Name: 「大子広場」の合理化されたサンプリングと栽培 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: 学ぼう、海洋性被囊動物Oikopleura dioicaの長期培養システム構築法。プランクトンネットによる採集、顕微鏡による種同定、藻類餌育プロトコルを含む。生態学・発生生物学・ゲノミクス研究に有用なモデル生物の安定的な培養技術を習得できる。

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ガース・イルズリーが文化システムの確立を支援してくれたことに感謝しています。我々は、須山律子とシルヴァン・ギロの早期サンプリングと種同定の取り組みに対する貢献を認める。西田博樹、大沼武志、表胸達也さんの皆様には、地元の培養システムの初期設立や動物や微細文化の共有など、幅広いサポートと指導を受け、感謝の気持ちを抱いています。また、ダニエル・チュラウト、ジャン=マリー・ブーケ、アン・アースヨルド、クリスティアン・カニェストロ、アルフォンソ・フェランデス=ロルダンのサンプリングと培養に関する専門知識を共有してくれたことに感謝します。ジャイ・デントン、チャールズ・プレッシー、ジェフリー・ジョリーは原稿に貴重なフィードバックを提供しました。シャーロット・ウェストは藻類計算のための一般化された方程式を策定した。最後に、OISTの資金、メアリー・コリンズ、OISTフィールドワーク安全委員会に対し、安全なサンプリング手順に関するアドバイス、培養・サンプリング装置の建設に関するOIST機械店のスタッフ、海水を供給してくれた藤田浩一に感謝します。

著者は宣言するものは何もない。

O.ジオカ文化の確立の柔軟性を促進するためには、動物の自然の生息地を理解することが重要です。季節データは、実験室の培養条件を導くために使用できる物理的パラメータの範囲に関する情報を提供します。また、動物の豊富さの季節変動を理解するのに役立ちます。沖縄では、O.ディオイカが6月から10月まで最も確実に見つかる。しかし、東京湾では、2月と10月41日に人口がピークに達します。O.ジオカの培養は20°C以下27、28、2928,29で報告されることが多いが、沖縄O.ジオカは20°Cを超える温度でより良い生存率を示す。27沖縄の海面水の最低温度が~20°Cであるということで説明できるかもしれません(図6)。O.ジオカの豊富さも植物プランクトンの花42と捕食者の豊富さ43、44の影響を44受けるかもしれません。O.ジオカがどこで収集されているかに関係なく、地元の人々の季節性を理解することは、サンプリングと培養の成功のチャンスを最大化します。
適切な季節と場所を考えると、ネットサンプリングは最小限の労力で多数のオイコプレラを収集する効果的な方法です。小さいメッシュサイズ(60〜70 μm)のプランクトンネットは、動物のすべての段階を収集するためにも使用することができます。完全に成熟した動物は、おそらくライフサイクルの終わりにその脆弱性のために、ネットで見られることはめったにありません。したがって、種同定後のサンプリングは、脊体下細胞の顕微鏡観察によって達成される。成熟した個体は、通常、動物が実験室で成長し続けるにつれて、サンプリング後1〜2日に現れる。ネット サンプリングは効率的ですが、異なる状況で代替サンプリング方法が必要になる場合があります。例えば、都市部付近でのネットサンプリングは、植物プランクトンを大量に集めることが可能で、オイコプレウラを隔離することが困難である。このような場合には、港の向こうの領域から水面海水またはボートサンプリングを収集するための簡単なバケットサンプリングをお勧めします。結果は、連続した日の雨による食前の漸進的変化がO.ディオイカの豊富さに影響を与えなかったことを示した。しかし、熱帯低気圧などの極端な気象事象の直後に海岸をサンプリングすることは避けるべきです。これらの事象は、保護された水域45,46,46に突然の急激な生物地球化学的変化を引き起こす。雨水流出は、汚染物質、堆積物、過剰な栄養素を運び、濁度を増加させ、水質を低下させる47.オイコプレウラのようなフィルター給餌プランクトンは、摂食のモードと限られた移動性のためにこれらの変化の影響を受けやすいかもしれません。このような状況では、局所的な条件が正常に戻るまで数日間サンプリングを延期することをお勧めします。
O.dioicaのような小さなフィルター供給生物を維持するためには、多段階フィルタシステムの導入が不可欠です。不十分に濾過された海水(例えば、以前の培養系では25μmのメッシュ)を使用すると、特に夏期には植物プランクトンの豊富さが高いため、培養が不安定になることが多かった。いくつかの植物プランクトンは、O.ジオカの成長に有益であるが、他のがO.ジオイカ胚48の異常な発達を引き起こす可能性のあるビオトキシンを産生する。さらに、Chaetoceros spp.のような高濃度の珪藻は、家を詰まらせ、効率的な給餌を防ぐことができる長いセタエを所有することができるので、O.ディオイカの成長に潜在的に有害である49。我々は頻繁にC.カルシトランスセタエによって詰まっている小動物の家を観察しました。したがって、2日目以上の動物にのみC.カルシトランスを供給します(表3)。
ここでは問題ではありませんでしたが、O.dioicaの小規模な長期培養は、遺伝的ボトルネックのために人口規模の急激な低下を経験する可能性があります。このような場合、マルティ・ソランらは29世代ごとに新しい野生の個人を文化に加えることを推奨しています。
オイコプレラ文化システムは柔軟です。1週間以内に安定した文化を確立することができます。O.dioicaの長期培養は、非専門機器を備えた控えめな予算で可能です。オイコプレウラの5~10ビーカーのメンテナンスに必要な日々の労力は、一般的に2人で2時間未満です。O.ジオイカは、天然海水28にアクセスできない人に有益である人工海水で維持することもできる。藻類食品の長期保存は、固体培養および凍結保存29を使用して可能である。さらに、O.ジオイカ精子は凍結保存することができ、そして1年以上生存可能であり続ける50年。これらの要因はすべて、文化を容易に再確立できることを意味します。最後に、プレユーロブラキアspの偶発的な培養での過去の経験.オイコプレウラのために開発された培養システムは、潜在的に脆弱な遠洋生物のより広範なコミュニティに拡張することができることを示唆している可能性があります。
O.dioicaは、様々な生物学的分野に対する強力な洞察を提供し続けています。地域の季節性、細心の文化システム、そして少数の献身的な個人を理解することで、効果的な文化をほとんど努力して確立することができます。オイコプレウラ培養システムは、このユニークな海洋帯腺の生態学、開発、ゲノミクス、および進化に関する幅広い生物分野を調査するための基礎資源を提供します。

モデル生物は、開発、遺伝学、生理学に関する問題を含む多くの生物学的問題に取り組んできました。さらに、追加のモデル生物は新しい発見を促進し、したがって、自然の理解を深めるために重要である1,,2.海洋動物プランクトンは、海洋生態系3、4、5、64,5において重要な役割3を果たす生物の多様なグループである6。その豊富さと生態学的重要性にもかかわらず、プランクトンチュニケートのようなゼラチン性生物は、その透明性と脆弱さがフィールドコレクションと識別を77,8に挑戦させるため、プランクトン生物多様性研究では過小評価されることが多い。適応されたサンプリング技術と実験室培養は、植物の詳細な観察を可能にする、プランクトニックチュニケート99、10、11、1210,11,12の生物学における知識を促進している。
ラーバセアン(虫垂家)は、世界中で約70種の記載された種を含む自由に泳ぐ海洋チュニケートのクラス8、1313である。彼らは動物プランクトンコミュニティ内で最も豊富なグループの一つであるとして 14,,15,,16,,17,幼虫は、魚の幼虫などの大きなプランクトン生物のための主要な食料源を表す18,,19.ascidiansとは異なり、セシルチュニケート-幼虫はオタマジャクシのような形態を保持し、生涯を通じてプランクトニックなまま20.各動物は、家として知られている自作の複雑なフィルター給餌構造の中に住んでいます。彼らは尾21の起伏のある動きを通して水流を作り出すことによって、家の中に微粒子を蓄積する。詰まった家屋は一日を通して廃棄され、そのうちのいくつかは炭素凝集体を形成し、最終的には海底22に沈む。したがって、幼虫は世界的な炭素フラックス23において大きな役割を果たす。ほとんどの種は、水柱13の上100m以内の遠洋地帯に生息すると報告されている。しかし、巨大な幼虫バソシノエウスは300 m24の深さに生息することが知られています。カリフォルニア州モントレー湾のバソコルカエウスに関する研究は、動物がマイクロプラスチックの生物学的ベクターとしても機能することを明らかにし、海洋におけるマイクロプラスチックの垂直輸送および流通における虫垂家の役割を理解する上で潜在的な重要性を示唆した。
幼虫の一種であるオイコプレウラ・ジオカは、近年、いくつかの顕著な特徴により、モデル生物として注目を集めています。それは一般的に世界中の海で報告されています。海岸海域26に特に豊富に存在し、海岸からのサンプリングが容易です。長期的な安定した培養は、自然と人工海水27、28、2928,29の両方で可能です。27温度依存生成時間は、実験室条件で4〜9日と短い。年間を通じて300個の卵を生産できる女性一人一人と高い胎児性を持っています。チュニケートとして、それは、chordateの進化を理解するための重要な系統的位置を占める30,,31.70 Mbでは、O.dioicaは、すべてのchordates32の中で最も小さな同定されたゲノムを有する。幼虫の中で、O.ジオカは、これまで33の非雌雄同種の唯一の記載である。
実験室で成長した微細藻類との最初の成功したO.ジオカ文化は、Paffenhöfer34によって報告されました。同期モーターとパドルを使用したオリジナルの培養プロトコルは、フェノーとゴルスキー35によって開発され、後に複数の研究所で採用されました。最近では、Fujiiら36は人工海水中でのO.ジオカ培養を報告し、堅牢な培養システムとフィールドコレクションはBouquetららによって記述され、簡便で手頃な価格のシステムのための最適化されたプロトコルがMarti-Solansららによって報告された。伝統的なオイコプレラ文化システムとは別に、二重チューブ飼育タンクを備えた新たに報告されたデザインも、オイコプレウラspを培養する可能性を秘めています。37.
サルス国際海洋分子生物学センター27、バルセロナ大学29、大阪大学28、および私たち自身の観測で、主要なオイコプレラ研究グループが開発したプロトコルの組み合わせに基づいて、O.dioica単一培養を推進するための詳細なプロトコルを提示します。29以前に発表された培養プロトコルでは、藻類培地の組成、ショアサンプリング技術、オイコプレラ同定に関する詳細な情報は大まかに説明され、多くのあいまいさを残した。ここでは、ビデオプロトコルの視覚情報の助けを借りて、私たちは簡単なステップバイステップの方法で、最初からO.dioica文化を設定するために必要なすべての重要な情報を組み立てました。私たちは、O.ディオイカを、最も困難なステップの1つである別の一般的に報告された種、O.ロンジカウダと区別する方法を説明します。既存の文化システムは、世界各地でのO.dioicaの栽培に適用可能ですが、地域の環境条件に基づくプロトコル調整の重要性を強調しています。提示された情報は、広く公開されたデータと経験を通じて得られた知識を組み合わせたものです。現在のプロトコルは、文化をゼロから確立することに興味を持つ研究者に最適です。

<table><tbody><tr><td>活性炭</td><td>Σ</td><td>C2764-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>アルミプーリー</td><td>レインボープロダクツ</td><td>10604-10607</td><td></td></tr><tr><td>ビオチンΣ</td><td></td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>和光</td><td>021-02195</td><td></td></tr><tr><td>コバラミン(B12)</td><td>Σ</td><td>V2876-100MG</td><td></td></tr><tr><td>塩化コバルト(II) 六水和物</td><td>和光</td><td>036-03682</td><td></td></tr><tr><td>銅(II)硫酸塩五水和物</td><td>和光</td><td>039-04412</td><td></td></tr><tr><td>エデト酸二ナトリウム水和物</td> 和<td>光</td><td>044-29525</td><td></td></tr><tr><td>ヘキサアンモニウムヘプタモリブデント四水和物</td><td>和光</td><td>019-03212</td><td></td></tr><tr><td>六角レンチ</td><td>別</td><td>館 No.6600</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>和光</td><td>080-01066</td><td></td></tr><tr><td>鉄(III)塩化物六水和物</td><td>和光</td><td>091-00872</td><td></td></tr><tr><td>ジェバオ プログラマブルオートドージングポンプ</td><td>ジェバオ</td><td>DP-4</td><td></td></tr><tr><td>マグネットポンプ</td><td>REI-SEA</td><td>RMD-201</td><td></td></tr><tr><td>塩化マンガン(II) 四水和物</td><td>ワコー</td><td>134-15302</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン巻線カートリッジフィルター</td><td>アドバンテック</td><td>TCW-10N-PPS</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>TCW-5N-PPS</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>TCW-1N-PPS</td><td></td></tr><tr><td>ねじなし端子台</td><td>佐藤部品</td><td>SL4500</td><td></td></tr><tr><td>簡易プランクトンネット</td><td>RIGO, Japan</td><td>5512-C</td><td></td></tr><tr><td>メタケイ酸ナトリウム</td><td>Σ</td><td>Σ 307815-1KG</td><td></td></tr><tr><td>硝酸ナトリウム</td><td>和光</td><td>195-02545</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム 一塩基性無水</td><td>MP バイオメディカル</td><td>194740</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトマイシン硫酸塩</td><td>Σ</td><td>S6501-25G</td><td></td></tr><tr><td>同期電動機</td><td>サーボ</td><td>D5N6Z15M</td><td></td></tr><tr><td>チアミン塩酸塩</td><td>和光</td><td>201-00852</td><td></td></tr><tr><td>紫外線滅菌器</td><td>いわき</td><td>UVF-1000</td><td></td></tr><tr><td>塩化亜鉛</td><td>MP バイオメディカルズ</td><td>194858</td><td></td></tr></tbody></table>

「大子広場」の合理化されたサンプリングと栽培

Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica

オイコプレウラ・ジオカは、フィルター供給能力、迅速な生成時間、保存初期の開発、およびコンパクトなゲノムを備えたプランクトニック・コルデートです。これらの理由から、海洋生態学的研究、進化発生生物学、ゲノミクスにとって有用なモデル生物と考えられています。研究は、多くの場合、動物資源の安定供給を必要とするため、信頼性の高い、低メンテナンスの培養システムを確立することが有用です。ここでは、O.ジオカ文化を確立するためのステップバイステップの方法について説明します。潜在的なサンプリング部位の選択方法、収集方法、標的動物同定、培養システムのセットアップ方法について説明する。私たちは、独自の経験に基づいてトラブルシューティングのアドバイスを提供します。我々はまた、強固な文化システムを維持するのに役立つ重要な要因を強調する。ここで提供される文化プロトコルはO.dioica用に最適化されていますが、サンプリング技術と培養のセットアップが他の脆弱な遠視無脊椎動物を維持するための新しいアイデアを刺激することを願っています。

オイコプレウラ・ジオカは、生物学の様々な分野でのチュニケートモデル生物です。我々は、動物および藻類飼料のサンプリング方法、種同定、培養セットアップ、および培養プロトコルについて述べる。文化システムの強化に役立つ重要な要因を強調し、考えられる問題と解決について議論します。

Oikopleura dioica is a planktonic chordate with exceptional filter-feeding ability, rapid generation time, conserved early development, and a compact ...

このプロトコルは、海洋遠洋チュニックな小子pleuraジオカのための長期的で信頼性の高い文化システムを確立する方法を視覚的に示しています。エコプレウラ文化システムは、生態学、開発、ゲノミクス、進化に関する幅広い生物分野を調査するための基礎資源を提供します。この種は短いライフサイクル、高い胎児性を有し、それは容易に海岸から収集することができ、それは優れたモデル生物を作る。このプロトコルはO.dioica用に最適化されていますが、他のプランクトニック生物にも応用できることを願っています。まず、ろ過された海水をオートクレーブから始めて、オイコプレウラ文化を維持するために藻類の食べ物を開始します。チェートセロカルシトランスのストック培養を開始するために、60ミルのオートクレーブ海水に次の30マイクロリットルのビタミン、30マイクロリットルの溶液A、15マイクロリットルの珪酸ナトリウム、および60マイクロリットルのストレプトマイシンが補充された。最後に、以前のストック培養物から30マイクロリットルのC.calcitransを接種剤として添加した。他の藻類種および培養物のサプリメントおよび接種量に関する原稿の表2を参照してください。接種後、在庫とサブカルチャーは、連続照明で摂氏17度のインキュベーターに維持されます。約10日後、フラスコが着色することで藻類の成長が確認される。この場合、同じ培養器でサブカルチャーを維持しながら、ストックカルチャーを摂氏4度で最長1ヶ月間長期保存に移します。作業文化を作成するには、オートクレーブ海水の400ミルに必要なサプリメントを追加し、前のサブカルチャーの100ミルで接種します。ゴム製のキャップでフラスコを密封し、1ミルの使い捨てピペットを挿入し、藻場に移し、8時間の日光周期と一定の気密で室温で維持します。フラスコの底部に凝集を防ぐために、1日2回手動で藻類培養を回す。藻類の培養が確立されたら、現地のサイトでフィールドサンプルを収集します。プランクトンネットをキャストし、タラの端が水面下1〜2メートル沈むことを許可します。毎秒約5〜1メートルの速度でネットを牽引します。2分から5分の間、引き続き前後に引き続き行き来します。牽引時間は、敷地内のプランクトンの豊富さに応じて調整する必要があります。牽引した後、慎重にネットを持ち上げ、タラの端の内容物を500ミルのガラス瓶にゆっくりと移します。輸送中に動物にストレスを引き起こす可能性のある気泡を避けるために、リムにボトルを充填します。この段階では、試料ボトルを暗い背景に見ることで、オイコプレラの存在を確認することができます。しかし、種レベルの同定には顕微鏡観察が必要である。500ミルボトル3本が回収されるまで、このプロセスを繰り返します。水面海水を収集して、CTDプロファイラで塩分濃度、温度、クロロフィル濃度を記録します。さらに、現場の海水を10~15リットル集めて、動物を実験室の状態に順応させます。動物を順応させるために、サンプルサイトから水面海水の1対1の比率を調製し、実験室で維持されたろ過海水を調製します。最終的な容積はプランクトンサンプルの集中によって5から10リットルの間に調節されるべきである。準備したビーカーに慎重に500ミルサンプルを追加します。15 RPMで回転する同期モータに取り付けられたパドルを使用して、プランクトンを一晩サスペンションに保管してください。翌朝、目でオイコプレラの存在を確認してください。動物をペトリ皿に移し、正の識別のために倍率20〜40倍に設定された暗視野顕微鏡の下で観察する。オイコプレウラは、半透明の家の中で尾を起伏させるオタマジャクシ型の動物として特徴付けられる。O.dioicaを確認するには、黄色の生殖腺を持つ完全に成熟した男性や卵を持つメスを探してください。動物が未熟な場合は、尾の遠位半分に2つの脊索下細胞の存在を探します。これらは成熟した動物と未熟な動物の両方に存在する。種が確認されたら、新しいペトリ皿に移します。種レベルで10〜20個体が確認されるまで、このプロセスを繰り返します。O.dioicaが見つからない場合は、ビーカーを1日か2日かき混ぜておいてください。最初は観察できなかった小さなO.dioicaは成長し続け、見やすくなります。1 週間後に何も表示されない場合は、サンプルを破棄して、もう一度サンプリングを試みます。単一培養を確立するために、5リットルのろ過海水中のフィールドサンプルから120 O.dioicaを分離します。翌朝、黄色い生殖腺によって識別される完全に成熟した男性と、きらめく黄金の球体として現れる卵を持つメスを探します。5milの鈍いピペットを持つ15人の男性と30人のメスを、2.5リットルのろ過された海水を含むビーカーにそっと移すことによって、産卵ビーカーを準備します。手動移動中の物理的なストレスを最小限に抑えるために、新しい海水の表面の下で動物をゆっくりと放出する。孤立した大人が自然に産卵することを可能にする。産卵後、産卵ビーカーの底から5~10milの海水を抽出し、顕微鏡下で切断した卵子を同定することで、成功した受精を確認できる。産卵後の最初の朝、1日目には、膨らんだ家を持つ新世代の若い動物がビーカーに現れるはずです。500マイルのハンドヘルドビーカーを使用して、7.5リットルの新鮮なろ過された海水を含む新しいビーカーに動物を優しく移します。乱流とせん断力を最小限に抑えるために、表面の内容をゆっくりと注ぎます。産卵後の2日目の2日目の朝、150匹の動物を5リットルの新鮮なろ過海水を含む新しいビーカーに手動で移します。3日目の3日目の3日目には、120匹の動物を5リットルの新鮮なろ過された海水を持つ新しいビーカーに手動で移します。4日目までに、性的に成熟した、成虫の動物が存在するべきである。2.5リットルのろ過海水を含む新しい産卵ビーカーのために15人の男性と30人の女性を集めて、次世代を開始します。このプロセスは、文化の寿命のために繰り返され、維持されます。O.dioicaの単一培養を維持するために、アルガルフードは働く文化から毎日用意されています。動物は1日に3回餌を与えられる。660ナノメートルに設定された分光光度計を用いて、作業文化の吸光度を測定して、毎日の食品を準備します。吸光度値、目標O.dioica培養量、および動物成熟度は、以前に決定された藻類の成長曲線に基づいて準備されたスプレッドシートに配置され、その日の給餌に必要な藻類の正確な体積を計算する。計算された体積を50ミルチューブにピペットし、遠心分離機を室温で5分間5分間遠心分離します。ゆっくりと上清を注ぎ、慎重にピペットを上下にしてペレット藻類を再中断します。新鮮な、ろ過された海水で元のボリュームにチューブを補充します。スプレッドシートから毎日の藻類の供給チャートに基づいて、9 a.mで各ビーカーに指定された量を供給します。12 p.mおよび5 p.m。自動ドージングポンプは、5 p.mで動物に供給するように設定することができます。週末には、培養スタッフの存在なしに。各給餌後、次の飼料に使用する準備ができるまで、調製した藻類食品を摂氏4度に維持します。O.dioicaは100ミクロンのメッシュと非濾過タラの端を取り付けた修正されたプランクトンネットの穏やかな牽引によって港から集めることができる。2015年から19年の間のサンプリングは、沖縄の港でのO.dioicaの存在に季節変動を示した。水面海水の温度は動物の存在に影響を与えているように見えた。水面水温が28度以上のときに支配的なO.dioica。O.dioicaは24度から27度の温度でオイコプレウラロンギカウダと共存しました。しかし、O.ロンディカウダは23度以下の気温で支配しました。多量の変化はO.dioicaの豊富さとは一つの相関しなかった。安定したO.dioica培養システムを確立するための3つの最も重要な要因は、多段階ろ過システムで高い水質を維持し、理想的な供給体制を特定し、好ましくは藻類標準曲線を作成し、十分な数の男性と女性でビーカーを産卵する準備です。提供されたプロトコルに従って、O.dioicaのライフサイクルは23度で4日間です。私たちは、O.dioicaの6つの独立した集団を確実に確立し、そのすべてが20世代以上続きました。結論として、O.dioicaの安定した文化を確立することは、迅速かつ費用対効果の高い方法で行うことができます。適切なセットアップにより、1週間以内に安定した文化を実現できます。小さなゲノムと迅速なライフサイクルと組み合わせることで、O.dioicaは強力なチョルデートモデル種になります。O.dioicaは人工海水と天然海水の両方で維持することができます。藻類食品の長期保存は、固体培養および凍結保存を使用して可能である。さらに、O.dioica精子も凍結保存され、1年以上生存可能であり続けることができます。O.dioicaは、様々な生物分野に関する強力な洞察を提供し続けています。地域の季節性、細心の文化システム、そして少数の献身的な個人を理解することで、効果的な文化をほとんど努力して確立することができます。

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