Name: メタボロミクス解析とリピドミクス解析のための脳腫瘍の現場でのサンプリングと抽出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: 学ぶ脳腫瘍の現場でのSPMEサンプリングとメタボロミクス・リピドミクス解析の手法。神経膠腫と髄膜腫からの代謝物抽出により、迅速な術中診断とバイオマーカー発見が可能となる。

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この研究は、国立科学センターからの助成金ハルモニア2015/18/M/ST4/00059によって支えられた。著者らは、メルクKGaA、ダルムシュタット、ドイツのビジネスであるMilliporeSigmaが、この作業で使用されるSPMEデバイスを提供していることを認めたいと考えています。メルクのライフサイエンス事業は、米国とカナダでミリポアシグマとして事業を展開しています。また、著者らは、Q-Exactive Focus軌道質量分析計へのアクセスに対するサーモフィッシャーサイエンティフィックに感謝したいと考えている。
著者の貢献: JB: サンプル調製およびLC-MSパラメータの最適化, SPME-LC-MS実験のパフォーマンス, データ解析, 統計解析とデータ解釈とリピドミクス部分に関連する原稿調製;PZG:病院でのサンプリングの大部分の調整とパフォーマンス、サンプリングおよびサンプル調製パラメータの最適化、SPME-LC-MS実験の性能、データ分析、統計解析およびデータ解釈、メタボロミクス部分に関連する原稿調製。MG – サンプル調製の最適化、LC-MS法およびリピドミクス部分に関連するデータ分析の支援;KG:SPMEサンプリングの共同性能とサンプリングおよびサンプル調製の最適化、メタボロミクス部分に関連するSPME-LC-MS分析。KC:病院での複数のSPMEサンプリングの性能、サンプルの最適化、サンプル調製、メタボロミクス部分に関連するデータ分析の支援。KJ:病院でいくつかのSPMEサンプリングのパフォーマンス、リピドミクス分析の支援;DP:外科的処置のパフォーマンス、患者の募集;JF:手術のパフォーマンス、患者の募集;MH: 手術のパフォーマンス, 研究の臨床部分の調整;BB:コンセプト、プロジェクトのコーディネート監督、原稿の準備、いくつかのサンプリングのパフォーマンス

本明細書に提示された研究は、トルンのニコラウス・コペルニクス大学のビドゴシュチのコレギウムメディクムの生命倫理委員会によって承認された(KB 628/2015)。常にラボコートと、安全手袋や眼鏡などの(ただしこれらに限定されない)他の必要な個人的な安全装置を着用することを忘れないでください。固相微小抽出(SPME)プローブの抽出段階には触れないでください。
1. SPMEデバイスの準備
<ol><li>メタボロミクスとリピドミクスに対しては、混合モードとC18コーティングを使用します。メタボロミクス用とリピドミクス用のサンプルを2セット収集します。</li>
	<li>SPMEプローブをトリミングして、プローブのコーティングを最適な長さに調整します。現在の研究では、選択されたコーティング長さは7mmであった。研究中の腫瘍の大きさに応じて繊維の長さを選択し、吸着剤全体を腫瘍に浸漬できることを保証する(図1)。</li>
	<li>プローブをメタノールに浸してプローブのコーティングを調整する:抽出手順の前に最低1時間の水50:50 v/v混合物。コンディショニング溶液を含むバイアル中のサンプリング部位(例えば、病院)に繊維を輸送する。</li>
</ol>2. サンプル収集手順
<ol><li>SPME抽出の前に、いかなる方法でも腫瘍を洗浄または退治しないでください。</li>
	<li>腫瘍除去後できるだけ早くサンプリングを開始します (提示された研究で 2 分). 注:特定の施設のオンサイト設定(手術台からの研究者の作業現場の距離)に応じて時間を調整し、研究全体で一定に保ちます。腫瘍の除去と抽出開始の間の経過時間を最小限に抑えることは、血液循環が研究された組織から遮断された後に分解する不安定な代謝産物の捕獲にとって極めて重要である。</li>
	<li>室温でサンプリングを行います。あるいは、抽出が行われるときに氷の上にサンプルを置く。いずれの場合も、サンプルのセット全体で同じ条件を維持します。</li>
	<li>バイアルからプローブを取り出します。</li>
	<li>液体クロマトグラフィー質量分析(LC/MS)グレード水で繊維を5秒の水で洗浄し、LC/MSグレードの水に浸します。データの再現性を確保するために、繊維挿入前に吸着剤を乾燥させないでください。</li>
	<li>できるだけ離れた脳腫瘍組織に繊維を挿入し、抽出段階全体が腫瘍内に位置することを保証する。 注: 腫瘍の異種性を判断するために、抽出を複製で行うことを推奨します(図2)。1 サンプルにつき 3 回の反復が推奨されます。</li>
	<li>プローブを組織に30分間放置します(タイマーで測定)。</li>
	<li>ブランクコントロールを使用して、サンプリングされた腫瘍以外のソースに由来するアーティファクトの存在に関連するエラーの原因を排除します。空白のコントロールを取得するには、上記のように同じ分析ワークフローにファイバーを対象としますが、サンプリングステップ(組織またはその他のサンプル/マトリックスへの挿入)はありません。データ処理ステップでは、これらの繊維から抽出した分析物を「除外リスト」にまとめ、溶媒や繊維製造に由来する汚染物質に由来するシグナルを除外します。少なくとも 3 つの複製の空白を使用することをお勧めします。 注: 汚染のリスクを確認するには、手袋、テーブル、装置、または汚染のリスクを引き起こす可能性のあるその他の表面からのサンプリングを行う必要があります。このような場合、繊維調製、抽出時間、および脱離プロトコルは、サンプルの場合と同じです。</li>
	<li>抽出が行われている間、抽出後のプローブの保存に使用するバイアルにラベルを付ける。</li>
	<li>30分後、脳腫瘍から繊維を取り除きます。</li>
	<li>LC/MSグレードの水に浸して水で繊維を洗浄し、血液や細胞の破片の残渣をプローブから取り除き、最終的な抽出物には小分子しか含めないようにします。長い洗浄ステップは、極性化合物の損失につながる可能性があるため、推奨されません。</li>
	<li>高速液体クロマトグラフィー(HPLC)バイアルキャップのプレスリットセプタに繊維を固定化し、繊維の非コーティング端でセプタを底部から突き刺します。</li>
	<li>キャップに固定化した繊維を別々のHPLCバイアルに入れ、選択した輸送容器に入れます。</li>
	<li>ブランクコントロール専用のファイバーの場合は、ステップ 2.11~2.13 を実行します。</li>
</ol>3. 輸送と保管
メモ: サンプルを実験室に輸送するためのオプションはいくつかあります。ドライアイスで満たされた液体窒素デュワーまたはポリスチレンボックスを輸送に使用することをお勧めします。あるいは、アイスパックは、即時かつ迅速な輸送のために使用することができます。
<ol><li>輸送コンテナに繊維を含むバイアルを置きます。</li>
	<li>実験室到着時に、すぐに-80 °Cまたは-30 °Cの冷凍庫にSPME繊維とバイアルを置く。-30°Cで3年以上、-80°Cで5年以上繊維を保管しないでください。</li>
</ol>4. メタボロミクス分析のサンプル調製
注: この手順は、実験のすべてのサンプルが収集された後にのみ実行する必要があります。
<ol><li>器械分析の前に、脱離溶媒混合物を準備する:アセトニトリル:水80:20 v/v。</li>
	<li>混合モードの繊維を含むバイアルを冷凍庫から取り出します。メタボロミクス分析に使用します。</li>
	<li>脱着に使用するラベルバイアル。</li>
	<li>2 mL バイアルに入れたガラスのインサートに脱離液のピペット 300 μL (ステップ 4.1 で準備) 。</li>
	<li>脱着溶媒にコーティングを完全に浸漬し、ボルテックスを使用して1,200rpmで120分間攪拌することにより、別々のインサートに入れた各繊維からの脱離を行います。</li>
	<li>120分後(脱着が完了したら)、プローブでキャップを取り外します。</li>
	<li>サンプルセットから各サンプルの10 μLアリコートを混合してQCサンプルを調製します。サンプルセットのサイズは実験計画によって異なります。すべてのサンプルを 1 つのバッチとして分析することが重要です。</li>
	<li>新しいキャップでバイアルを閉じます。</li>
	<li>バイアルを液体クロマトグラフィーのオートサンプラー(4°C)に入れ、高分解能質量分析計(LC-HRMS)をステップ5に進めます。 注: コントロールブランクを含むサンプルの射出順序をランダム化します。8~10サンプルごとにQCサンプルを注入し、機器の安定性を監視します。</li>
</ol>5. 逆相液体クロマトグラフィーと高解像度質量分析計を用いたメタボロミクス解析(RPLC-HRMS解析)
<ol><li>LC-HRMS 分析および正イオン化モードのパラメータを設定します。 注: 現在のスタディでポジティブ モードで使用されたパラメータは次のとおりです。解像度70 000;AGC(1,000,000イオン)を使用して行われた取得。Cトラップに時間を注入する:自動。スプレー電圧:1.5キロボルト;SレンズRFレベル:55%;Sレンズ電圧:25 V;スキマー電圧:15 V;キャピラリー温度:300°C;シースガス:40 a.u.auxガス:15 a.u.auxガスヒーター温度:300°C このクロマトグラフィー法はヴコビッチら7.注入の容積: 10 μL。</li>
	<li>LC-HRMS 分析および負イオン化モードのパラメータを設定します。 注: 負のモードで現在のスタディで使用されるパラメータ: スキャン範囲: m/z 80-1000;解像度70 000;AGC(1,000,000イオン)を使用して行われた取得。Cトラップに時間を注入する:自動。スプレー電圧:2.5キロボルト;SレンズRFレベル:55%;Sレンズ電圧:-25V;スキマー電圧: -15 V;毛細管温度:256 °Cシースガス:48 a.u;auxガス:11 a.u.;ガスヒーター温度:413°C このクロマトグラフィー法はヴコビッチらから7.注入の容積: 10 μL。</li>
	<li>メーカーが推奨する機器を調整します。 注:現在の研究では、計器は48時間ごとに外部キャリブレーションを使用して較正され、質量精度<2 ppmをもたらしました。</li>
	<li>計測器を操作するソフトウェアの [スタート] ボタンをクリックして、解析を開始します。</li>
	<li>分析が完了したら、RPLC 列を HILIC 列に置き換え、移動相を変更してステップ 6 に進みます。</li>
</ol>6. 親水性相互作用液体クロマトグラフィーと高解像度質量分析計を用いたメタボロミクス解析(HILIC-HRMS解析)
<ol><li>LC-HRMS 分析および正イオン化モードのパラメータを設定します。 注: 現在のスタディでポジティブ モードで使用されたパラメータは次のとおりです。解像度70 000;AGC(1,000,000イオン)を使用して行われた取得。Cトラップに時間を注入する:自動。スプレー電圧:1.5キロボルト;SレンズRFレベル:55%;Sレンズ電圧:25 V;スキマー電圧:15 V;シースガス:60 a.u.auxガス:40 a.u.Auxガスヒーター温度:425 °C;キャピラリー温度:325°Cクロマトグラフィー法はヴコビッチらから適応した。注入の容積: 10 μL。</li>
	<li>LC-HRMS 分析および負イオン化モードのパラメータを設定します。 注: 負のモードで現在のスタディで使用されるパラメータは次のとおりです: m/z 80-1000;解像度70 000;AGC(1,000,000イオン)を使用して行われた取得。Cトラップに時間を注入する:自動。スプレー電圧:1.3 kV;SレンズRFレベル:55%;Sレンズ電圧:-25V;スキマー電圧: -15 V;キャピラリー温度:263 °C;シースガス:60 a.u.auxガス:30 a.u.ガスヒーター温度:425°C クロマトグラフィー法はヴコビッチらから適応した。注入の容積: 10 μL。</li>
	<li>メーカーが推奨する機器を調整します。 注:現在の研究では、計器は48時間ごとに外部キャリブレーションを使用して較正され、質量精度<2 ppmをもたらしました。</li>
	<li>計測器を操作するソフトウェアの [スタート] ボタンをクリックして、解析を開始します。</li>
</ol>7. 脂質分析のためのサンプル調製
注: この手順は、実験のすべてのサンプルが収集された後にのみ実行する必要があります。
<ol><li>分析を開始する前に、脱離溶媒混合物を調製:イソプロパノール:メタノール50:50 v/v。</li>
	<li>冷凍庫からリピドミクス分析専用のC18繊維を含むバイアルを取り出します。</li>
	<li>脱着に使用するラベルバイアル。</li>
	<li>2 mLバイアルに入れた分離溶液(ステップ7.1で調製)のピペット200μLを、シラナイズガラスインサートにする。 注:非シンバライズインサートも使用できますが、そのような化合物はガラス壁に特に付着し得るため、高logPを有する化合物の再現性が悪くなる可能性があります。</li>
	<li>各繊維から脱離溶媒にコーティングを完全に浸漬し、ボルテックスを使用して1,200rpmで60分間攪拌することにより、別々のインサートで脱離を行います。</li>
	<li>脱着が完了すると60分後にプローブでキャップを取り外します。</li>
	<li>サンプルセットから各サンプルの10 μLアリコートを混合してQCサンプルを調製します。サンプルセットのサイズは実験計画によって異なります。すべてのサンプルを 1 つのバッチとして分析することが重要です。</li>
	<li>新しいキャップでバイアルを閉じます。</li>
	<li>バイアルを液体クロマトグラフィーのオートサンプラー(4°C)に入れ、高分解能質量分析計(LC-HRMS)をステップ8に進めます。</li>
</ol>8. 逆相液体クロマトグラフィーと高解像度質量分析法(RPLC-HRMS分析)を用いたリピドミクス解析
<ol><li>LC-HRMS 分析および正イオン化モードのパラメータを設定します。 注: 正イオンモードでの現在のスタディで使用されるパラメータは次のとおりです: m/z 100-1000;AGC(1,000,000イオン)を使用して行われた取得。Cトラップに時間を注入する:自動。スプレー電圧:3.5 kV、SレンズRFレベル:55%;Sレンズ電圧:25 V;スキマー電圧:15 V;キャピラリー温度275°C;シースガス:30 a.u.auxガス:10 a.u.予備のガス:2 a.u.;プローブヒーター温度300°C。LC パラメータは次のとおりです: メタノール:水、酢酸アンモニウム 10 mM と 1 mM 酢酸を持つ 40:60;相B:イソプロパノール:メタノール、10mM酢酸アンモニウムおよび1mM酢酸を有する90:10;勾配: 0 分 – 20% B;1.0分 - 20% B;1.5分 - 50% B;7.5分 - 70% B;13.0分 - 95% B;17.0分 - 95% B;17.1分 - 95.5 % B;23.0分 – 停止;C18カラム、3.5 μm、2.1 mm x 75 mm;流れ:0.2 mL/分;オーブン温度:55 °C;注入の容積: 10 μL。</li>
	<li>LC-HRMS 分析および負イオン化モードのパラメータを設定します。 注: 現在のスタディで使用されているパラメータは次のとおりです: 負イオンモードの HRMS パラメータ: スキャン範囲: m/z 100-1000;AGC(1,000,000イオン)を使用して行われた取得。Cトラップに時間を注入する:自動。スプレー電圧:3.5 kV、SレンズRFレベル:55%;Sレンズ電圧:-25V;スキマー電圧: -15 V;キャピラリー温度275°C;シースガス:30 a.u;auxガス:10 a.u.予備のガス:2 a.u;プローブヒーター温度300°C。 クロマトグラフィー法:8.1と同様。</li>
	<li>メーカーが推奨する機器を調整します。 注:現在の研究では、計器は48時間ごとに外部キャリブレーションを使用して較正され、質量精度<2 ppmをもたらしました。</li>
	<li>計測器を操作しているソフトウェアの [スタート] ボタンをクリックして、分析を開始します。</li>
	<li>解析が完了したら、RPLC 列を HILIC 列に置き換え、移動相を変更してステップ 9 に進みます。</li>
</ol>9. 親水性相互作用液体クロマトグラフィーと高解像度質量分析計を用いたリピドミクス解析(HILIC-HRMS解析)
<ol><li>LC-HRMS 分析および正イオン化モードのパラメータを設定します。 注: 正イオンモードでの現在のスタディで使用されるパラメータは次のとおりです: m/z 100-1000;AGC(1,000,000イオン)を使用して行われた取得。スプレー電圧:1.5キロボルト;SレンズRFレベル:55%;Sレンズ電圧:25 V;スキマー電圧:15 V;キャピラリー温度325°C;シースガス:60 a.u.auxガス:30 a.u.予備のガス:2 a.u.;プローブヒータ温度 320 °C LC パラメータを使用した: フェーズ A: 5 mM 水中酢酸アンモニウム;相B:アセトニトリル;勾配: 0 – 2分 – 4% B;15.0 - 20% B;15.1 – 4% B, 21.0 分 – 停止;3 μm 100 mm x 2.1 mm カラム;フロー:0.4 mL/分;オーブン温度:40°C。注入の容積: 10 μL。</li>
	<li>LC-HRMS 分析および負イオン化モードのパラメータを設定します。 注: 負イオンモードでの現在のスタディで使用されるパラメータは次のとおりです: m/z 80-1000;AGC(1,000,000イオン)を使用して行われた取得。スプレー電圧:1.5 kV、SレンズRFレベル:55%;Sレンズ電圧:-25V;スキマー電圧: -15 V;キャピラリー温度320 °C;シースガス:50 a.u.auxガス:21 a.u.予備のガス:3 a.u.;プローブヒーター温度320°C。 クロマトグラフィー法は9.1に記載したものと同様であった。</li>
	<li>メーカーが推奨する機器を調整します。 注:現在の研究では、計器は48時間ごとに外部キャリブレーションを使用して較正され、質量精度<2 ppmをもたらしました。</li>
	<li>計測器を操作するソフトウェアの [スタート] ボタンをクリックして、解析を開始します。</li>
</ol>10. データ処理と統計分析
<ol><li>生データファイルのフォーマットと互換性のあるソフトウェアを使用してデータを処理します。</li>
	<li>処理されたデータを使用して統計分析を実行します。 注: 検定の種類は、科学的仮説と研究の設計によって異なります。現在の研究では、主成分分析、部分最小二乗判別分析、および一方向のANOVAが使用されました。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

非標的メタボロミクスおよびリピドミクスは、腫瘍バイオマーカーの同定に焦点を当てた研究で一般的に使用される。しかし、ほとんどの場合、研究者は病気のスクリーニングに使用できる化合物を探します。その結果、好ましい生物学的サンプルは、比較的容易にアクセスしやすいため、血液または尿である。腫瘍組織の分析は、主に疾患の背後にあるメカニズムを理解し、異なる腫瘍タイプを特徴付けるために行われます。腫瘍バイオマーカーの現場での分析はほとんど行われないです, そのようなアプリケーションは、広範なサンプル調製を必要とするので、.あるいは、特定のバイオマーカーの事前選択なしに組織プロファイルのリアルタイム分析に基づく戦略は、医学界3、4の注目を集めています。本明細書に示すソリューションは、そのような方法で得ることができる情報の種類を明らかにすることによって、現場で組織処理に関する別の視点を提供します。
サンプリング、サンプルの準備、抽出の組み合わせにより、オンサイト分析に非常に便利なツールとしてSPMEがレンダリングされます。さらに、サンプリング中の組織消費の不足により、バイオマーカー分析とルーチンテスト(ジェノタイピング、組織学的解析)に同じサンプルを使用することができ、標準試験の結果に新しい情報を追加できます。サンプリングデバイスは非常にシンプルな設計をしており、その操作は非常に簡単で、抽出自体を実行するための特別な訓練は必要ありません。しかし、信頼性の高い結果を得るには、デバイスの適切な処理以上のものが必要です。実験を適切に実行するには、抽出プロセス、サンプルの性質を理解し、データに影響を与える可能性のある間違いを認識する必要があります。
癌組織10の不均一性を考慮することが重要である。サンプルされた腫瘍は壊死、石灰化、低酸素症を起こしている部分を含むことがあり、これらのプロセスのそれぞれがメタボロームおよびリピドームに反映され、結果に影響を与える。したがって、空間分解能サンプリングは、癌組織の異なる部分に複数の繊維を挿入することによって行うか、あるいは、腫瘍に関する平均情報を得るために腫瘍全体を浸透させるためにより長いコーティングを使用することを推奨する。空間分解サンプリング法を実行すると、繊維はすべて1つの脱離溶媒に脱離することができます。これは腫瘍に関する全体的な情報の達成を可能にするだけでなく、分析の感受性を高める。あるいは、個々の繊維を別々のバイアルに脱離することで、癌細胞で構成される脳腫瘍の内部多様性と、健康な組織の境界である外帯を解明するための調査が可能になる。腫瘍のより深い部分は、通常、癌11に関連するプロセスによってより損傷を受ける。しかし、研究者は、このオプションは、方法の感度と検出可能な化合物の全体的な数を損なう点に留意する必要があります。現在の作業では、7ミリメートルのコーティングが使用されました。この長さは、研究に含まれる腫瘍の様々なサイズに最適であると考えられていた。コーティングは腫瘍を貫通し、非特殊な分解能を提供したが、サンプル全体の平均データを提供した。選択されたプロトコルに関係なく、個々のサンプリングに使用される繊維の数、コーティングの長さ、抽出時間、およびこの研究で説明される他のすべての要因を含む、研究全体の間に同じプロトコルに従うことが重要です。
解析の品質を制御することが重要です。プールされた QC (プロトコルのステップ 4.7 および 7.7 を参照) を準備し、サンプル バッチ全体の実行中に機器の安定性を監視するために使用する必要があります。ブランク制御(ステップ2.8を参照)は、溶媒または繊維製造から発生する汚染物質の信号を除去する「除外リスト」を後で作成するために使用することができます。汚染の危険性など、特別な場合には、汚染のリスクを引き起こす可能性のある手袋、テーブル、装置、その他の表面からのサンプリングを行う必要があります。このような場合、繊維調製、抽出および脱離プロトコルの時間は、サンプルと同じである。
メタボロミクスおよびリピドミカル解析は、生物に現れる小分子(1,500 Da未満)、または特定の器官、組織、液体、細胞などの生物の特定の成分に完全に焦点を当てています。メラボロミクスとリピドミクスは、体内で生化学的変化が起き、がんの場合は、腫瘍のゲノム、組織学、悪性腫瘍に関連する情報を統合します。これらのオミクス科学は、代謝産物がタンパク質または遺伝子12よりも生化学的なはしごの上にあるように生理学と表現型の間の接続を作成します。癌性腫瘍のメタボロムとリピドメを理解することで、これらの研究部門が様々な刺激に対する生物の反応として分子の動的変化に関するより深い知識を提供するので、我々はすべてのオミクス科学の間で表現型を発見することに近づく。本研究で示したように、1回のサンプリングで得られたデータは、癌の細胞質の細胞質、悪性腫瘍の程度に対応し、ゲノムレベルで起こる変化を反映している。神経膠腫では、この研究に関心のある癌の種類として、ゲノムに隠された情報は特に重要であり、遺伝子検査の結果に基づいてパーソナライズされた治療法が開発される。特定の突然変異は、化学療法または放射線療法の結果の予後マーカーである。ここで示したように、提案された戦略では、所定の突然変異を反映するバイオマーカーの選択が可能である。突然変異マーカーは、腫瘍の悪性度を示すものなどの追加の記述子タイプと同様に、日常的な診断方法をサポートするためにも使用され得る。
固相マイクロ抽出繊維を用いてのエキビボ化学生検は、術中診断法への応用の第一歩である。この方法は、適切な倫理委員会からの許可を保留しているin vivoサンプリングに対して簡単に採用することができます。このような場合、SPMEデバイスの滅菌は、サンプリングが運ばれる病院の受け入れられた滅菌手順、すなわちオートクレーブまたはエチレンオキシド滅菌に従って行われなければならない。事前に調整され、滅菌された繊維は、殺菌期限が付いた密封されたパッケージに保管する必要があります。繊維は界面活性剤を使用して洗浄すべきではないことに注意することが重要です。このような手順は、吸着剤組成の非特異的な変化を引き起こし、したがって、分析物の抽出に影響を与える可能性があります。本明細書に記載の研究では、30分の抽出期間が使用されたが、他の報告では、より短い時間が、生体内研究13において満足のいく結果を生じさせることができると検証している。Huqらは、単純行列14よりも複雑なマトリックスとして、組織において検体平衡時間がより速く達成されることを示した。しかし、より多くの分析物が平衡前の条件下で抽出されるように得られた結果の再現性は、より短い抽出期間の下で損なわれる可能性があります。したがって、正確な時間制御を実装する必要があります。
この研究の一環として利用されたオミックス科学の両方は、バイオマーカー発見ツールとして優れた可能性を秘めています。バイオマーカーを選択するか、または化学測定モデルを確立すると、本研究で説明するSPMEアプローチのようなオンサイト調査に適用可能な方法を介して標的代謝産物の決定に基づく医療診断を、ルーチン診断の一部として開発し、実施することができる。
本稿で提案されている議定書は、潜在的なバイオマーカーのスクリーニングのための固相微小抽出を用いて癌組織の非標的性メタボロミックおよびリピドミック分析を行う方法を説明する。代表的な化合物の抽出、腫瘍の分化、および特定の癌すなわち潜在的なバイオマーカーを特徴付ける差別的化合物の同定を可能にするように設計されている。この記事で説明されているSPMEによる非標的分析は、迅速な術中診断の開発の出発点であり、サンプル中に存在するすべての化合物をスクリーニングする必要なしに選択された化合物のパネルを決定することができる。迅速な診断結果のために、現場での抽出に使用されるSPMEプローブは、病院施設にある分析機器に直接結合することができます。最小限のサンプル調製とクロマトグラフィーフリー分析で行う単純な抽出は、薬物モニタリング15に関して既に説明されているように、全体の時間を数時間から数分に大幅に短縮するであろう。

磁気共鳴画像法(MRI)とコンピュータ断層撮影(CT)は、脳病変のリアルタイム分析に使用される主な方法です。脳腫瘍分化は、一般に、追加の染色および高度な免疫組織化学的技術を用いた組織病理学に基づく。2016年に世界保健機関(WHO)が発行した中枢神経脳腫瘍に関する最新のガイダンスによると、遺伝子検査はこれらの腫瘍の分化と分類に不可欠です。腫瘍の分化と分類により、医師は特定のタイプの腫瘍に対して最も効果的な治療法を選択することができ、それによって患者の平均余命が拡大する。残念ながら、医師が患者に最適な治療法を選択するのを助けるこのような高度な方法が利用可能であるにもかかわらず、神経膠芽腫と診断された患者の平均余命(IVグレード神経膠腫)はわずか15〜16ヶ月2である。診断ツールとしての画像および組織学的方法の高度化と精度の向上があっても、治療の経過に関する決定において医師を支援するための補完的な情報を提供できる新しい技術が依然として大きなニーズを持っています。過去数年間、癌3,4の術中分析のために質量分析法に基づくいくつかの新しいアプローチが提案されてきた。固相マイクロ抽出(SPME)の電位は、本明細書で提示される方法は、迅速なオンサイト分析ツールとして、様々な研究5で既に実証されている。現在の原稿は、この方法の臨床応用の1つである、ヒト脳腫瘍の標的化されていないメタボロミクスおよびリピドミクスを示している。対象を絞り込んだ調査は、潜在的なバイオマーカーの発見において重要な出発点となります。確立されると、このようなバイオマーカーは、オンサイトのインストルメンテーションに結合された同じ技術を使用して腫瘍を区別するための診断参照として使用することができます。
SPMEは、少量の抽出段階を使用してサンプルマトリックスから小分子を抽出する平衡ベースのサンプル調製技術です。SPMEの装置(プローブ)の最も伝統的な構成では、繊維は適切な抽出相で被覆され、固体支持体すなわち、金属線5、6に固定化される。生体適合性のコーティングおよびデバイス(プローブ)は、サンプル前処理、均質化およびろ過を行うことなく、複雑な生物学的マトリックスから直接抽出を可能にします。抽出プロセスを通じて、分析物は抽出フェーズとサンプルマトリックスの間で、初期濃度に比例して分割されます。抽出が十分に長く行われれば、平衡が達成される。平衡時の抽出は可能な限り最高の感度と再現性を提供するが、平衡前抽出も可能であり、場合によっては好ましい場合、オンサイトサンプリング(例えば、手術室または救急外来)に関連する時間制限が必要なインビボサンプリングでも好ましい。所与の分析物の抽出時間プロファイルは、一般に、検体の物理化学的性質、サンプリングされるマトリックス、使用される吸着剤の種類、および他のいくつかの抽出条件の影響を受ける。その抽出キネティクスを支配する多くの因子は、メタボロミクスやリピドミクスなどの非標的分析が行われると、すべての化合物の平衡抽出を確実にすることが事実上不可能になります。上記の理由から、現在のプロトコルの抽出時間は、一方で代謝物の満足のいく感度とカバレッジを確保するために任意に設定され、他方で現場で使用するための実用性を確保した。
組織からのサンプルの抽出に使用されるプローブの非常に小さいサイズは、サンプリング手順自体が組織を消費するのではなく、サンプリングされた領域から非常に少量の小分子を消費する一方で、最小限の組織損傷を引き起こすことを強調する必要があります。したがって、同じサンプルは、定期的な検査、すなわち、組織学的または遺伝的に、同じサンプルからの本質的かつ補完的な情報の達成を可能にするのにさらに使用することができる。このような補完的で包括的なデータは、腫瘍生物学のより良い理解を可能にし、うまくいけば新しい治療目標の発見を促進するであろう。この方法を利用すると、標的バイオマーカーを決定する際に、オンサイトの術中診断の可能性がさらに高まります。
以下では、メタボロミクスおよびリピドミクス分析およびデータ処理のための脳腫瘍を現場でサンプリングするためのプロトコルを提示する。

<table><tbody><tr><td>酢酸</td><td>Honeywell</td><td>49199</td><td>移動相添加剤、LCMS グレードの</td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>Honeywell</td><td>34967</td><td>HPLC 溶媒、LCMS グレードの</td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム</td><td>Honeywell</td><td>14267</td><td>移動相添加剤、LCMS グレード</td></tr><tr><td>BenchMixer MultiTube Vortexer</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BV1010*</td><td>Vortex ミキサー</td></tr><tr><td>キャップ</td><td>Agilent</td><td>5183-2076</td><td>Blue scrw tp,pre-slit PTFE/Si septa</td></tr><tr><td>Compound Discoverer 2.1</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>software for data processing</td></tr><tr><td>Discovery HS F5 Supelguar Cartridge 2 cm &times; 2.1 mm, 3 &mu;m</td><td>Supelco</td><td>567571-U</td><td>ガードコラム</td></tr><tr><td>ディスカバリー HS F5、2.1 mm x 100 mm、3 &mu;m</td><td>メルク</td><td>567502-U</td><td>HPLC カラム</td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>Honeywell</td><td>56302</td><td>移動相添加剤、LCMS グレードの</td></tr><tr><td>ガラスバイアル挿入物 250ul、不活性化</td><td>Agilent</td><td>5181-8872</td><td></td></tr><tr><td>ガラスバイアル挿入物 350ul</td><td>Agilent</td><td>5188-5321</td><td></td></tr><tr><td>ガラスバイアル 1.5ml</td><td>Agilent</td><td>5183-2030</td><td></td></tr><tr><td>ガラスバイアル、2 mL (琥珀色、不活性化)</td><td>Agilent</td><td>5183-2072</td><td></td></tr>ガラス<tr><td>バイアル、2mL</td><td>Agilent</td><td>5182-0715</td><td></td></tr><tr><td>HILIC Luna 3 &mu;m、200A、100 x 2.0 mm</td><td>Shim-Pol</td><td>PHX-00D-4449-B0</td><td>HPLC カラム</td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>Honeywell</td><td>34965</td><td>HPLC 溶媒、LCMS グレード</td></tr><tr><td>LipidSearch 4.1</td><td>データ処理用</td><td>Thermo Scientific</td><td></td> ソフトウェア</tr><tr><td>Metaboanalyst</td><td>Xia Lab @ McGill</td><td></td><td>統計解析のためのオンラインソフトウェア (Chong, J., Wishart, D.S. and Xia, J. (2019) Using MetaboAnalyst 4.0 for Comprehensive and Integrative Metabolomics Data Analysis.Current Protocols in Bioinformatics 68, e86 )</td></tr><tr><td>methanol</td><td>Honeywell</td><td>34966</td><td>HPLC 溶媒、LCMS グレード</td></tr><tr><td>Pierce LTQ Velos ESI ポジティブイオンキャリブレーションソリューション</td><td>Thermo Scientific</td><td>88323</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ネガティブイオンキャリブレーションソリューション</td><td>Thermo Scientific</td><td>88324</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Focus ハイブリッド四重極-Orbitrap MS</td><td>Thermo Scientific</td><td>726049</td><td>質量分析計</td></tr><tr><td>SecurityGuard カートリッジ HILIC 用 4 mm &times; 2.0 mm</td><td>Phenomenex</td><td>KJ0-4282</td><td>Guard</td></tr><tr><td>Column SeQuant ZIC-cHILIC 3&micro;メートル、100&Aring;100 x 2.1 mm</td><td>Merck</td><td>1506570001</td><td>HPLC カラム</td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-HILIC ガードキット 20 x 2.1 mm</td><td>Supelco</td><td>1504360001</td><td>ガードカラム</td></tr><tr><td>SPME LC ファイバープローブ、C18</td><td>Supelco</td><td>カスタムオーダー</td><td>商用プローブ: 57281-U; 実験で使用したプローブはニードルアセンブルされておらず</td></tr><tr><td>、プロトコル SPME LC ファイバープローブ、混合モード</td><td>Supelco</td><td>カスタムオーダー</td>に記載されている長さに事前にカットされています<td></td></tr><tr><td>UltiMate 3000 HPLCシステム</td><td>Thermo Scientific</td><td>5200.0345</td><td>HPLCシステム</td></tr><tr><td>水</td><td>Merck</td><td>1153331000</td><td>HPLC溶媒、LCMSグレード</td></tr><tr><td>XSelect CSH C18 3.5&mu;m 2.1x75mm</td><td>Waters</td><td>186005644</td><td>HPLC カラム</td></tr><tr><td>XSelect CSH C18 VanGuard カートリッジ、3.5 &micro;m、3.9x5 mm</td><td>ウォーターズ</td><td>186007813</td><td>カラムカートリッジ</td></tr></tbody></table>

メタボロミクス解析とリピドミクス解析のための脳腫瘍の現場でのサンプリングと抽出

On-Site Sampling and Extraction of Brain Tumors for Metabolomics and Lipidomics Analysis

がんの診断と分類に利用できるさまざまなツールにもかかわらず、腫瘍の迅速かつ簡単な特性評価を可能にする方法はまだ必要です。近年、質量分析は、疾患の潜在的バイオマーカーとして差別性化合物の非標的プロファイリングに選択される方法となっている。生体流体は一般的に、そのアクセシビリティと簡単なサンプル処理を与えられた好ましいマトリックスと考えられ、直接組織プロファイリングは特定の癌に関するより選択的な情報を提供する。従来の方法による分析のための組織の調製は、はるかに複雑で時間がかかるため、迅速なオンサイト分析には適していません。現在の研究は、腫瘍切除直後に、現場での小分子のサンプル調製と抽出を組み合わせたプロトコルを提示する。鍼針の大きさのサンプリング装置は、組織に直接挿入し、器械分析のために近くの実験室に運ぶことができます。メタボロミクスおよびリピドミクス分析の結果は、腫瘍の組織学的起源、悪性腫瘍、遺伝子変異に関連する腫瘍の表現型の確立、ならびに識別化合物または潜在的なバイオマーカーの選択に対するアプローチの能力を示す。この技術の非破壊的な性質により、SPME分析に使用される同じサンプル上で、例えば組織学的検査など、日常的に使用されるテストのその後のパフォーマンスが可能となり、パーソナライズされた診断をサポートするために、より包括的な情報を得ることができます。

固相マイクロ抽出を、液体クロマトグラフィーと組み合わせて高分解能質量分析法と高度なデータ処理ソフトウェアを組み合わせて利用することで、ヒト脳腫瘍のメタボロームとリピドームの特徴付けに成功しました。プローブは、鍼治療針と同等の大きさであり、研究された組織に最小の損傷を引き起こし、組織消費を引き起こさなかったため、組織学的または遺伝学的研究のためのサンプルのさらなる使用を可能にした。選択したグループの満足な分離は、逆相とHILICカラムの両方、およびメタボロミクスおよびリピドミクス分析におけるイオン化モードの両方について得られた。両方の分離方法をメタボロミクスのみならず、リピドミクス分析においても使用することで、有益な相補的データが提供された。逆相列は、炭素鎖の長さと不飽和結合の存在に関して脂質を分離し、一方、HILICカラムは脂質基、特にリン脂質8のプロファイリングに有用である。
器械分析の再現性は、主成分分析プロット上のQCサンプルの緊密なクラスタリングに基づいて非常に良好であることが判明した(図3A、3つのQCサンプルは、配列の重複に沿って8人の患者のサンプルを注入した)。さらに、陰性制御解析に使用される抽出ブランクは、実際のサンプルからうまく分離することが判明した。プローブによって抽出された広範囲の検体は代表的な種の発見を促進し、組織学的起源、悪性腫瘍、および他の要因(例えば、遺伝的)に基づいてヒト脳腫瘍間の分化を可能にすることに成功した。 図3B は、神経膠腫および髄膜腫患者から採取されたサンプルに関するリピドミクスデータを示す。組織学的起源と悪性腫瘍の異性化を特徴とするこれらの腫瘍の分化を可能にすることは、髄腫が一般的に良性腫瘍と考えられているのに対し、グリオーマは最も悪性の1つであるため、研究の重要な目標であった。さらに、 図4 ではメタボロミクスデータを提示し、グリオーマは悪性度を基にして高低に分けた。これらのサブグループを、髄膜腫の分子表現型と比較した。どちらの場合も、クラスターの顕著な分離が観察された。今日では、グリオーマの診断は主に腫瘍サンプル中の特定の遺伝子変異を決定することに依存しています。そこで、得られた結果を遺伝子型データと比較した。 図5Aは 、検出された共欠失1p19qと変異が認められなかったサンプルとの分離を示す。
統計解析では、研究したグループ内の化合物の選択も可能です。これらの化合物は、適切に大きなコホートがサンプリングされる場合に潜在的なバイオマーカーとして考えられる。しかし、検出された化合物の断片化による決定的な確認や、検出された種と分析基準の比較など、より詳細な分析が必要であり、生物学的性質の決定的な結論を導き出す必要がある。このような判別代謝産物の例は 、図3C および 図5Bに示されている。これらの化合物の同一性、すなわち、スフィンゴミリン:SM d36:1およびプロリンは、サンプルと本物の標準からの代謝産物の断片化パターンを比較することによって確認した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61260/61260fig01.jpg"> 図1:抽出処理のために用意されたSPME繊維。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61260/61260fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61260/61260fig02.jpg"> 図2:SPMEプローブを用いた髄腫の抽出<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61260/61260fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61260/61260fig03.jpg"> 図3:神経膠腫と髄腫のPCAと箱ひげ図(A)を含む主成分分析プロットは、ブランク、抽出QC、ブランク、髄月性腫、神経膠腫を含むすべての分析サンプルを含む;(B) 研究グループのみを含む (ブランクと QC を除外した後)。(スフィンゴミリンのボックスウィスカプロット: SM d36:1 神経膠腫と髄液腫で患者を区別する.リピドミクスデータ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61260/61260fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61260/61260fig04.jpg"> 図4:HGG、LGGおよび髄腫のPCA。(A)高等度神経膠腫(HGG)と髄月腫(MEN)9および(B)低グレード神経膠腫(LGG)および髄月性腫の分化を示す主成分分析プロット。許可を得てメディカref9経由から転載されたメタボロミクスデータ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61260/61260fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61260/61260fig05.jpg"> 図5:削除の有無にかかわらず、グリオーマのPCAおよび箱ひげ図。(A)主成分分析プロットは、共欠失1p19qの有無にかかわらず患者の違いを示した。(B)共欠失1p19qの有無にかかわらず、プロリン分化患者のための箱ひげプロット。n-削除なし、y-削除付き。メタボロミクスデータ<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61260/61260fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

この原稿は、ヒト脳腫瘍の現場サンプリングを固相微小抽出と共に、バイオマーカーの発見に向けた生化学的プロファイリングを行った。

Despite the variety of tools available for cancer diagnosis and classification, methods that enable fast and simple characterization of tumors are still ...

このプロトコルは、固相マイクロ抽出繊維を使用してサーバー内または横にある脳腫瘍からの抽出を行うために使用することができる。この技術は、切除された腫瘍から直接小分子を抽出することを可能にし、分析機器に直接抽出装置を結合することによって、迅速な術中診断の機会を提供する。固相微小抽出装置を調製するために、各固相微小抽出装置プローブの符号化を混合モードまたはC18コーティングで、腫瘍の大きさに応じて適当な長さにトリミングする。そして、プローブと50 50メタノール水溶液をサンプル採取前に少なくとも1時間浸漬する。このプロトコルは脳腫瘍に焦点を当てていますが、戦略は多くの異なる癌の診断のために実装することができます。この技術は完全にポータブルであるため、追加のデバイスは必要ありません。腫瘍除去後できるだけ早く、LCMSグレードの水でプローブ繊維を5秒間浸漬してから、脳腫瘍組織サンプルにできるだけ遠く繊維を挿入し、抽出段階全体が腫瘍の内側に位置することを確認する。検体腫瘍以外のソースからのアーティファクトの存在によるエラー源を排除するために、正確に30分間組織内にプローブを残し、同じ期間テーブルに条件プローブ繊維を置く。抽出の間、抽出後のプローブ貯蔵に使用されるラベルHPLCバイアル。抽出の最後に、繊維をLCMSグレードの水に3秒間浸漬して血液または細胞の破片を除去し、各プローブを単一のHPLCバイアルキャップのセプタの底部に挿入して繊維を固定化します。その後、固定化された繊維でバイアルをキャップし、適切な輸送コンテナにバイアルを配置します。実験室到着時に、すぐにそれぞれ3〜5年以下のマイナス30またはマイナス80度の冷凍庫にバイアルを置いた。1回の実験からすべてのサンプルを採取したら、混合モード繊維を含むバイアルを室温に置きます。そして、脱着のための2ミリリットルバイアルにラベルを付け、各バイアルにガラスインサートを入れ、各インサートに作りたての80 20アセトニトリル水溶液の300マイクロリットルを追加します。各プローブのコードを脱離溶媒の個々のバイアルに完全に浸漬し、渦の1,200回転で1分あたり120分間バイアルを攪拌する。脱着が完了したら、バイアルからキャップを取り出し、腫瘍からの抽出物を含む各ファイルから10マイクロリットルのアリコートを取り除き、品質管理サンプルを調製します。次に、バイアルを新しいキャップで閉じ、バイアルを液体クロマトグラフィーの高分解能質量分析計の4°Cオートサンプラーに入れます。リピドミック分析用のサンプルを調製するには、C 18繊維を含むバイアルを室温に置き、2ミリリットルのHPLCバイアルにラセレートしたガラス挿入物をバイアルに挿入し、各挿入に200マイクロリットルの新鮮な準備をした50 50イソプロパノールメタノール溶液を加えます。各プローブコーティングを溶媒に完全に浸し、渦で毎分1,200回転で50分間攪拌します。時間の終わりに、キャップを取り除くことによって脱着を停止し、腫瘍からの抽出物を含む各ファイルから10マイクロリットルのアリコートを取っておき、品質管理サンプルを準備し、バイアルを新しいキャップで閉じます。次に、バイアルを液体クロマトグラフィーの4°Cオートサンプラーに入れ、高分解能質量分析計を行います。主成分分析プロット上の品質管理サンプルの緊密なクラスタリングに基づいて、器械分析の再現性が非常に良好であると判断された。神経膠腫および髄膜腫患者から採取されたサンプルに関するこれらのリピドミクスデータは、腫瘍サンプルが組織学的起源および悪性腫瘍に応じて区別される能力を強調する。これらのメタボロミクスデータで示されるように、グリオーマは、悪性度の程度に基づいてさらに分割することができ、または、対象の突然変異の有無に応じて。統計分析では、研究対象グループ内の特定の化合物の選択も可能です。抽出時間を注意深く制御し、すべてのサンプルの再現可能な条件を維持することが不可欠です。あるいは、サンプルをクロマトグラフィー分離なしで直接Msに溶解させることができ、特定のマーカーの標的分析を可能にし、手順全体を数分に短縮することができます。

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医学

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