Name: 2D-HELS MS Seq:異なるヌクレオチド修飾を持つRNA混合物の直接およびde novoシーケンシングのための一般的なLC-MSベースの方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: 学ぶLC-MSベースの直接RNAシーケンス法で、cDNA中間体を不要とし、修飾RNAを単塩基精度で同時検出できます。エピトランスクリプトミクス研究や疾患診断への応用が期待されます。

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<ol><li>Addepalli, B., Venus, S., Thakur, P., Limbach, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+ribonuclease+activity+of+cusativin+from+Cucumis+sativus+for+mapping+nucleoside+modifications+in+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel ribonuclease activity of cusativin from Cucumis sativus for mapping nucleoside modifications in RNA.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (24), 5645-5654 (2017).</li>
<li>Gao, H., Liu, Y., Rumley, M., Yuan, H., Mao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+confirmation+of+chemically+modified+RNAs+using+exonuclease+digestion+and+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Sequence confirmation of chemically modified RNAs using exonuclease digestion and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23 (21), 3423-3430 (2009).</li>
<li>McLuckey, S. A., Van Berkel, G. J., Glish, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+mass+spectrometry+of+small%2C+multiply+charged+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+The+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Tandem mass spectrometry of small, multiply charged oligonucleotides.</a> Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 3 (1), 60-70 (1992).</li>
<li>Fountain, K. J., Gilar, M., Gebler, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+native+and+chemically+modified+oligonucleotides+by+tandem+ion-pair+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography%2Felectrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Analysis of native and chemically modified oligonucleotides by tandem ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (7), 646-653 (2003).</li>
<li>Taucher, M., Breuker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+modified+RNA+by+top-down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+in+English%22%5BJournal%5D)">Characterization of modified RNA by top-down mass spectrometry.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 51 (45), 11289-11292 (2012).</li>
<li>Kellner, S., Burhenne, J., Helm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+RNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of RNA modifications.</a> RNA Biology. 7 (2), 237-247 (2010).</li>
<li>Thomas, B., Akoulitchev, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry of RNA.</a> Trends in Biochemical Sciences. 31 (3), 173-181 (2006).</li>
<li>Bjorkbom, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+direct+sequencing+of+noncanonical+RNA+by+two-dimensional+analysis+of+mass+chromatograms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Bidirectional direct sequencing of noncanonical RNA by two-dimensional analysis of mass chromatograms.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (45), 14430-14438 (2015).</li>
<li>Zhang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+LC-MS-based+RNA+sequencing+method+for+direct+analysis+of+multiple-base+modifications+in+RNA+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A general LC-MS-based RNA sequencing method for direct analysis of multiple-base modifications in RNA mixtures.</a> Nucleic Acids Research. 47 (20), 125(2019).</li>
<li>Zhang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+sequencing+of+tRNA+by+2D-HELS-AA+MS+Seq+reveals+its+different+isoforms+and+dynamic+base+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct sequencing of tRNA by 2D-HELS-AA MS Seq reveals its different isoforms and dynamic base modifications.</a> ACS Chemical Biology. 15 (6), 1464-1472 (2020).</li>
<li>Bakin, A., Ofengand, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+newly+located+pseudouridylate+residues+in+Escherichia+coli+23S+ribosomal+RNA+are+all+at+the+peptidyltransferase+center%3A+analysis+by+the+application+of+a+new+sequencing+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Four newly located pseudouridylate residues in Escherichia coli 23S ribosomal RNA are all at the peptidyltransferase center: analysis by the application of a new sequencing technique.</a> Biochemistry. 32 (37), 9754-9762 (1993).</li>
<li>Cantara, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+Modification+Database%2C+RNAMDB%3A+2011+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The RNA Modification Database, RNAMDB: 2011 update.</a> Nucleic Acids Research. 39 (Database issue), D195-D201 (2011).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>5' DNAのアデニル化のキット</td><td>ニューイングランドのBiolabs</td><td>E2610S</td><td>50uMの集中</td></tr><tr><td>6550 Q-TOFの質量分析計</td><td>Agilent Technologies</td><td>5991-2116EN</td><td>1290 Infinity LCシステム</td></tr><tr><td>A(5&acute;)に結合されてpp(5&acute;)Cp-TEG-ビオチン-3&acute;</td><td>ChemGenes</td><td>91718</td><td>HPLC精製</td></tr><tr><td>ATP&γ;S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11162306001</td><td>リチウム塩</td></tr><tr><td>Bicine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8660</td><td>BioXtra, &ge;99% (滴定)</td></tr><tr><td>ビオチン マレイミド</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-1501</td><td>ロングアーム</td></tr><tr><td>C18 カラム</td><td>Waters</td><td>186003532</td><td>50 mm &times; 2.1 mm Xbridge C18 カラム、粒子径 1.7 &mu;m</td></tr><tr><td>遠心真空濃縮器</td><td>Labconco</td><td>Refrig 115V/60Hz 7310022</td><td>Labconco CentriVap</td></tr><tr><td>ChemBioDraw</td><td>PerkinElmer</td><td>ChemDraw Prime</td><td>化学構造と特性データを生成する 構造とフラグメント</td></tr><tr><td>CMC (N-シクロヘキシル-N?-(2-モルフォリノエチル)-カルボジイミドメト-p-トルエンスルホン酸)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>2491-17-0</td><td>95% Purifiy</td></tr><tr><td>シアニン3 マレイミド (Cy3)</td><td>Lumiprobe</td><td>11080</td><td>水不溶</td></tr>性 <tr><td>DEPC処理水</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9906</td><td>オートクレーブ滅菌済み、ヌクレアーゼフリー認証</td></tr><tr><td>ジイソプロピルアミン(DIPA)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>108-18-9</td><td>99% Alfa Aesar</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>276855 無水ジメチルスルホキシド、99.9%</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>無水、結晶性、BioReagent、細胞培養に適した</td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>メルク</td><td>64-18-6</td><td>98-100%、ACS reag、Ph Eur</td></tr><tr><td>ヘキサフルオロ-2-プロパノール (HFIP)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>920-66-1</td><td>99% Acros Organics</td></tr><tr><td>LC-MS サンプルバイアル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C4000-11</td><td>プラスチックねじバイアル</td></tr><tr><td>LC-MS バイアルキャップ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C5000-54A</td><td>オートサンプラーバイアルねじキャップ</td></tr><tr><td>Na2CO3 buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>88975</td><td>BioUltra, >0.1 M Na2CO3, >0.2 M NaHCO3</sub</td></tr><tr><td>>Oligo Clean &コンセントレーター</td><td>Zymo Research</td><td>D4060</td><td>スピンカラム</td></tr><tr><td>OriginLab</td><td>OriginLab OriginPro</td><td></td><td>データ解析およびグラフ作成ソフトウェア</td></tr><tr><td>pCp-biotin</td><td>TriLink BioTechnologies</td><td>NU-1706-BIO</td><td>20 ul (1 mM)</td></tr><tr><td>RNA #1--#6</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>カスタム RNA オリゴ</td><td>19nt-21nt 一本鎖 RNA、さらなる精製なしで使用</td></tr><tr><td>ロッキングプラットホームシェーカー</td><td>VWR</td><td>オービタルシェーカー スタンダード 1000</td><td>速度範囲 40 〜 300 rpm</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン磁気ビーズ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>88816</td><td>結合 約 55ug ビオチン化ウサギ lgG ビーズのmgあたり</td></tr><tr><td>スルホン化シアニン3 マレイミド</td><td>Lumiprobe</td><td>11380</td><td>水溶性</td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ 1</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0202S</td><td>400 ユニット/uL</td></tr><tr><td>T4ポリヌクレオチドキナーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4PNK-RO</td><td>ファージ T4 am N81 pse T1 感染 大腸菌 BB</td></tr><tr><td>Tris-HCl バッファー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6455</td><td>Tris-HCl バッファー、pH 10、10 倍;、抗原レトリーバー</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81871</td><td>合成用尿素。CAS番号57-13-6、EC番号200-315-5。</td></tr></tbody></table>

2d-hels ms seq:異なるヌクレオチド修飾を持つrna混合物の直接およびde novoシーケンシングのための一般的なlc-msベースの方法

2D-HELS MS Seq: A General LC-MS-Based Method for Direct and de novo Sequencing of RNA Mixtures with Different Nucleotide Modifications

RNAの3'末端にビオチンタグを導入し、容易に識別できるmass-tRラダーを作製します。2D-HELS MS Seqアプローチのワークフローを図1aに示します。RNAの3'末端に導入された疎水性ビオチン標識(セクション2を参照)は、標識されていないラダー成分と比較して、3'標識ラダー成分の質量とtRsを増加させます。したがって、2D mass-tR プロットでは、3' ラダー曲線は y 軸の値が大きい値にシフトされ (tRs の増加による)、x 軸の値が大きい値にシフトします (質量の増加による)。図 1b は、2D-HELS MS Seq の 3'-末端へのビオチンタグの導入を含むサンプル調製プロトコルを示しています。図 1c は、RNA #1 の 3'-ビオチン標識 mass-tR ラダーフラグメントの t<su...

2D-HELS MS Seq:異なるヌクレオチド修飾を持つRNA混合物の直接およびde novoシーケンシングのための一般的なLC-MSベースの方法

Mass spectrometry (MS)-based sequencing approaches have been shown to be useful in&#160;direct&#160;sequencing&#160;RNA without the need for a ...

このプロトコルは、RNAサンプルが一本鎖、混合、または修飾されているかどうかに関係なく、RNAを直接シーケンシングするために開発された新しい方法を使用する際に必要なすべての重要なステップをカバーしています。この方法は、酵素エラーや塩基相補性の影響を受けません。これは、一度に1つの特定の修飾ではなく、異なるRNA修飾を同時に配列決定することを可能にする直接的なワークフローと一般的なソリューションを提供します。この技術は、シグネチャーRNAセグメントを決定してヒトの疾患に関連付ける診断ツールや、エピトランスクリプトームレベルでのRNA修飾を研究するための正確なツールに発展させることができます。この方法は、以前のシーケンシング法に依存しません。むしろ、これはまったく新しいアプローチであり、あらゆる修飾RNAのシーケンシングに有効な方法にすることを目指している。このプロトコールの一部には、RNA LC-MSデータ取得の3'末端のラベリングやMassHunterソフトウェアによるデータ解析など、視覚的なデモンストレーションによってより正確に伝えることができる重要な側面が含まれています。この手順を実演し、LC-MS をセットアップして RNA サンプルを測定します。ワンステップ標識反応を行うには、2マイクロリットルの150マイクロモルAppCp-ビオチン、3マイクロリットルの10xリガーゼ反応バッファー、1.5マイクロリットルの100マイクロモルRNAサンプル、3マイクロリットルの無水DMSO、10ユニットのT4 RNAリガーゼ、および19.5マイクロリットルのDEPC処理水を組み合わせて、総容量30マイクロリットルにします。反応液を摂氏16度で一晩インキュベートし、原稿の指示に従ってカラム精製を行います。RNAを3つのアリコートに分割し、等量のギ酸を加えた後、反応を摂氏40度でインキュベートします。各反応が終了したら、すぐにサンプルをドライアイスで凍結して酸分解を急冷します。遠心真空濃縮器を使用して、サンプルを約30分間乾燥させます。乾燥したサンプルを20マイクロリットルのDEPC処理水に再懸濁し、それらを混合します。LC-MS測定までサンプルを摂氏20度で保存します。移動相を調製した後、RNAサンプルをLC-MSサンプルバイアルに移します。各注射には、100〜400ピコモルのRNAと20マイクロリットルが含まれている必要があります。.データを取得した後、分子特徴抽出ワークフローを使用して、質量、保持時間、容量、品質スコアなどの化合物情報を抽出します。低分子の設定では、重心データ形式を使用します。ピークの高さを100以上1, 000未満に設定し、品質スコアを50以上に設定します。最後に、データをExcelファイルとしてエクスポートします。5'ラダーおよびその他の望ましくないフラグメントからの3'ラダーの分離は、ここでは2D質量保持時間プロットに示されています。また、長さの異なる2本のRNA鎖を含む混合サンプルを、各RNAに5'ビオチン標識でシーケンシングすることも可能です。ウリジンとシュードウリジンを区別するために、RNAをCMCで処理し、シュードウリジンをCMC-シュードウリジン付加物に変換します。付加物はウリジン中で異なる質量を持ち、2D-HELS MS Seqで区別することができます。シュードウリジンをCMC付加物に変換する反応の粗生成物のHPLCプロファイルを使用して、5つの異なるRNA鎖の混合物である42%Aの変換率を計算し、3'末端標識による2D-HELS MS Seqアプローチによって配列決定され、複数のRNA配列のより良い視覚化のために正規化されました。正規化を行わなければ、5つのRNAの配列の文字コードは密集してしまいます。この手順を試行する際には、標識反応を慎重にセットアップして、標識RNAサンプルを高収率で取得してください。また、分解時間を注意深く監視して、信頼性の高いマスラダーを作成し、20マイクロリットルの水で最大量の乾燥サンプルを収集します。このプロトコルを実行した後に問われる可能性のある問題は、シーケンシング法の幅、長さ、およびスループットをどのように増やすかです。より優れたアルゴリズムと、より高い分解能と感度を備えたより高度な機器が役立ちます。このプロトコルの開発後、CDAベースのRNAシーケンシングに関連するエラーなしに、標準ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドの両方を含むより広範なRNAサンプルを直接シーケンシングすることが可能になりました。

2d-hels-ms-seq-general-lc-ms-based-method-for-direct-de-novo

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

MicroRNA(miRNA)は、広く保存された調節分子のクラスです。ここでは、2つの強力なライゲーションステップとそれに続くハイスループットシーケンシングに依存するmiRNAクローニング法について説明します。私たちの方法は、miRNAの正確なゲノムワイド定量を可能にします。...

ハイスループットシークエンシングによりマイクロRNA定量のための低分子RNA分子の高効率ライゲーション

インデックス化されたcDNAライブラリの調製、カスタムプローブによるハイブリダイゼーションとキャプチャ、および遺伝子発現、突然変異、および遺伝子融合のための選択された転写物を調べるためのデータ解析を含む、標的RNAシーケンシングベースの方法について説明します。Targeted...

遺伝子発現およびゲノム変化を特徴づけるために、RNAシーケンシングアッセイをターゲットに

RNA 結合蛋白質を識別し、紫外線による光架橋と質量分析法を用いた生細胞におけるその RNA...

質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

このプロトコルでは、マッピング mRNA 3'...

3' 末端配列 A seq2 とライブラリの準備

我々は、標準的な方法よりもバイアスが少ない詳細な小さなRNAライブラリー修復プロトコルと2'-O-メチルRNAの感度の増加を提示する。このプロトコルは、コストを節約するために自家製試薬を使用するか、便宜上キットを使用して従うことができます。...

小型RNA-seqの改善:バイアスの減少と2'-O-メチルRNAの検出の改善

13C/15N標識および非標識RNA上のマイクロミリ秒のダイナミクスを測定するプロトコルを、1H...

RNAの1H R1ρ緩和分散実験のサンプル調製とセットアップの実態

RNAの転写後修飾は、最近中枢神経系の可塑性に関連している翻訳調節の未研究の層を表す。ここで、試料調製および液体クロマトグラフィータンデム質量分析アプローチは、単一のニューロンにおける多数のRNA修飾の同時特性評価のために説明される。...

質量分析法を用いた単一ニューロンにおけるRNA修飾の特性評価

このプロトコルは、突然変異プロファイリング実験のために硫酸ジメチルでRNAを修飾するための指示を提供します。これには、2つの代替ライブラリ調製方法を使用したin vitro および in vivo...

硫酸ジメチルによるRNA構造のプロービング in vitro および細胞内でのシーケンシングによる突然変異プロファイリング(英語)

Absolute quantification RNA Sequencing (AQRNA-seq) は、生物学的混合物中のすべての低分子 RNA の状況を定量するために開発された技術です。ここでは、AQRNA-seqのライブラリー調製とデータ処理の両方のステップを実証し、飢餓誘発性休眠中の Mycobacterium bovis...

低分子RNAの定量のためのAQRNA-seq

このプロトコルは、初心者のバイオインフォマティシャンのための比較de novoトランスクリプトームアセンブリとアノテーションワークフローの概要を示しています。このワークフローは、CyVerse...

CyVerseリソースの活用<em&gt;デ・ノヴォ</em&gt;保存されていない（非モデル）生物の比較トランスクリプトーム

学ぶLC-MSベースの直接RNAシーケンス法で、cDNA中間体を不要とし、修飾RNAを単塩基精度で同時検出できます。エピトランスクリプトミクス研究や疾患診断への応用が期待されます。

2D-HELS MS Seq:異なるヌクレオチド修飾を持つRNA混合物の直接およびde novoシーケンシングのための一般的なLC-MSベースの方法

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