌性の成長および遺伝子毒性ストレスへの耐性を含む.課題は、なぜ多倍体細胞が生じ、これらのユニークな細胞がどのように機能するのかを特定することです。提供されるのは、穿刺創傷後2日以内に多プロイド細胞が生成される成体果実フライ上皮におけるWIPを研究するための詳細なプロトコルである。 D.メラノガスター の広範な遺伝的ツールキットを利用して、Mycを含むWIPを開始し、調節するために必要な遺伝子が同定され始めました。この方法を用いた継続的な研究は、性別、食事、年齢を含む他の遺伝的および生理学的変数がWIPの機能を調節し、影響を与える方法を明らかにすることができる。

D.メラノガスターをモデルとして使用して、創傷による多重化(WIP)を研究するための詳細なプロトコルが提供されています。この創傷治癒モデルは、哺乳類およびWIPの他のフライモデルに対して多くの利点を提供する。多倍率は、昆虫ピンと多倍細胞を用いた機械的穿刺によって容易に誘発され、短時間(2-3dpi)内で生成された(図1A、1B)4。4主な課題は、上皮への摂動を伴わない無傷の腹部組織の解剖である。D. メラノガスター上皮は、鋭い解剖ツールで誤ってぶつかったり傷ついたりしやすい。したがって、このプロトコルの手順は、使用および分析の前に実践する必要があります。
まず、損傷は腹側の女性腹部に制限され、イメージングに理想的な大きな平らな不透明な組織領域を提供する。穿刺傷は、腹側中線胸膜の両側にあり、テルギート(T)セグメントT4-T5の間を標的とする胸膜上皮に与えられた(図1A-C)。この創傷の配置は解剖によって中断されない大きい目に見える区域を提供する。挑戦的なステップは腹部の春のはさみの切り取りおよび固定のステップ(図1D、1E)である。バネ切断ステップは、腹部がグレースの溶液(〜30 μL)の体積を減らして組織の動きを減らすと最も良く働いた。腹筋中線に沿って十分に中心を持つカットは、解剖プレートにピン開けするのに十分な腹部の折り返しの領域を提供するために必要でした(図1C)。腹部は、過度の力をかけずに四隅に静かに固定する必要があります(図1E)。硬すぎるピンプッシュは腹部組織を歪め、組織を解剖プレートに押し込むことさえできる。この場合、組織を廃棄する必要があります。腹部組織が固定されると、免疫蛍光染色が完了し、腹部をイメージング用のガラスカバースリップに取り付けるまで、解剖板に残った(図1F)。
創傷治癒は、連続上皮シートを形成する必要があり、これは、内複製および細胞融合44、1616に依存する。細胞-細胞接合を標識するセプテット接合タンパク質FasIIIは、調製中に何らかの処理摂動が起こったかどうかの指標を提供した(図1G,1H)。傷領域を摂動させる大きな傷(染色されていない領域)を有する腹部は廃棄しなければならず、さらなる分析には使用されなかった(図1H)。
次のステップは、WIPの欠陥がない場合に無傷のサンプルを分析することです。このプロトコルには、WIP応答のさまざまな側面を検出するための個別のアッセイが含まれています(図2)。中央の大きな多核細胞が創傷のかさぶたを覆ったときに創傷修復が完了した(図3A)。ここで細胞融合は、FasIII/Grhに対する染色と、FasIIIの概説領域4に包含されるGrh+上皮核の数を定量することによって検出した。上皮シートの&gt;10μmの隙間が認められた場合、創傷閉鎖または再上皮化の欠陥が検出された(図3B、赤矢印)。これは、例えば、stgの発現を介した有糸分裂サイクルの活性化によってWIPが阻害された場合、fzrRNAiが、最近報告された16のようにした。この遺伝的状態では、創傷の52%が創傷のかさぶたの上に連続的な上皮シートを形成できなかった(図3B、3C)。
このモデルにおける創傷修復を測定する別の方法は、上皮膜をUAS-mCD8-ChRFP4のエピギャル4発現で可視化4した(図2、図3D)。この対照では、上皮創傷の91%が3dpiで完全に閉じたが、エンドレプリケーション(E2f1RNAi)および細胞融合(RacDN)を遮断することによってWIPを阻害すると、同時に、前述のように、上皮創傷の92%が完全に開いたままにした(図3D、3E)8、16。8,16stgの発現による有糸分裂細胞周期の活性化により、fzrRNAiも上皮創傷閉鎖欠陥をもたらした。しかしながら、上皮細胞膜を可視化することにより、再上皮化欠陥の程度を決定することができた。WIP変異体(E2f1RNAi、RacDN)フライ創傷はstgよりも開いていた、fzrRNAi創傷(図3D、破線赤の輪郭)16。この膜創傷治癒アッセイは、創傷修復欠陥の程度に関するより多くの情報を提供した。その結果、再表皮化欠陥は、完全に開いた、部分的に閉じた(すなわち、&gt;10μmのギャップ)、または完全に閉じた(図3D、3E)としてグループ化される可能性がある。
細胞融合に加えて、上皮細胞は、核DNA含有量を倍増させる不完全な細胞周期である内複製によって大きくなる。細胞周期活性と直接核DNAプロイド測定の両方によって、内結複製をアッセイした(図2および図4)。ここで、細胞周期活性は、チミジンアナログ、EdU(図4A、4B)の組み込みによって検出された。D. メラノガスター上皮細胞は、内膜に入ることを発見した, 介入 M 相を介さずに S と G 相の間で振動する不完全な細胞周期4,12.成人D.メラノガスターダイエットは、怪我の前にEdU+食品を補充し、ハエは2dpiで解剖するまでEdU+ダイエットで維持された(図4A)。その後、製造元のClick-iTプロトコルを使用してEdUが検出されました。このEdUアッセイは、創傷に応答してS相に入るために引き起こされた核の場所、時期、および数を決定するために使用されました。Gal4/UASシステムを用いて、最近では、mycの上皮特異的発現がS相に入る上皮細胞の能力をブロック(mycRNAi)または悪化(Myc過剰発現)することができることが分かった。その結果、Mycは、16,22,22の損傷を受けなくても、死後の細胞における内複製を誘導するのに十分であることを示している。
次に、上皮策略は、核DNA含有量を直接測定することによって決定した。上皮核は、上皮特異的マーカー、Grh(図4D)に対する免疫蛍光染色によって同定した。フィジーのイメージングソフトウェアでは、上皮核を全身的に同定し、Grh核染色を使用して閾値を設定した。次いで、核を分離し、ROIをスタックDAPI画像のSUMに重ね合わせた(図4D、緑の矢印)。選択した核の統合密度を測定する前に、重なり合う任意の核を手動で削除した(図4D、赤い矢印)。この半自動化された方法は、損傷を受けていない、修復されたフライ腹部上皮8を通してほとんどの核の分布とプロイドを定量化することを可能にする。最近報告されたように、創傷を取り囲む上皮核は、3dpiで3C以上のDNA含量を有する44%の多重原子核から構成された(図4E、4F)16。16EdUの結果から予想されるように、mycのノックダウンは、上皮核のわずか9%が多倍化であったのに対し、Mycの過剰発現は創傷部位の周りに100%多プロイド上皮核をもたらしたのに対し、内複製において有意なブロックにつながった(図4F)16。上皮核の大きさも、縮小または拡大した核を有するmyc発現によっても目に見えて影響を受けた。しかし、核領域は、プロイドおよび生理的効果の正確な尺度ではなく、細胞伸張などの要因も核DNA含有量20に影響を与えることなく核サイズに影響を与えることができるためである。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61252/61252fig1.jpg"> 図1:成人フルーツフライ腹部の傷、解剖、および組織の取り付け。(A)成人腹部創傷アッセイの図。ハエはテルギート4(T4)で腹部の両側に負傷する必要があります。(B)成人女性果実フライ3 dpi、創傷治癒から形成されたメラニンのかさぶた(白い箱)。スケールバー= 50 μm(C) 解剖された成人腹部、後ろ図、タージットがラベル付けされている。腹部は、後側の正中線(白い破線)をフィレした。スケールバー= 50 μm(D) ピン留め前に解剖し、成人腹部を充填した。スケールバー= 50 μm(E) 解剖プレートに大人の腹部を固定します。後部側の腹部の四隅にピンを置いた。組織は、引き裂きを避けるために、穏やかに開かれたが、伸ばされなかった。(F)成人腹部を取り付け、腹部の内側をカバースリップに向け、キューティクルをガラススライドに向けたガラスカバースリップの上に置いた。(G) FasIII は、処理の摂動がなく、中央のシンクティウム (黄色の破線) を伴う無傷の創傷領域を染色する。スケールバー= 50 μm(H)シンジチウムを破壊する未染色のFasIII領域を有する傷の傷領域(*)の画像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61252/61252fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61252/61252fig2.jpg"> 図 2: 仕掛品分析ワークフロー フローチャートは、この研究で説明した3つのアッセイと、WIP応答を検出して測定するための重複する明確なステップを示しています。EdUアッセイは、細胞周期活性(青い箱)を測定し、プロイドおよび再上皮化はGrh/FasIII免疫染色(緑色のボックス)によって検出され、膜RFPの発現は上皮創傷閉鎖の程度(ピンクの箱)の測定を可能にする。一般的なステップは灰色の箱にあり 、D.メラノガスター 株遺伝子型は上記に記載されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61252/61252fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61252/61252fig3.jpg"> 図3:WIP中の再上皮化を検出する方法。WIPが遺伝的に阻害されたときに再上皮化が摂動された。コントロールの免疫蛍光画像(A)およびstg、fzrRNAi(B)を3dpiで示す。B上皮核とセプテ結合は、それぞれGrh(緑色)およびFasIII(マゼンタ)で染色された。(A'とB')FasIII染色単独では、stg、fzrRNAi上皮において再上皮化が損なわれた(赤矢印)ことが示された。スケールバー = 50 μm(C) 再上皮化欠陥の定量化 (%)3 dpi(グレー):コントロール(n = 8)、stg、fzrRNAi(n = 6)で。誤差範囲は標準誤差を示します。統計的有意性は、学生のT検定**P&lt;0.01を介して測定された。創傷修復中の再上皮化は、epi-Gal4,UAS-mCD8-RFPを用いたRFPに連結した膜の発現によっても検出することができた。(D) コントロールの免疫蛍光画像, E2F1RNAi, RacDN, stg, fzrRNAi 3 dpi.スケールバー= 20 μm傷跡(黄色の輪郭)および開いた上皮の創傷領域(赤い輪郭)。(E)ctrl(n=11)、E2F1E RNAi、RacDN(n=13)、RNAiおよびstg、fzr RNAi(n=13)RNAiにおける創傷閉鎖の定量化。グレンドラーら16.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61252/61252fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61252/61252fig4.jpg"> 図 4: WIP 中の endoreplication を検出する方法(A)EdUアッセイのタイムライン:成人ショウジョウバエは、怪我の2日前に毎日5mM酵母-EdUの75 μLを与えられ、2 dpiまで続いた。(B) 2 dpi でエピギャル4/UAS系で発現されるハエ株中のEdU標識の免疫蛍光画像。傷つぶし(W).スケールバー= 50 μm(C) 2 dpi での1フライあたりのEdU+上皮核の平均数: ctrl (n = 37)、myc RNAi#1 (n = 10)、Myc (n = 8)。 Myc誤差範囲は標準誤差を示します。統計的有意性は、学生のT検定、*P&lt;0.05、**P&lt;0.01を介して測定された。(D) 上皮核策略の検出と測定の概略図。上皮核は、フィジーの抗Grh染色によって同定され、閾値された。重なり合う上皮核は、無形成核によって重ね合わせれば分離(緑色の矢印)または除去(赤矢印)であった。対応するDAPI染色核画像の積分密度と核面積を測定した。(E)上皮核サイズ(Grh)は3dpiでmyc発現によって変化した。(F)上皮核策略(%)3 dpi: ctrl (n = 4)、mycRNAi#1 (n = 6)、および Myc (n = 3) です。グレンドラーら16.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61252/61252fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

創傷誘発倍化は、細胞の損失を補うために分割する代わりに細胞のサイズが成長する保存された組織修復戦略です。ここでは、上皮創傷修復における策略とその遺伝的調節を測定するモデルとしてフルーツフライを使用する方法に関する詳細なプロトコルがあります。

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it ...

このプロトコルは、創傷誘発倍化を研究するために使用することができる。細胞が成体のフルーツフライで分裂する代わりに成長する組織修復プロセスを保存する。単純な穿刺傷は、わずか2日以内にハエ上皮の多倍率を誘発するために作ることができる。上皮細胞のサイズ、策略および組織は、その後容易に評価することができる。興味のある株の10〜15新しく閉じた女性のフルーツハエを含む2つのバイアルを収集することから始めます。そして、生鮮食品バイアルでハエを老化させ、生後3〜5日まで摂氏25度でバイアルあたり約5匹のオスのハエを飼育しています。腹部の傷のために、インキュベーションの終わりに、単一の0.1ミリメートルのステンレス鋼のピンを使用して、各ピンの鋭い端がペースアウトして、いくつかのピンホルダーを組み立てます。老朽化した雌のフルーツフライをステレオ顕微鏡で二酸化炭素フライパッドで麻酔します。そして、行にハエを配置するためにペイントブラシを使用しています。安全メガネを着用し、片手にピンホルダーを持ち、もう一方の手に鉗子を使用して、腹側腹部を上に向けてハエを配置します。その後、成人雌ハエは、腹側中中線の両側の標的A4の上皮青色右領域内で穿刺し、負傷したハエを目的の実験時間後の傷害まで食物バイアルに戻す。実験エンドポイントでは、ステレオ顕微鏡の下で麻酔フライごとに創傷と傷跡の存在を確認し、グレースの溶液で9つの井戸ガラス解剖皿の1つの井戸を満たします。鉗子のペアを使用して、胸郭の後ろ側で負傷した女性のハエをつかみ、溶液の井戸にハエを沈めます。一方、2番目の鉗子を使用して、フルーツフライの後部にあるターゲットA6の下の後部キューティクルを穿刺して取り除きます。内臓が抽出されない場合は、腹部の背側に圧力をかけ、残りの器官を絞り出す。鉗子を使用して、ターゲットA2の上の胸郭接合部の完全な腹部を取り除き、約100マイクロリットルのグレース溶液を含むウェルに腹部を移します。すべての腹部が収集されたら、コレクション内のグレースの溶液の量を30マイクロリットルに減らします。一方の手で鉗子を使用して腹部の後側を下に保持し、もう一方の手を使用してヴェネツィアのスプリングハサミの底刃を各腹部の腹腔に挿入し、腹部が完全に開くまで後回し中線に沿って切断します。腹部取り付け領域あたり4.1ミリメートルのピンを備えた乾燥解剖板の各取り付け領域にグレースの溶液の30マイクロリットルを追加し、フィレ化された腹部を溶液の液滴に入れます。すべての腹部がフィレ化され、配置されたら、4つの後ろ隅の皿に腹部を固定します。組織が引き裂いたり、腹部の組織を伸ばしたりすることなく平らに横たわっていることに注意してください。次に、Graceの溶液を30マイクロリットルの固定液を取り付け面積あたりに交換します。各皿の底にテープラベルを貼って、各コントロールと実験グループをマークします。フライ組織サンプルを取り付ける。染色後、解剖板から腹部を立体視顕微鏡で固定解除するために鉗子を使用します。また、鉗子を使用して、個々のガラスカバースリップ上の約30マイクロリットルの取り付け媒体に、その後側の側面によって各サンプルを移す。ステレオ顕微鏡の下では、内側がカバースリップに向かって下向きになるように腹部組織を向け、鉗子を使用して配向腹部を各メディアの液滴の端まで引っ張ります。取り付けられた各カバースリップをラベル付きのガラススライドに置きます。そして、ラボ組織を使用して、余分な取り付け媒体を除去します。その後、透明なマニキュアでカバースリップの端を密封し、そのイメージングまで4°Cでスライドボックスにスライドを保存します。セプセート接合タンパク質は、細胞細胞接合を標識する3つの速い、調製中に何らかの処理摂動が起こったかどうかを示す指標を提供する。傷領域を摂動する未染色領域の大きな傷を有する腹部は、廃棄され、分析に含まれてはならない。創傷修復は、中央の大きな多核細胞が創傷のかさぶたを覆うときに完了する。上皮シート上の10マイクロメートルを超えるギャップは、創傷閉鎖および再上皮化における欠陥と考えられる。この代表的な分析では、有糸分裂細胞活性化を阻害したハエを用いて、創傷の52%が創傷のかさぶたの上に連続的な上皮シートを形成することができなかった。この膜創傷治癒エッセイは、創傷修復欠陥の程度により多くの情報を提供し、再表皮化欠陥を完全に開いた、部分的に閉じた、または完全に閉じたものとしてグループ化することができる。例えば、本実験では、エンド複製と細胞融合の同時遮断による創傷誘発多重化の阻害は、上皮創傷の92%で完全に開いたままにする。有糸分裂細胞周期の活性化は上皮創傷閉鎖欠陥をもたらした。また、チミジンアナログEDUの組み込みにより細胞周期活性を検出し、上皮策略は核DNA含有量を直接測定することによって決定した。腹部上皮を解剖する際には、サンプルを傷つけるため、ディセッティングツールで組織に触れないように注意してください。解剖後、細胞増殖、細胞死、細胞損失切開サイズまたは核DNA含有量評価を行い、創傷誘発倍化をより良く理解することができる。または上皮内の他のプロセス。

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Research

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