Name: 頭蓋内注射と磁気共鳴画像による脳転移のモデル化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: 学ぶ頭蓋内注射とMRIを用いた脳転移モデリング法。ステレオタクティックフレームによる正確な腫瘍注入と磁気共鳴画像解析により、腫瘍成長の逐次モニタリングと正確な体積測定が可能となり、脳転移のメカニズム研究に貢献します。

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代表的なデータは、国立がん研究所(K22CA218472からG.M.S.)を通じて資金提供されました。頭蓋内注射は、オハイオ州立大学総合がんセンターターゲット検証共有リソース(ディレクター - Reena Shakya)で行われ、MRIはオハイオ州立大学総合がんセンター小動物イメージング共有リソース(ディレクター - キマーリー・パウエル博士)で完了しています。両方の共有リソースは、OSUCCC、国立がん研究所(P30 CA016058)のOSUCCCがんセンターサポートグラント、オハイオ州立大学の大学や部門とのパートナーシップ、および確立されたチャージバックシステムを通じて資金提供されています。

ここに記載されているすべての方法は、オハイオ州立大学(P.I.ジーナ・サイズモア)の制度的動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。プロトコル #2007A0120)すべてのげっ歯類の生存手術IACUCポリシーは、無菌技術、供給、器具、ならびに切開部位の毛皮除去および無菌調製の使用を含む、従う。
1. 乳がん細胞の頭蓋内注射
注:本明細書に記載の方法は、原発 MMTV-PyMT 腫瘍23に由来するDB7マウス乳腺腫瘍細胞株を利用した。これまでの研究では、ヒト疾患12を模した構造を有するBCBMのモデルとしてDB7細胞の頭蓋内注射を確立している。重要なことに、免疫に優れたFVB/Nマウスは、DB7細胞がこのマウス株から誘導されたとして、このモデルに使用される。これは乳がんモデルであるため、これらの研究には成体雌マウスが用いられている。
<ol><li>セルを準備します。<ol>
<li>無菌フードでは、標準的な技術を用いて細胞培養プレートから吸引媒体を吸引する。</li>
		<li>1x DPBSでセルを洗浄し、メーカーのプロトコルを使用してトリプシン化します。</li>
		<li>適切な量のFBS含有培地を添加してトリプシン反応を停止し、ヘモサイトメーターまたは好ましい方法を用いて細胞の濃度を決定する。</li>
		<li>4°Cで4分間300xgのペレット細胞。 g</li>
		<li>吸気培地、1x DPBSで洗浄し、4°Cで4分間g300xgで再スピンする。</li>
		<li>1x DPBSの細胞を適切な濃度に再懸濁し、注入体積あたり約50,000個の細胞が2μLにします。 注: セル数はラインの攻撃性に依存し、調査員によって決定される必要があります。我々は、通常2 μLを使用していますが、ボリューム<6 μLの使用は、15、16、17、18、19と報告されています。15,16,17,18,19低いボリュームは、精度を維持するために重要です。</li>
		<li>生存率を維持するために注入されるまで、再懸濁された細胞を氷の上に置きます。</li>
	</ol></li>
	<li>手術のためにマウスを準備します。<ol>
<li>毛皮を持つマウスの場合:脱毛クリーム/ローションまたはシェービングのいずれかによって、頭蓋骨から毛皮を取り除きます。手術に近すぎると皮膚の質と縫合強度が妨げられる可能性がありますので、手術前に24〜48時間以内にこれを行います。 注:約25gの体重の雌FVB/Nマウスは、転移性乳癌、主に女性の病気の研究のために使用されました。</li>
		<li>IACUCによって決定され、獣医に通用する鎮痛薬を投与する:ブプレノルフィンSR-LAB(0.05-0.1 mg/kg用量、19900年10月1日)の皮下注射 ブプレノルフィンストック: 0.5 mg/mL 0.0025-0.088 mL) 手術前に少なくとも 24 時間鎮痛を提供する手術の前に, 最初の投与後に 48-72 h を繰り返すことがあります, 必要な場合.また、NSAID(例えば飲料水中のイブプロフェン20%イブプロフェン、例えば1mg/5 mL)を投与し、手術後24〜48時間継続し、手術後2〜7日間続け、手術後の鎮痛を最小72時間提供する。 注:オハイオ州立大学では、ブプレノルフィンSR-LABは、それが制御物質であるため、大学の動物資源獣医スタッフによって投与されています。</li>
	</ol></li>
	<li>手術のための定位ユニットを準備します。<ol>
<li>すべての麻酔機械、デジタルバーニエスケール、およびデジタルインジェクターをオンにします。 注:すべての外科用具は外科手術の前に十分にきれいにし、殺菌するべきである。</li>
		<li>生物学的安全キャビネットに誘導室の付着を備えた麻酔装置を利用する(図1A)。</li>
		<li>麻酔機械からのすべての管が立体的フレーム(図1B、インセット1C)に接続され、チューブのクランプが使用されているすべてのユニットのために開かれていることを確認してください。手術に使用されない定位フレームに入るチューブ上のクランプを閉じます。</li>
		<li>マウスの重量に基づいて推奨される鼻コーン流量(例えば、25グラムの動物の重量:ノーズコーンの流量34 mL /分)に麻酔機械を設定してください。 注: この定位設定に含まれるヘッドホルダーは、成虫マウスにのみお勧めします。定位設定に含まれる製造元の推奨事項に従っていることを確認します。</li>
		<li>注射器にあらかじめ充填された適切な麻酔薬(例えば、イオブルラン)が麻酔機械に取り付けられていることを確認する(図1B)。 注:注射器を過剰にプライミングすると、手術中にマウスにあまりにも多くの麻酔が送られ、麻酔の過剰摂取が生じる可能性があります。</li>
		<li>ステージロックをねじってドリルを準備し、ドリルビットアダプターと1mmドリルビットを各ドリルに挿入し、手動でビットロックを締めてドリルをロックします。</li>
		<li>立体的フレームにドリルを取り付けます (図 1C)。</li>
		<li>ハミルトンシリンジを1x DPBSの5回交互洗浄、70%エタノール、そして再び1x DPBSで洗浄します。動物が注射の準備が整うまで脇に置きます。</li>
		<li>0.4 μL/min のレートと 2 μL の目標で配信するデジタルインジェクタを設定します。この速度と容積は、脳への腫瘍細胞の遅い導入を可能にし、圧力および関連する損傷を減らす。</li>
	</ol></li>
	<li>マウスを定位フレームに配置します。<ol>
<li>前述の誘導室を用いてマウス(例えば、イオブルラン)を麻酔する。</li>
		<li>深い麻酔面で処置全体のマウスを維持する。機械によって投与される%麻酔は、流量、刺激の程度、体温などの多くの要因に依存する。リズミカルな呼吸を評価することによって麻酔の深さのための手順を通して頻繁にマウスを監視します (動物はあえぎではありません);palpebral反射の欠如(綿の先端アプリケーターで刺激されたときまぶたのひらひら)。つま先ピンチの欠如(つまみをつまむという有害な刺激の際の手足の撤退)。 注:マウスの異なる株は、麻酔に対して異なる応答を持つことになります。</li>
		<li>マウスが適切な深部麻酔面に入った後、マウスを立体性ユニットに移す。体温と適切な麻酔面を維持するために、マウスが立体態機械上にある間に加熱パッドを使用してください。 注:低プロファイルを達成するために、反転ピペットチップボックス( 図1Dのマウス上昇ボックス)内に配置された空気活性化ハンドウォーマーを使用します。</li>
		<li>マウスの口を開き、立体化フレーム上の鼻の部分にあるマウスバーのトラフに歯を入れます(図2A)。マウスの鼻/口の上に鼻コーンをスライドさせます(図2B)。<ol>
<li>マウスをマウスバーに向けて頭のレベルに置きます。綿の先端アプリケーターの鈍い端で口をそっと開け、所定の位置にスライドさせます。鼻コーンがマウスの鼻の上に完全に上がっていることを確認するか、麻酔が適切に配信されないことを確認してください。この溝の中に歯が座っていないと、鼻コーンは鼻と係合しない(インセット図2A)。</li>
		</ol>
</li>
		<li>無菌綿棒を使用して、マウスの各目に目の潤滑剤を配置します。眼潤滑剤の塗布は角膜の乾燥を軽減し、角膜損傷および角膜外傷に関連する術後合併症の可能性を低減する。</li>
		<li>左耳の内側カンサスに対して左耳棒を押し上げ、立体フレームのネジを使用して所定の位置にロックして、マウスの頭蓋骨を安定させます。次に、右耳バーを右耳の内側カンサスに対してスライドさせ、立体フレームをしっかりとねじ込みます(図2B)。 メモ:マウスの頭部が、イヤーバーを配置する際に、レベルとストレートであることを確認してください。頭部が曲がったり斜めになったりすると、注射は脳内の誤った場所に置かれる。耳の棒は、適度な手動調査で刺激時に頭蓋骨が固定されるまで締め付ける必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>カルバリアウィンドウを作成します。<ol>
<li>3倍の交互にベタジン溶液と70%エタノールを渡して頭皮を準備し、きれいにします。目に外科部位の近接のために、外科スクラブの上にベタジン溶液を使用する。</li>
		<li>無菌メスを使用して、頭蓋骨の中央中央部の側面に沿って皮膚を通して3mmの切開を行う(矢状縫合線に従う)。切開時の出血は最小限に抑える必要があります。それが発生した場合は、>30秒間無菌綿先端アプリケーターで出血部位で一貫した、しっかりとした圧力を適用します。</li>
		<li>ブレグマに垂直なドリルを識別し、向き合う (図 2C)デジタル バーニア スケールをゼロにリセットすることを確認します。</li>
		<li>ドリル2mmを矢状縫合糸に、1mm前部を冠縫合糸に移す(図2C)。再現性のため、すべての動物に対して、矢状縫合線の左右の位置が一貫していることを確認してください。</li>
		<li>ドリルを最高速度に変えます。回転ビットによって引き起こされる組織の損傷を避けるために皮膚をドリルから離れ、慎重に頭蓋骨にドリルを開始することを確認します。約0.5mmの深さにある穴をカルバリアにドリルし、その結果、カルバリア窓が開きます。ドリルを下げ過ぎないように注意するか、脳にドリルします。ドリルが動いている間にドリルサイトで滅菌生理食い物を落とすことは、周囲の組織に熱損傷を引き起こす可能性のある機械によって発生する任意の熱を相殺することができます。</li>
		<li>カルバリアウィンドウが作成されたら、ドリルを慎重に上げて、立体フレームから取り外します。</li>
		<li>70%エタノールを使用してドリルビットを洗浄し、再び使用されている場合は脇に置きます。それでない場合は、ドリルビットを取り除き、70%エタノールに沈みます。</li>
	</ol></li>
	<li>がん細胞を脳に注入する<ol>
<li>自動インジェクタユニットを定位装置に取り付けます(図1D)。</li>
		<li>1x DPBS で 2 μL の細胞を完全に取り込み、きれいなハミルトン注射器で再懸濁します。シリンジを充填する直前に細胞を再懸濁して、凝集形成を減らし、均質な細胞スラリーを確保してください。6-8μLのセルボリュームを引き上げて、エアポケット/気泡がないことを確認するのが理想的です。</li>
		<li>ハミルトン注射器をインジェクター装置の上に置き、注射器が正常に動作していることを確認するために、使い捨て滅菌ドレープに少量のボリュームを分配することによって注射用の針をプライミングします。70% エタノールでシリンジを綿の先端アプリケーターで拭きます (図 1D, インセット)。これにより、注射管に沿って腫瘍細胞が播種されるリスクを低減する針シャフトの外側バレルから腫瘍細胞を除去する。</li>
		<li>針先をカルバリア窓の中央に合わせ、露出した大脳に触れそうになります。</li>
		<li>デジタル バーニア スケールをゼロにリセットします。</li>
		<li>ゆっくりと脳に3ミリメートルの深さに針を挿入し、針が進む前に少なくとも60秒間脳に残るようにします。この時間枠は、脳のパレンチマが針の周りに準拠することを可能にし、針道に沿って背中圧および腫瘍細胞の潜在的な追放を減少させる。</li>
		<li>インジェクタ画面で [実行 ] を選択して、インジェクション サイトへのセルの配信を開始します。このボリュームを注入するのに約5分かかります。このステップの長期化は、脳のパレンチマへの注入力によって引き起こされる二次的損傷を減少させることである。</li>
		<li>注射プロトコルが終了したら、針を少なくとも3分間脳内で休ませ、再び脳の華やごが注射に順応することを可能にする。</li>
		<li>3分以上後、0.75mm/分の速度で脳から針を上げます。非常に遅く、一貫した方法でこれを行い、針道を追跡する背圧と腫瘍を減らします。</li>
		<li>針が脳から出たら、慎重にハミルトン注射器を注射器から取り出し、ステップ1.2.8で説明したようにきれいにします。</li>
		<li>無菌綿棒を使用してカルバリア窓に暖かい骨ワックスを適用します。骨ワックスは、頭蓋骨内の腫瘍を維持するための物理的な障壁として機能します。</li>
		<li>切開を閉じます(例えば、5-0 PDSの解脱可能な縫合糸は、単純な中断パターンまたは縫合クリップで、外科医にとって最も快適な方です)。</li>
		<li>麻酔の投与を中止し、耳の棒のロックを解除してスライドさせ、マウスから鼻コーンを滑り落ち、マウスバーから歯を外して、装置からマウスを取り除きます。</li>
		<li>回復のために37°Cに設定されたウォーマーの上にあるきれいなケージにマウスを置きます。回復中にマウスを監視し、麻酔が中止されてから10〜15分後に典型的に起こる。</li>
		<li>マウスが回復したら、ホスト機関のIACUCによって決定された早期除去基準を監視します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 磁気共鳴画像
<ol><li>ガドリニウムベースの造影剤(0.1 M MultiHanceの100μL/20g体重マウス)を、標準的な腹腔内注射24 10〜20分前にマウスに投与する。次いで吸入麻酔薬(例えば、イソフルラン)を95%O2と5%CO2(すなわち、室の空気ガス)と混合した2誘導室を用いて2麻酔を行う。</li>
	<li>体温を維持するために、加熱ホルダーにマウスを置きます。耳の突起と一口の棒で頭部を固定し、マウスの脳表面コイルを装備した9.4 T磁石の中にホルダーを置きます。イメージング時間中に麻酔を維持し、研究は通常、マウスあたり約20分かかります。空気枕と小動物モニタリングシステムを使用して、手順全体で呼吸数と心拍数(約70 bpm)を監視します。</li>
	<li>ローカライザ画像を取得し、T2重み付けされたRAREシーケンス(TR = 3500-4228 ms、マウス脳を画像化します。 TE=12 ms、レアファクター= 8、FOV=2.0 x 2.0 cm、マトリックスサイズ= 256 x 256、1 mmまたは0.5mmスライス厚さ、NA=2-4、15-30連続スライス)とポストガドリニウムベースのコントラストT1加重希配列(TR = 1200 ms、TE=7.5、希因子=4、FOV=2.0 x 2.0 cm、マトリックスサイズ= 256 x 256、1 mmまたは0.5mmスライス厚さ、NA=2-4、15-30連続スライス)。</li>
	<li>ポストイメージングは、回復のために37°Cに設定されたウォーマーのケージにマウスを置きます。</li>
</ol>3. 容積腫瘍測定
<ol><li>総腫瘍容積の取得<ol>
<li>MrI DICOMデータファイルをImageJで開き、国立衛生研究所(https://imagej.nih.gov/ij/)25を通じて無料でダウンロードできる画像処理ソフトウェアです。 注:ImageJは、腫瘍の体積計算に埋め込まれたピクセル寸法を利用するために必要なDICOMファイルの表示を可能にします(「 画像」「長さの単位」を必要に応じて設定できる プロパティ (例えば、mm)を参照)。</li>
		<li>フリーハンド選択ツールを使用して、腫瘍の周囲に輪郭を描きます。暗い部屋でこれらの選択を実行して、可視性を高めます。セッション間の一貫性を保つために明るさ/コントラストを調整しないでください。</li>
		<li>[分析]タブで、[メジャー]を選択して、選択した領域の領域を取得します。ミリメートルの単位がステップ3.1.1.1で選択された場合、面積は立方ミリメートルで与えられます。必要に応じて、Ctrl + Dを選択してフリーハンド選択を埋め込みます。[編集]に進み、出力色を変更する |オプション|色.画像を RGB 画像に変換する (画像|タイプ|RGB カラー).tifファイルとして保存する前に</li>
		<li>個々のマウスの腫瘍含有スライスをすべて測定し、適切なデータ分析ソフトウェアプログラム(例えば、Microsoft ExcelまたはGraphPad Prism)に値をコピーします。</li>
		<li>各スライスの領域を合計して、腫瘍の総体積を取得します。スライスの厚さ(面積/厚さ)に基づいて領域を修正してください。</li>
		<li>ステップ 3.1.1.-3.1.5 を実行します。すべてのマウスが総腫瘍体積を有するまで。腫瘍のアウトラインのやや主観的な性質を考えると、同じ方法論を複数回繰り返し、技術的な誤りを減らすために平均化することが理想的です。</li>
		<li>スケール バーを設定するには、DICOM データ ファイルを開き、 分析 | ツール | スケールバー.寸法は既に DICOM ファイルに埋め込まれているため、目的の長さ/幅を選択します。RGB 画像への隠し込み (画像 | タイプ | RGB カラー).tifファイルとして保存する前に</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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著者は開示を持っていません。

MRIによる連続モニタリングによる頭蓋内注射の利用は、時間の経過に伴う腫瘍の体積精度で腫瘍の成長を可視化するユニークな能力を提供する。デジタル画像分析の適用は腫瘍の容積、出血、壊死および処置への応答のための脳の病変の解釈を可能にする。
他の手順と同様に、成功するために実行する必要がある重要な手順があります。まず、この技術の成功には、立体性デバイスの慎重なセットアップが不可欠です。マウスクラニウムのサイズが小さいため、わずかな違和感が腫瘍の増殖速度に劇的に異なる影響を及ぼし、実験動物を摂取する可能性があります。そのため、これらの機器の使用に関する適切なトレーニングが必要です。第二に、手順全体の加熱源は、麻酔面があまりにも低く落ちないようにします。低体温は、薬物代謝の低下と麻酔の不注意な過剰摂取のために麻酔下で突然死ぬ危険性があり、回復時間を延長する可能性があります。プレハブの加熱パッドは、立体戦術マシン上で操縦することはかさばり、困難ですが、商業ベンダーを通じて購入した小型の空気活性化ハンドウォーマーは温度を維持し、マウスを立体性設定のために適切なレベルに引き上げるために使用される反...

脳転移は成人原発性中枢神経系腫瘍1に比べて10倍多く、肺癌、乳癌、および最も高い発生率を示す黒色腫を有するほぼすべての固形腫瘍型において報告されている。原発性腫瘍部位に関係なく、脳転移の発達は、認知機能の低下、持続的な頭痛、発作、行動および/または人格変化11、3、4、53,4,に関連する予後不良を招く。乳癌の面では、疾患の予防および治療において多くの進歩があった。しかし、乳がんと診断された女性の30%が転移を発症し、ステージIV疾患の患者のうち、約7%(SEER 2010-2013)が脳転移66,77を有する。脳転移の現在の治療オプションには、外科的切除、定位放射線手術および/または全脳放射線療法が含まれる。しかし、この積極的な治療をしても、これらの患者の生存期間の中央値は短い8-11ヶ月77、8、98,です。これらの厳しい統計は、新しい効果的な治療戦略の同定と実施の必要性を強く支持する。したがって、脳に転移するすべての癌と同様に、実験室で乳癌関連脳転移(BCBM)を適切にモデル化し、現場での大きな進歩を確実にすることが不可欠である。
これまで研究者は、脳への転移のメカニズムを研究するために様々な方法論を利用してきましたが、それぞれが明確な利点と限界を持っています 10,,11.尾静脈や心臓内注射などの実験的転移方法は、腫瘍細胞を全身に広げ、注射された細胞に応じて他の転移部位で巨大な腫瘍負担を引き起こす可能性がある。これらの結果は、特に脳への転移を研究する場合に交和しています.この頸動脈内注射法は、腫瘍細胞の脳播種を特異的に標的とするため有利であるが、技術的に行いにくくな限られている。正交性原発性腫瘍切除は、転移カスケード全体を再現するため、しばしば最も臨床的に関連する転移モデルと考えられる。しかし、このアプローチは、リンパ節、肺および肝臓などの他の転移部位と比較して、脳転移の劇的に低い率で発生する自発的転移のための長期の待ち時間を伴う。多くの場合、動物は、脳転移の発症前に、これらの他の転移部位における腫瘍の負担のために研究から除去されなければならない。脳の熱帯細胞株を含む他の方法は、脳への転移に有効です;しかし、これらのモデルは、開発に時間がかかり、伝播によってトロピズムを失うことが多いという限られています。これらの制限を考えると、研究者は頭蓋内注射法を日常的に使用して、脳11、12、13、1412,13,14の様々な方法論を持つ脳への癌転移をモデル化11し、15、16、17、18、19,17,18,19を用いた。15,このアプローチにも同様に限界があり、最も重要なのは、原発性腫瘍からの内侵入、血液脳関門の貫通、脳内の確立を含む早期転移ステップの調査を可能にしないことが認められている。しかし、研究者は(1)脳内の腫瘍由来因子がどのような腫瘍由来因子を媒介するのか(例えば、腫瘍細胞の発癌因子の遺伝子操作)、(2)転移性微小環境の変化が本サイトでの癌増殖をどのように変化させるか(例えば、変化した間質成分を有するトランスジェニックマウスの比較)および(3)確立された病変の成長に関する新しい治療戦略の有効性をテストすることを可能にする。
頭蓋内注射モデルの潜在的な有用性を考えると、注射中の技術的な誤差を減らし、時間の経過とともに腫瘍の成長を正確に監視することが絶対に必要です。本明細書に記載される方法は、吸入ガス麻酔の連続的な投与、および立体性ドリルおよび注射スタンドを用いた脳のパレンチマへの腫瘍細胞の直接注入を含む。ガス麻酔を管理することで、麻酔の深さと長さを微調整し、迅速かつスムーズな回復を保証することができます。デジタル制御された自動ドリルおよび針注入システムは注入現場の精密を高め、穴あけおよび自由手注入方法によってしばしば生じる技術的な誤りを減らす。磁気共鳴画像法(MRI)の使用は、腫瘍の成長、腫瘍の体積、組織応答、腫瘍壊死、および治療への応答を監視する精度をさらに高める。MRIは、軟組織20,21,21に対する選択のイメージングモダリティである。このイメージング技術は電離放射線を使用せず、特に研究の過程で複数のイメージングセッションに対してコンピュータ断層撮影(CT)よりも好まれます。MRIは、CTまたは超音波画像(USG)の利用可能な軟部組織コントラストのはるかに大きな範囲を有し、より詳細に解剖学を提示する。それは脳自体の中の異常のためにより敏感で特異的です。MRIは、2D USGまたは2D光学画像処理の場合と同様に被検体を物理的に移動させることなく、任意の撮像平面で行うことができる。頭蓋骨は、他のイメージングモダリティのようにMRI信号を減衰しないことに言及することが重要です。MRIはCTまたはUSGの骨からのアーチファクトによって隠されるかもしれない構造の評価を可能にする。さらに、MRIには多くの造影剤が利用できることがあり、これは病変検出限界を高め、毒性や副作用が比較的低い。重要なことに、MRIは、腫瘍量の解読に制限されている壊死時の組織学的評価とは異なり、リアルタイムでモニタリングを可能にする。生物発光イメージングなどの他のイメージングモダリティは、早期の腫瘍の検出と時間の経過と共にのモニタリングに実際に有効です。しかし、この方法では細胞株の遺伝子操作(例えばルシファーゼ/GFPタグ付け)が必要であり、体積測定はできません。MRIは、MR画像の患者モニタリングおよび下流容積分析を反映しているので、さらに有利であり、壊死22における組織学的腫瘍サイズと強く相関することが知られている。MRIスクリーニングによる連続モニタリングはまた、神経学的障害の臨床モニタリングを増加させ、それらが起こった場合。
全体的に、頭蓋内腫瘍の立体的な注入の方法を示し、続いて連続MRIを行うことで、信頼性が高く、予測可能で測定可能な結果を生み出し、癌における脳転移のメカニズムを研究することができます。

<table><tbody><tr><td>Surgical Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Products</td><td>19-027132</td><td>ポビドンヨード、7.5%</td></tr><tr><td>ボーンワックス</td><td>外科専門</td><td>903</td><td>滅菌および可鍛性蜜蝋およびパルミチン酸イソプロピル</td></tr><tr><td>ブポノルフィン SR-Lab</td><td>ZooPharm</td><td>N/A</td><td>長時間作用型注射用鎮痛剤 5 mL (0.5 mg/mL) ポリメトリック製剤</td></tr><tr><td>コットンチップアプリケーター</td><td>ピューリタン</td><td>25-806 10WC</td><td>滅菌ロングステムコットンチップアプリケーター</td></tr><tr><td>アイ軟膏</td><td>プラルーベ</td><td>17033-211-38</td><td>潤滑性ワセリンおよび鉱物油ベースの眼科用軟膏</td></tr><tr><td>ハンドウォーマー</td><td>ホットハン</td><td>ズ HH2</td><td>空気活性化ヒートパック</td></tr><tr><td>イブプロフェン</td><td>アップ &アップ</td><td>094-01-0245</td><td>液体懸濁液中5mLあたり100mg</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ヘンリー・シャイン INC</td><td>1182097</td><td>麻酔気化器で使用する液体麻酔薬</td></tr><tr><td>メス</td><td>インテグラ ミルテックス</td><td>4-410</td><td>#10 使い捨てメス刃</td></tr><tr><td>スキングルー</td><td>ベトボンド</td><td>1469SB</td><td>皮膚に安全な創傷 接着剤</td></tr><tr><td>滅菌ドレッシング</td><td>TIDI 製品</td><td>25-517</td><td>個別包装滅菌ドレープ</td></tr><tr><td>縫合</td>糸 <td>Covidien</td><td>SP5686G</td><td>45cm スウェッジ 5-0 モノフィラメント ポリプロピレン縫合</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><ストロング> 定位固定装置</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高速ドリル (フォアドーム)</td> <td>Kopf</td><td>モデル 1474</td><td>最大 38,000 RPM</td></tr><tr><td>マウスガス麻酔ヘッドホルダー</td><td>Kopf</td><td>モデル 923-B</td><td>歯の穴とノーズコーン付きマウスバー</td></tr><tr><td>ノンラプチャー イヤーバー</td><td>Kopf</td><td>Model 922</td><td>マウスアプリケーションに適したイヤーバー</td></tr><tr><td>脳定位固定装置</td><td>Kopf</td><td>Model 940</td><td>ベースプレート、フレーム、リニアスケールアセンブリ、デジタル読み出しモニター</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>付きInjector</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injector Needleとシリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>80366</td><td>26ゲージ針、針の長さ51 mm、針の長さ10 &mu;L容量シリンジ</td></tr><tr><td>Legato 130A 自動シリンジポンプ</td><td>KD Scientific</td><td>P/N: 788130</td><td>自動インジェクター</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>付きプログラム可能なタッチスクリーンベース<tr><td>麻酔器 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SomnoSuite 低流量デジタル気化器</td><td>ケント・サイエンティフィック</td><td>SS-01</td><td>デジタル麻酔器</td></tr><tr><td>SomnoSuiteマウス用スターターキット</td><td>Kent Scientific</td><td>SOMNO-MSEKIT</td><td>インダクションチャンバー、麻酔シリンジ 2 個、18 インチチューブ、プラスチックノーズコーン、廃アネシェシアガスキャニスター 2 個が含まれています</td></tr></tbody></table>

頭蓋内注射と磁気共鳴画像による脳転移のモデル化

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

癌の転移性広がりは、疾患の進行、積極的な癌サブタイプ、および/または後期診断の不幸な結果である。脳転移は特に壊滅的で、治療が難しく、予後が悪い。米国における脳転移の正確な発生率を推定することは困難なままであるが、頭蓋外療法が癌の治療においてより効果的になり続けるにつれて増加する可能性が高い。したがって、この部位で転移を治療するための新しい治療アプローチを同定し、開発する必要がある。このことから、がん細胞の頭蓋内注射は脳転移をモデル化する確立された方法となっている。以前は、腫瘍の成長を直接測定することができないのは、このモデルの技術的障害でした。しかし、磁気共鳴画像法(MRI)などの小動物イメージングモダリティの可用性と品質の向上は、時間の経過とともに腫瘍の成長を監視し、実験期間中に脳内の変化を推測する能力を大幅に向上させます。ここで、マウス乳腺腫瘍細胞を免疫担当マウスに続いてMRIに対する頭蓋内注射が実証される。提示された注入のアプローチは精密を高め、技術的な誤りを減らすためにデジタル制御された、自動化されたドリルおよび針の注入とイオブルラン麻酔および立体的なセットアップを利用する。MRIは、オハイオ州立大学ジェームズ総合がんセンターの9.4テスラ機器を使用して時間の経過とともに測定されます。腫瘍体積測定は、ImageJを用い、各時点で実証される。全体的に、この頭蓋内注射アプローチは、正確な注射、日々のモニタリング、および正確な腫瘍体積測定を可能にし、このモデルシステムの有用性を大幅に高め、脳転移のドライバーに対する新しい仮説をテストする。

図3は、マウス乳腺腫瘍細胞の2つの時点(7日目および10日目)における単一マウスの腫瘍体積定量を概観図する。この実験では、50,000個のDB7細胞を注入し、動物の脳をMRIで評価した。スキャンごとに30枚(厚さ0.5mm)を取り込んだ。スキャン当たり30枚のスライスの評価により、7日目の注射後に、5枚のスライスが腫瘍負担を示し(図3A)、10日目の注射後に、9枚のスライスが腫瘍負担を示すことが明らかになった(図3B)。各画像は、説明したように腫瘍領域について評価し、各フレームの面積を図3Cに示した。腫瘍総容積はスライス厚さのために決定され、調節される。図4は、代表的な画像(図4A)および経時の腫瘍体積のヒストグラムを含む、出版形式の代表的データを示している(<strong clas...

頭蓋内脳転移のモデル化は、腫瘍の大きさと治療に対する反応を正確かつタイムリーな方法で監視できないことによって複雑になる。提示された方法論は、磁気共鳴画像分析と頭蓋内腫瘍注射を組み合わせ、これを組み合わせると、正確で一貫した注射、強化された動物モニタリング、および正確な腫瘍体積測定を育成する。

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

この頭蓋内注射プロトコルは、脳転移のメカニズムをより効果的に研究するために、正確な注射、日々のモニタリング、正確な腫瘍体積測定を可能にするため、重要です。この技術の主な利点は、頭蓋内腫瘍の増殖の連続的なモニタリングを可能にすることである。この手順のデモンストレーションは、サイズモア研究所の大学院研究員であるジョナサン・スペハーと、オハイオ州立大学小動物イメージング共有資源のイメージング研究科学者アンナ・ブラタスです。手順を開始する前に、ドリルのステージロックをねじってドリルビットアダプタと無菌1ミリメートルドリルビットをドリルに挿入し、手動でビットロックを締めてドリルをロックします。ドリルを立体性フレームに取り付け、デジタルインジェクタの送達率を1分あたり0.4マイクロリットルに設定し、目標は2マイクロリットルです。ペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、麻酔マウスをフレーム上に置き、綿の先端アプリケーターの鈍い端を使用して、マウスバーのトラフに歯を配置します。左耳の内側カンサスに対して左耳棒を押して頭蓋骨を安定させ、立体フレームのネジを使用して頭蓋骨を所定の位置にロックします。その後、同じ方法で右耳棒で頭蓋骨の反対側を固定します。カルバリアウィンドウを作るために、3つの連続交互ベタジン溶液と70%エタノールスクラブで頭皮をきれいにし、無菌メスを使用して、矢状縫合線に続く頭蓋骨の中央中央中央部の側面に沿って皮膚を通して3ミリメートルの切開を行います。生殖不能ドリルビットを識別し、ブレグマに垂直に向け、デジタルバーニアスケールをゼロにリセットし、ドリルビットを矢状縫合糸に2ミリメートル横向きに、1ミリメートル前部を冠状縫合に移動させます。ドリルから皮膚を離れ、最高速度を使用してランドマークに注意を払い、約0.5ミリメートルの深さの穴をカルバリアを通して慎重に掘削し、必要に応じて滅菌生理液の滴でドリルサイトを冷却します。カルバリアウィンドウが作成されたら、ドリルを慎重に上げ、定位フレームからドリルを取り除きます。がん細胞注射の場合は、自動インジェクターユニットを立体性装置に取り付け、DPBSで完全に再懸濁した6〜8マイクロリットルの細胞を無菌のハミルトン注射器にロードします。注射器を注入器に積み込み、少量の溶液を使い捨ての滅菌ドレープに分配して注射用の針をプライミングします。コットンチップアプリケーターを使用して70%エタノールで注射器を拭き、露出した大脳に触れるまで針の先端をカルバリアウィンドウの中央に合わせます。デジタルバーニアスケールをゼロにリセットし、ゆっくりと脳に3ミリメートルの深さに針を挿入します。注射器の画面で実行を選択する前に、少なくとも60秒間脳内に針を残して、注射部位への細胞送達を開始します。すべての細胞が送達されたら、針を少なくとも3分間脳内で休ませて、脳のパレンチマが注射に慣れさせ、毎分0.75ミリメートルの速度で脳から針を引き込むことを可能にする。腫瘍負担の磁気共鳴画像処理の場合、適当な実験時点での撮像の10〜20分前に、標準的な腹腔内注射によりマウスに対して20グラムの体重ガドリニウムベースの造影剤を100マイクロリットル当たり100マイクロリットル投与する。マウスの後注射を麻酔し、麻酔付きマウスを加熱ホルダーに置きます。ホルダーをマウスの脳表面コイルを装備した9.4 Tマグネットに入れ、ローカライザー画像を得ます。次に、T2重み付けされた稀な配列を使用してマウス脳を画像化し、ガドリニウムベースのコントラストT1を重み付けした稀な配列をポストする。腫瘍の総容積を測定するには、ImageJで目的のMRIデータファイルを開き、自由手選択ツールを使用して腫瘍の周囲に輪郭を描きます。次に、[解析]タブを開き、メジャーを選択して、選択した領域の領域を取得します。特定の時点で個々のマウスのスライスを含むすべての腫瘍が評価されたら、適切なデータ分析プログラムに値をエクスポートします。ここで、マウスマリンママ腫瘍細胞注射後7日目および10日目における単一マウスの腫瘍体積定量の代表的な概観が観察できる。スキャンごとに30枚のスライスを評価した結果、この分析では、7日目の注射後に5つのスライスが腫瘍負担を示すことが明らかになった。10日目の間に、9つのスライスが腫瘍の負担を示した。各画像の腫瘍領域を実証通り測定し、腫瘍体積の変化を経て追跡することを可能にした。各細胞株と各レシピエントマウスモデルは一意であるため、イメージング精度を確保するために、注入される細胞数とMRIスケジュールの最適化が必要です。この手順に従うと、脳は、単一細胞の単離または組織病理学的分析を含む、本質的に任意の下流アッセイのために収穫することができる。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

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出典:Lim, M., et al.がん細胞の内部頸動脈注射による脳転移のモデリング。J. Vis.

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学ぶ頭蓋内注射とMRIを用いた脳転移モデリング法。ステレオタクティックフレームによる正確な腫瘍注入と磁気共鳴画像解析により、腫瘍成長の逐次モニタリングと正確な体積測定が可能となり、脳転移のメカニズム研究に貢献します。

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