Name: 切除されたマウス脛骨神経におけるニューロフィラメント輸送のイメージングと解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 学ぶ蛍光顕微鏡法によるマウス有髄軸索におけるニューロフィラメント輸送の可視化と速度・方向性の測定手法。この方法は神経細胞の構造維持メカニズム解明に貢献します。

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著者らはポーラ・モンスマに対する共焦点顕微鏡と脛骨神経解剖の指導と支援、内田敦子博士、クロエ・デュガー博士、サナ・チャハンデ博士にマウスの畜産の支援を感謝したいと考えています。この研究の一部は、国立科学財団がIOS1656784をA.Bに助成金を提供することによって支援されました。 IOS1656765からP.J.、国立衛生補助金R01 NS038526、P30 NS104177、S10 OD010383からA.B.N.P.B.へのIOS1656765は、オハイオ州立大学学長の博士研究員プログラムのフェローシップによって支えられました。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

後処理時に、主にフラットフィールド補正、画像アライメント、漂白剤補正の間に誤差が導入される可能性が大きいため、パルスエスケープおよびパルス拡散実験の分析には注意が必要です。フラットフィールド補正は、照明の不均一性を補正するために必要であり、その結果、中心から周辺までの視野全体の強度が低下します。不均一性の程度は波長依存であり、したがって、常に実験データの取得に使用される波長で行われるべきである。フラットフィールド画像の不均一性が、補正する画像の不均一性を真に表すことを確認することが重要です。パルス拡散実験は、強度の減衰が最も大きい画像の周囲に向かって測定ROIが広がるため、不適切なフラットフィールド補正によるエラーに対して特に脆弱です。
最適な paGFP 活性化設定は、活性化方法とレーザー パラメーターによって異なり、最初のイメージング セッションの前に経験的に決定する必要があります。あまり活性化しない場合、活性化蛍光のシグナル対ノイズ比が低くなりますが、あまり多すぎると、非活性化および活性化paGFPの両方がバイオレット光によって励起されるため、活性化蛍光の漂白が生じてしまいま...

ニューロフィラメントの軸索輸送は、1970年代にラジオアイソトピックパルス標識1によって初めて実証された。このアプローチは 、インビボでのニューロフィラメント輸送に関する豊富な情報を生み出したが、空間的および時間的解像度が比較的低く、通常はミリメートルと最高の日の順序で2.また、ラジオアイソトピックパルス標識は、単一の時間経過を生成するために複数の動物の注入と犠牲を必要とする間接的なアプローチです。1990年代に蛍光タンパク質の発見と蛍光顕微鏡の進歩により、その後、培養ニューロン内のニューロフィラメント輸送を数秒または数分の時間スケールで直接画像化し、マイクロメートル以下の空間分解能を用いて、動きのメカニズムに関するより大きな洞察を得るようになりました3。これらの研究は、軸索中のニューロフィラメントポリマーが微小管運動タンパク質によって推進される微小管トラックに沿って前向きおよび逆行方向の両方で迅速かつ断続的に移動することを明らかにした。しかし、ニューロフィラメントは直径わずか10nmの回折限定構造であり、通常は数十ナノメートルの間だけ隣人と離れている。したがって、ポリマーは、移動ポリマーが隣人から解決できるように、まばらに分布した神経フィラメントを含む培養ニューロン内でのみ追跡することができる4。したがって、現在では、ミエリン軸索のような豊富なニューロフィラメントポリマーを含む軸索中の単一の神経フィラメントを追跡することは不可能である。
蛍光顕微鏡を用いた神経フィラメント豊富軸索におけるニューロフィラメントの軸索輸送を解析するために、培養神経細胞,4,5における神経フィラメントの長期休止挙動を研究するために開発した蛍光光活性化パルスエスケープ法を用いた。4光活性化可能な蛍光ニューロフィラメント融合タンパク質でタグ付けされたニューロフィラメントは、軸索の短いセグメントで活性化され、その後、活性化領域からのそれらのフィラメントの出発速度は、時間の経過に伴う蛍光の減衰を測定することによって定量化されます。このアプローチの利点は、個々のニューロフィラメントポリマーの動きを追跡することなく、数分または数時間の時間スケールで適用することができるニューロフィラメント輸送の集団レベルの分析であるということです。例えば、この方法を用いて、ミエリン化培養6におけるニューロフィラメント輸送の運動を分析した。
最近、ヒトニューロン特異的Thy1プロモーター7の制御下にあるニューロンにおいて、paGFPタグ付きニューロフィラメントタンパク質M(paGFP-NFM)の低レベルを発現するhThy1-paGFP-NFMトランスジェニックマウスの開発について説明した。このマウスは蛍光顕微鏡を用いたその場所でのニューロフィラメント輸送の分析を可能にする。本稿では、2つのアプローチを用いて、これらのマウスから脛骨神経のミエリン軸索におけるニューロフィラメント輸送を分析するための実験的アプローチについて述べた。これらのアプローチの最初は、上記のパルスエスケープ方式です。この方法は、ニューロフィラメントの一時停止挙動に関する情報を生成することができるが、フィラメントが活性化領域を出発する方向に盲目であり、したがって正味方向および輸送速度8の測定を可能にしない。第2のアプローチは、活性化領域からの蛍光の損失だけでなく、蛍光フィラメントが前向きおよび逆行方向の両方で活性化領域を出発する際に蛍光が移動する2つの側面窓における蛍光の一過性増加を分析する新しいパルス拡散法である。どちらのアプローチでも、測定窓における蛍光変化の数学的分析とモデリングを用いて、平均速度、正味方向性および一時停止行動などのニューロフィラメント輸送のパラメータを得ることができる。 図 3 は、これら 2 つのアプローチを示しています。
このプロトコルは、神経の解剖および調製、paGFP蛍光の活性化および画像化、およびImageJ9のFIJI配布パッケージを用いて取得した画像からのニューロフィラメント輸送の定量を示す。それは長い(数cm)であり、分岐しないので、私たちは脛骨神経を使用します。しかし、原理的にpaGFP-NFMを発現する神経は、軸索を損傷することなく解剖し脱整えることができる場合、この技術で使用するのに適している。

<table><tbody><tr><td>14 x 22長方形ガスケット0.1mm</td><td>Bioptechs</td><td>1907-1422-100</td><td>内部ガスケット</td></tr>2<tr><td>-デオキシ-D-グルコース</td><td>シグマ</td><td>D6134</td><td></td></tr><tr><td>30mm丸型ガスケット穴付き</td><td>Bioptechs</td><td>1907-08-750</td><td>外側ガスケット</td></tr><tr><td>35 x 10mm皿</td>サー<td>モフィッシャー</td><td>153066</td><td>解剖皿</td></tr><tr><td>40mm丸型カバースリップ</td><td>Bioptechs</td><td>40-1313-0319</td><td></td></tr><tr><td>60mLシリンジ - ルアーロックチップ</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Andor Revolution WD スピニングディスク共焦点システム</td><td>Andor</td><td></td><td>パーフェクトフォーカスとFRAPPAシステムを装備</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>Fisher</td><td>12-541-B</td><td>フルオレセインスライド</td></tr><tr><td>用 D-(+)-グルコース溶液</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>解剖ピン</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>26001-70</td><td></td></tr>解<tr><td>剖鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-30</td><td>細かい先端鉗子</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td>ツァ<td>イス</td><td>47 50 03</td><td></td></tr><tr><td>ワックスギ</td><td>ンズバーグ科学</td><td>568859</td><td></td></tr><tr><td>解剖はさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14061-09</td>初期解剖パン<td>解剖はさみ</td></tr><tr><td>FCS2 灌流チャンバー</td><td>Bioptechs</td><td>060319-2-03</td><td></td></tr><tr><td>フルオレセインナトリウム</td><td>Fluka</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>インライン溶液ヒーター</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>SH27-B</td><td></td></tr><tr><td>椎弓切除鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11223-20</td><td>初期解剖鉗子</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Microaqueductスライド</td><td>Bioptechs</td><td>130119-5</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライドフィ</td><td></td><td>ッシャー12-544-3</td><td>フルオレセインスライド</td></tr><tr><td>顕微鏡ステージインサート</td><td>応用科学機器</td><td>I-3017</td><td></td></tr><tr><td>対物ヒーターシステム</td><td>Okolab</td><td></td><td>Oko 対物カラー付きタッチ</td></tr><tr><td>対物オイル-タイプA</td><td>ニコン</td><td></td><td></td>生産終了</tr><tr><td>Plan Apo VC 100x 1.40 NA 対物</td><td>レンズ Nikon</td><td>MRD01901</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Fisher</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウムヨードアセテート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2512</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>Sage Instruments</td><td>モデル355</td><td></td></tr><tr><td>チューブアダプター - 女性</td><td>Small Parts Inc.</td><td></td><td></td>1005109</tr><tr><td>チューブアダプター - オス</td><td>Small Parts Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1005012タイゴンチューブ</td><td>Bioptechs</td><td></td><td>1/16 "ID、1/32 "壁の厚さ</td></tr><tr><td>ヴァンナススプリングはさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15018-10</td><td>細かいはさみ</td></tr></tbody></table>

切除されたマウス脛骨神経におけるニューロフィラメント輸送のイメージングと解析

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

ニューロフィラメントタンパク質ポリマーは、軸索輸送の遅い成分の軸索に沿って、平均速度が0.35~3.5mm/日で移動します。最近まで、この動きの研究は、放射性同位体パルス標識を使用してのみ可能でした, これは、日の時間分解能とミリメートルの空間分解能と神経全体の軸索輸送の分析を可能にします.より高い時間的および空間的分解能を有するインサイチュにおけるニューロフィラメント輸送を研究するために、ニューロンにおける光活性化可能なGFPでタグ付けされたニューロフィラメントタンパク質Mを発現するhThy1-paGFP-NFMトランスジェニックマウスを開発した。ここでは、これらのマウス ex vivoから脛骨神経の単一のミリン化軸索における神経フィラメント輸送を解析するための蛍光光活性化パルスエスケープおよびパルス拡散法について説明する。単離された神経セグメントは、酸素化生理食類を灌流することにより顕微鏡ステージ上に維持され、ディスク共焦点蛍光顕微鏡を紡糸することによって画像化される。バイオレットライトは短軸窓で蛍光を活性化するために使用されます。活性化領域と横回し領域の蛍光は時間の経過とともに分析され、分およびミクロンのオーダーで時間的および空間的解像度を伴うニューロフィラメント輸送の研究が可能になる。数学的モデリングは、結果データから速度、方向バイアス、一時停止行動を含むニューロフィラメント輸送の運動パラメータを抽出するために使用できます。パルスエスケープ法およびパルス拡散法は、他の神経におけるニューロフィラメント輸送を可視化するためにも適応することができる。追加のトランスジェニックマウスの開発により、これらの方法は、軸索中の他の細胞骨格および細胞質タンパク質の軸索輸送を画像化し、分析するためにも使用することができる。

図3は、パルスエスケープおよびパルス拡散実験の代表的な画像を示しています。パルスエスケープ法を用いて得られたデータと、それらのデータ5、6、7、8、176,7の5分析方法を用いて得られたいくつかの研究,8を17発表しました。以下に、これまで報告されていないニューロフィラメント輸送の方向性と速度に関する情報をパルス拡散データがどのように得ることができるかを示す。
軸索中のニューロフィラメント輸送は断続的かつ双方向である。この輸送は、順方向および逆行方向の任意の時点で移動するフィラメントの画分と <img alt="Equation 41" src="/files/ftp_upload/61264/612...

光活性化可能なニューロフィラメントタンパク質を発現するトランスジェニックマウス由来の末梢神経の単一ミリン化軸索におけるニューロフィラメントの軸索輸送を解析する蛍光光活性化法について説明する。

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

このプロトコルは、蛍光顕微鏡を用いた若年マウスまたは成体マウス由来のミエリン化軸索中のニューロフィラメント集団の直接画像化を可能にし、単離された神経セグメントにおけるニューロフィラメント輸送の方向性および速度を測定することを可能にする。この方法は、目的のタンパク質の光活性化可能な蛍光融合を発現するマウスの入手可能性に依存するが、任意の容易に解剖された神経での使用に適合させることができる。まず、酸素化した生理食塩水を60ミリリットルのシリンジに注ぎ、注射器に残っている空気が最小限であることを確認します。注射器をチューブに接続し、流出管を廃棄物フラスコに入れます。外側のガスケットを灌流室ハウジングに入れ、フローインレットと出口ポストがガスケットの穴に合っていることを確認し、内側のガスケットを1.5円形のカバースリップに置き、ガスケットのシワを慎重に滑らかにして密封を確保します。ペーパータオルの上にカバースリップとガスケットを置くか、ガスケットを上に向けてタスクワイプします。大きな解剖はさみを使用して、脊椎の真ん中付近の皮膚に背部切開を行い、動物の腹側の側面を切り回し続けます。ゆっくりと筋肉から皮膚を引き離し、筋膜を切断します。次に、マイクロ切除ハサミを使用して、尾と膝の中間の太ももの筋肉を切開して坐骨神経を露出させます。筋肉を通して見える神経が切れていないことを確認してください。切開を背部および腹通筋に伸ばして筋肉を取り除き、ふくらはぎの筋肉を取り除き、切り傷を浅く短くして神経にダメージを与えないようにします。脛骨神経が坐骨神経からかかとに分岐するポイントから完全に露出するまで筋肉を取り除き続けます。脊椎近位端の脛骨神経を鉗子でつかみ、マイクロディセクザーで切り取り、神経にあまり緊張を加えないようにします。慎重に筋肉から離れて持ち上げ、神経に緊張を置かないように注意して、任意の添付ファイルをカットします。脛骨神経の背骨遠端を切り取り、室温酸素化生理食前の小さなペトリ皿に移します。神経の近位端から始めて、露出した軸索の端を非常に細かい先端鉗子でそっとつかむ。鉗子の第二のペアで、近位の神経鞘をつかみ、ゆっくりと神経の遠位端に向かって引っ張り、このプロセス中に過度の緊張が加えられないようにする。神経の近位端をつかみ、ゆっくりとカバースリップの上に置き、穏やかな緊張の下でそれをまっすぐにします。マイクロ水道管スライドを下に溝付きスライドで神経の上に置き、神経に平行な流れの方向を配置します。カバースリップとマイクロ水道アセンブリを裏返し、外側のガスケットに反対するスライドで灌流室ハウジングに置きます。拡散チャンバを固定するには、金属ハウジングに置き、ロックリングを回転させます。生理食いのシリンジプランジャーをゆっくりと落ち込ませ、灌流チャンバーを満たします。インレットと出口チューブ、アウトレットフラスコ、シリンジを常に設定とイメージングの間、チャンバー自体の上に高く保ちます。拡散アセンブリを反転した顕微鏡ステージに移し、シリン注射器をシリンジポンプに取り付け、モーターを始動し、毎分0.25ミリリットルの流量に合わせて速度を調整します。インライン溶液ヒーターを接続し、摂氏37度に設定します。目的のヒーターを接続し、摂氏37度に設定します。目的に油を適用し、ステージマウントに拡散チャンバーを挿入します。チャンバーヒーターパッドにオイルを塗布し、それを灌流室に取り付け、それを接続し、摂氏37度に設定します。ステージアダプターに拡散チャンバーをロックし、チャンバーの下側のカバースリップに接触する目的油を持って来ます。明視野照明を使用して、カバースリップ表面に最も近い神経の底面の軸索の層に焦点を合わせます。ミエリー化軸索は、コントラスト強化なしにブライトフィールド透過光照明の下で可視であるミエリンシースの存在によって識別することができる。ブライトフィールド参照画像を取得し、神経の方向性を記録し、488ナノメートルレーザーと光活性化可能なGFPに適した発光フィルタを使用して共焦点画像を取得します。レーザーパワーを通常の約5倍の撮像電力に設定し、3〜4分の露光時間で画像を取得し、次に別の共焦点像を取得して、漂白工程後の活性化前の自己蛍光を記録します。明視野イメージの目的のアクティベーションウィンドウサイズと等しい長さで軸索に平行な線を描きます。この線をガイドとして使用して、軸索に対して垂直な視野をまたいで目的の矩形領域を描画します。405ナノメートル光でパターン励起することにより、この領域のGFP蛍光を活性化し、活性化の直前および直後に画像が取得されることを確認します。アクティベーションが完了したら、1 分間のタイマーを開始します。それが消えたら、タイムラプスシリーズの取得を開始します。250ミリグラムのフルオレセインパウダーを0.5ミリリットルの二重蒸留水に加え、目に見える粒子がなくなるまで混ぜ、卓上遠心分離機で30秒間溶液を回転させて、未溶解の材料を沈下します。8マイクロリットルのフルオレセイン溶液をスライドに加え、1.5個のカバースリップを適用します。余分な液体をブロットし、カバースリップをマニキュアで密封し、スライドを乾燥させます。スライドカバースリップを反転した顕微鏡ステージの下に置き、カバースリップの表面の蛍光の薄い面に焦点を合わせます。スライドを動かして、気泡や大きなフルオレセイン粒子を含まない視野を見つけ、中央の画像が元のフォーカス平面になるように、0.2マイクロメートル間隔で6マイクロメートルにわたるZスタックを取得します。カメラのシャッターを含むすべてのライトパスシャッターを閉じ、レーザーパワーと露出時間をゼロ秒に設定します。これらの設定で 100 枚の画像のスタックを取得し、この値を平均して暗いフィールド イメージを生成します。パルスエスケープとパルス拡散実験の代表的な画像をここに示します。パルスエスケープ法では、活性化領域の蛍光減衰運動学は、長期的および短期的な一時停止行動に関する情報を得ることができます。活性化領域は、これらの実験の略であることができます。より長い活性化領域は、蛍光ニューロフィラメントのより大きなプールを提供するためにパルス拡散法に使用される。これは、隣接する領域の蛍光増加が直線的に残る時間を長くする。ここでは15マイクロメートルの横たわる窓が使用されています。測定窓からの全蛍光を定量した。減衰は、オントラックニューロフィラメントの出発を表す初期指数崩壊と、オフトラックフィラメントの出発を表す10〜20分の2番目の遅い指数関数的減衰を持つパルスエスケープ法の二価性です。パルス拡散戦略では、移動の速度と方向の計算は、隣接するウィンドウの斜面にのみ依存します。ここで使用するウィンドウ長の場合、線形フェーズは約 5 分間延長されます。ここに、解糖的に阻害された神経からのタイムラプスが示され、活性化領域からの輸送の明らかな減少を示す。実際、遠位斜面と近位斜面は、阻害剤で治療された神経において有意に低い。これら2つの条件間の母集団速度の有意な減少もあります。このプロトコルを試みるとき、動物の犠牲に続いて神経の健康が低下するので、解剖およびチャンバーアセンブリ部分を急ぐことが重要であることを覚えておいてください。神経細胞培養は、個々の神経フィラメントの動きの測定と分析を可能にし、このプロトコルを使用して収集された人口規模のデータを補完する。

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