Name: 視葉可視化のためのショ ウジョウバエ の幼虫および成虫の脳の解剖、免疫組織化学、およびマウント (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: 学ぶショウジョウバエの脳解剖と免疫組織化学による視葉可視化法。幼虫と成虫の脳を用いた3種類のマウント戦略で、特定の視葉構造を最適な角度から観察できます。神経科学研究に有用です。

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Bsh抗体のアリコートを共有してくださったClaude Desplanに感謝します。DE-カドヘリン、ダックスフンド、アイズアブセント、セブンアップ、およびブルッフパイロットモノクローナル抗体は、NIHのNICHDによって作成され、アイオワ大学生物学部、アイオワシティ、アイオワ州52242で維持されているDevelopmental Studies Hybridoma Bankから入手しました。この研究は、T.E.に授与されたNSERCディスカバリー助成金によって支援されました。UAは、NSERCアレクサンダーグラハムベルカナダ大学院奨学金によってサポートされています。PVは、オンタリオ大学院奨学金によってサポートされています。

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<li>Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+immunofluorescent+staining+of+mushroom+body+and+photoreceptor+neurons+in+adult+Drosophila+melanogaster+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult Drosophila melanogaster brains.</a> Journal of Visualized Experiments. , e56174(2017).</li>
<li>Williamson, R. W., Hiesinger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+developing+and+adult+Drosophila+brains+and+retinae+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. , e1936(2010).</li>
<li>Bertet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+patterning+of+neuroblasts+controls+notch-mediated+cell+survival+through+regulation+of+hid+or+reaper%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Temporal patterning of neuroblasts controls notch-mediated cell survival through regulation of hid or reaper.</a> Cell. 158, 1173-1186 (2014).</li>
<li>Pinto-Teixeira, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Concurrent+Retinotopic+Maps+in+the+Fly+Motion+Detection+Circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development of Concurrent Retinotopic Maps in the Fly Motion Detection Circuit.</a> Cell. 173, 485-498 (2018).</li>
<li>Plevock, D. A., Rusan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Drosophila+Larval+Neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51756(2014).</li>
<li>Ting, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+dendritic+morphology+in+columns+and+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analyzing dendritic morphology in columns and layers.</a> Journal of Visualized Experiments. , e55410(2017).</li>
<li>Özel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodial+dynamics+and+growth+cone+stabilization+in+Drosophila+visual+circuit+development%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development.</a> eLife. 4, (2015).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益がないことを宣言します。

このプロトコルでは、ショウジョウバエの幼虫と成虫の脳を免疫染色し、それらをいくつかの向きにマウントする方法について説明します。幼虫および成虫の脳を染色する方法は以前に説明されてきたが22,23,24,27,28、特定の視葉構造の最適な視覚化のためのマウンティング戦略はあまり注目されてこなかった28。ここで説明するプロトコルにより、研究者は、実装方向と視覚化された視ローブ構造との関係をより深く理解できるようになることが期待されます。
このプロトコルに記載されている方位に加えて、視葉を中心脳から分離することにより、成虫および幼虫の視葉可視化の代替角度を達成することができる。視葉は、昆虫ハサミ、鉗子、...

複眼とその下にある視神経葉で構成されるショウジョウバエの視覚系は、神経回路の発達と機能の研究のための優れたモデルです。近年、特に視葉は、神経新生や回路配線1,2,3,4,5,6,7,8などの神経発達過程を研究するための強力なシステムとして浮上しています。それは4つの神経胞から成り立っています:椎弓板、髄質、小葉および小葉板（後者の2つは小葉複合体を構成する)1,2,3,4,5,6。眼からの光受容体は、椎弓板と髄質のニューロンを標的とし、これらは視覚入力を処理して、それらを小葉複合体1,2,3,4,5,6の神経胞に中継します。小葉複合体の投射ニューロンは、その後、視覚情報を中枢脳1,5,9の高次処理センターに送る。視葉の複雑な構成は、網膜トピーを維持し、さまざまな種類の視覚刺激を処理する必要性によって必要とされるため、高度な神経回路がどのように組み立てられるかを研究するための魅力的なシステムとなっています。特に、髄質は、その組織化と発達の両方で、脊椎動物の神経回路発達のモデルである神経網膜と顕著な類似性を共有しています3,8。
視葉の発達は胚発生中に始まり、視プラコード 2,4,5,6,7,8 を形成する ~35 個の外胚葉細胞が特定されます。幼虫の孵化後、視プラコードは2つの異なる原始に細分されます:1)椎弓板と外髄のニューロンを生成する外側増殖中心(OPC)、および2)内側髄質と小葉複合体のニューロンを生成する内部増殖中心(IPC)4,5,6,10 .後期のセカンドインスター幼虫では、OPCおよびIPCの神経上皮細胞が神経芽細胞に変化し始め、その後、中間神経節母細胞4,5,11,12を介してニューロンを生成する。視葉神経芽細胞は、空間的および時間的に制限された転写因子によってパターン化され、それらが一緒に作用してその子孫11,12,13,14に神経多様性を生成する。蛹では、視神経葉神経胞の回路は、プログラムされた細胞死11,15、ニューロン移動12,16、軸索/樹状突起ターゲティング10,17、シナプス形成18,19、およびニューロピル回転10,17を含むいくつかのプロセスの調整を介して組み立てられます。
ここでは、視葉をイメージングするために、幼虫と成虫の脳を解剖し、免疫染色し、マウントする方法論について説明します。その複雑な三次元構造を考えると、視葉の解析には、成体の神経胞と幼虫の祖先が互いに、そして中枢脳に対してどのように位置しているかを理解する必要があります。したがって、取り付けの向きが視ローブ構造の空間構成にどのように関連しているかに特に重点を置きます。幼虫の脳には3つのマウント戦略(前部、後部、外側)と成虫の脳には3つのマウント戦略(前部、後部、水平)について説明し、それぞれが特定の視葉前駆細胞集団または神経孔をイメージングするための最適な角度を提供します。

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>Bioshop</td><td>PBS405</td><td></td></tr><tr><td>37% ホルムアルデヒド</td><td>Bioshop</td><td>FOR201</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (ヤギ) 二次</td><td>Invitrogen</td><td>A-11055</td> を <td>1:500 で使用</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 (マウス) 二次</td><td>Invitrogen</td><td>A-31570</td> を <td>1:500 で使用</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 (モルモット) 二次</td><td>Invitrogen</td><td>A-21450</td><td>を 1:500 で使用</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 (ラット) 二次</td><td>Invitrogen</td><td>A-21247</td><td>1:500 カバー</td></tr><tr><td>スリップ</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td></td></tr><tr><td>解剖鉗子 - #5</td><td>Dumont</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>解剖鉗子 - #55</td><td>Dumont</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>解剖皿</td><td>コーニング</td><td>722085</td><td></td></tr><tr><td>ドライワイプ</td><td>キンバリー クラーク</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ anti-Bgal 一次抗体</td> 1<td>:1000</td>で <td>Biogenesis</td><td></td> を使用</tr><tr><td>モルモット anti-Bsh 一次抗体</td><td>Gift from Claude Desplan</td><td></td><td>1:500 で使用</td></tr><tr><td>モルモット anti-Vsx1 一次抗体</td><td>Erclik et al. 2008</td><td></td><td>1:1000 で使用</td></tr><tr><td>ラボ フィルム</td><td>パラフィルム</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.600</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>VWR</td><td>CA4823-180</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗DAC一次抗体</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>mabdac2-3</td><td>1:20 マウス</td></tr><tr><td>抗 eya 一次抗体</td><td>DSHB</td><td>eya10H6</td><td>1:20</td></tr><tr><td>マウス抗 nc82 一次抗体</td><td>DSHB</td><td>nc82</td><td>1:50</td></tr><tr><td>マウス抗svp一次抗体</td><td>DSHB</td><td>セブンアップ2D3</td><td>を1:100で使用</td></tr><tr><td>ポリマークレイ</td><td>あらゆる種類の粘土を使用可能</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A-11122</td>を<td>1:1000で使用</td></tr><tr><td>ラット抗DE-Cadherin一次抗体</td><td>DSHB</td><td>DCAD2</td><td>を1:20で使用</td></tr><tr><td>スローフェード封入剤</td><td>S36967</td><td></td><td>ベクタシールド封入剤(cat#H-1000)も使用可能</td></tr>トリ<tr><td>トン-x-100</td><td>バイオショップ</td><td>TRX506</td><td></td></tr></tbody></table>

視葉可視化のためのショ ウジョウバエ の幼虫および成虫の脳の解剖、免疫組織化学、およびマウント

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

ショウジョウバエ視葉は、椎弓板、髄質、小葉板、小葉板の4つの神経小孔で構成されており、神経多様性を生み出し、回路の組み立てを駆動する発達メカニズムを探索するための優れたモデルシステムです。その複雑な三次元構造を考えると、視葉の解析には、成体の神経胞と幼虫の祖先が互いに、そして中枢脳に対してどのように位置しているかを理解する必要があります。ここでは、視葉イメージングのための幼虫および成虫の脳の解剖、免疫染色、およびマウントのためのプロトコルについて説明します。特に、取り付け方向と視ローブの空間構成との関係に重点が置かれています。幼虫の3つの取り付け戦略(前部、後部、外側)と成虫の3つの取り付け方略法(前部、後部、水平)について説明し、それぞれが明確な視葉構造に理想的なイメージング角度を提供します。

プロトコルに記載されている向きに取り付けられた幼虫および成虫の視葉の共焦点画像を 図1 および 図2に示します。
図1は、前向き、後向き、および横向きに配置された幼虫の脳の概略図と代表的な共焦点スライスを示しています。前方の取り付け方向では、OPC上皮(DE-カドヘリン)、髄質神経芽細胞(デッドパン&gt;βgal)、および椎弓状ニューロン(ダックスフンド)が、脳を包み込む細胞の帯として表面に現れます(図1B、D)。OPCは、転写因子6,11,12の差次的発現により、その背側/腹側軸に沿って空間的にパターン化される。Vsx1は中央OPC...

このプロトコルは、イメージングのために幼虫および成虫の ショウジョウバエ の視葉を準備するための3つのステップを説明しています:1)脳の解剖、2)免疫組織化学、および3)マウント。ステップ3に重点が置かれ、特定の光学ローブ構造を視覚化するには明確な取り付け方向が必要です。

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the ...

私たちは、視葉に特に重点を置いて、幼虫と成虫のショウジョウバエの脳を解剖、免疫染色、マウントするためのプロトコルについて説明します。視ローブの複雑な3次元組織を考えると、ここで説明するプロトコルは、研究者が実装方向と視覚化された視ローブ構造との関係をより深く理解するのに役立つと期待されます。このプロトコルでは、幼虫と成虫の両方の視葉に対する3つの取り付け戦略について説明しており、それぞれがイメージング中に特定の視葉構造を視覚化するための最適な角度を提供します。解剖を開始する前に、3ウェルプレートのすべてのウェルにウェルあたり400マイクロリットルのPBSを充填し、鉗子を使用して、ショウジョウバエのバイアルまたはボトルの内側を這う15匹のさまよう3番目の幼虫を穏やかに選択します。すべての幼虫を3つのウェルプレートの最初のウェルに入れ、1つの幼虫をプレートの中央のウェルに移します。利き手ではない手を使って、井戸の根元で幼虫の体を拘束し、利き手を使って幼虫の口のフックをそっとつかみます。マウスフックを体から引き離して脳を取り出します。その後、想像椎間板を含むアクセサリー組織を取り出します。次に、脳をプレートの3番目のウェルに入れます。すべての脳を解剖したら、P200ピペットを使用して3番目のウェルからPBSを慎重に取り出し、脳を水没させるのに十分な溶液を残します。調製したばかりの500マイクロリットルの冷温固定溶液をウェルに加えます。脳が皿の中で渦巻くように鉗子で溶液を静かに攪拌し、ガラス顕微鏡スライドでウェルを覆います。次に、皿を氷の上に30分間置き、ティッシュを固定します。400マイクロリットルの新鮮なPBSとトリトンで脳を5回洗います。これで、脳は一次抗体のインキュベーションの準備が整いました。成体の脳解剖では、10〜15匹の成虫のハエに麻酔をかけ、氷の上の実験室のワイプに置きます。鉗子を使用して、翼で1匹の成虫のハエを、400マイクロリットルのPBSを含む3ウェル解剖プレートの1ウェルに静かに移します。利き手ではない手で一対の鉗子を使用して、ハエの胸部を井戸の基部に押し付け、利き手で超微細な鉗子を使用して、体の残りの部分から頭をそっと引き抜きます。非利き手で体を実験室の拭き取りに捨て、利き手を使用して頭をテングで井戸の底に押し付けます。両方の鉗子を使用して、脳が露出するまで目の間のキューティクルの各領域を剥がし、脳に付着したままのアクセサリー組織をすべて取り除きます。洗浄した脳を3番目のウェルに入れ、示されているように次の脳を解剖し、15個の脳が得られるまで、または最大解剖期間が30分経過するまで行います。500マイクロリットルの固定液で室温で20分間脳を固定し、示されているようにPBSとトリトンで脳を5回洗浄します。成体脳は、一次抗体のインキュベーション

dissection-immunohistochemistry-mounting-larval-adult-drosophila

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

ここでは、GFPタグ付きのグリア細胞とペアライブ顕微鏡分析を使用して開発をショウジョウバエの眼にグリア細胞の遊走を調べるためのプロトコルについて説明します。...

ショウジョウバエの眼成虫ディスクに付属してグリア細胞の移行のイメージングを生きる

幼虫、蛹および成人の解剖と免疫組織化学<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;網膜

このビデオでは、成虫のハエの無傷の脳をブリッジスライドの下に埋込む方法を説明し、蛍光顕微鏡法のために免疫染色された脳に対して行われるプロトコールを示しています。...

成虫ショウジョウバエの脳のマウント:共焦点イメージング用のスライドを準備する方法

免疫染色は、組織内の特定の細胞タイプやタンパク質を可視化するための効果的な技術です。超音波処理を利用することにより、ここに記載されているプロトコルは、免疫染色の前に後期胚および幼虫からショウジョウバエ・メラノガスター組織を解剖する必要性を軽減する。私たちは、ホルムアルデヒド固定全マウント幼虫の免疫染色のための効率的な方法を提供します。...

後期胚および幼虫の超音波処理により促進免疫蛍光染色<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;組織<em&gt;その場で</em

このプロトコルは、無傷の幼虫の脳のコンテキストで生細胞イメージングを行うために使用合理化された方法を説明します。ライブセルイメージングのアプローチは、一貫して、以前に見落とされたメカニズムを暴く、非対称神経幹細胞分裂の研究だけでなく、他の神経と発達過程のための非常に貴重である。...

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経芽細胞

ショウジョウバエの成体構造は、虚数円盤と呼ばれる袋のような構造に由来します。これらのディスクの解析により、組織決定、コンパートメント境界の確立、細胞増殖、細胞運命の仕様、平面細胞の極性など、多くの発生過程に関する洞察が得られます。このプロトコールは、光/蛍光顕微鏡用の架空ディスクを調製するために使用されます。...

解剖や成虫の免疫染色からキイロショウジョウバエ

大人ショウジョウバエの脳は神経回路、高次脳機能、および複雑な疾患を研究するための貴重なシステムです。小さなハエの頭から全脳組織を分析するための効率的な方法は、脳ベースの研究を促進します。ここでは、よく保存された形態を有する成人の脳の簡単な、ワンステップ解剖プロトコルを記述します。...

大人のホールマウントの準備のためのシンプルなワンステップ解剖プロトコル<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ブレインズ

このプロトコルは、郭清と大人のショウジョウバエの染色について説明します脳の組織。具体的には、このプロトコルでは、神経の開発の多くの側面の基礎となる原則を明らかに正確に使用することができます例の神経細胞サブセットとしてショウジョウバエのきのこ体と光受容ニューロンの使用を強調表示します。...

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

免疫組織化学、西部の分析、および RNA 抽出のための組織の処理のためのプロトコル、ショウジョウバエ蛹網膜を解剖するための手術方法を提案する.

免疫組織化学、西部の分析、および RNA の隔離のためのショウジョウバエ蛹網膜の解剖

この研究では、斬首、固定、凍結切片、蛍光染色、免疫染色、およびイメージングを含む組織処理の簡略化されたプロトコルを提示します。これらは共焦点および多光子イメージングに拡張できます。この方法は、複雑な解剖に匹敵する有効性を維持し、高度な運動能力の必要性を回避します。定量的な画像分析は、広範な調査の可能性を提供します。...

脳蛍光染色および免疫染色を強化するための ショウジョウバエ 頭部の直接凍結切片

学ぶショウジョウバエの脳解剖と免疫組織化学による視葉可視化法。幼虫と成虫の脳を用いた3種類のマウント戦略で、特定の視葉構造を最適な角度から観察できます。神経科学研究に有用です。

視葉可視化のためのショウジョウバエの幼虫および成虫の脳の解剖、免疫組織化学、およびマウント

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視葉可視化のためのショ ウジョウバエ の幼虫および成虫の脳の解剖、免疫組織化学、およびマウント

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