海馬の腹側テグメンタル領域グルタミン酸末端のインビボ解剖学的および機能的なトレース

現在のプロトコルは、in vivo での神経回路の神経解剖学的および電気生理学的トレースを組み合わせるための手頃な価格で簡単な方法を分析します。この技術により、特定のニューロン集団から標的部位への補助末端のマッピングが可能になります。同様に、これらの終末の解剖学的マップは、標的部位での細胞外記録中の光遺伝学的刺激によって検証できます。

このプロトコルは、感覚機能、運動機能、認知機能に関連する複数の神経回路の研究に適用できます。この手順を実行するには、げっ歯類の定位固定手術と繊細な神経電極の取り扱いに関するある程度の知識が必要です。録音中のノイズを防ぐための録音システム接続。

視覚的なデモンストレーションでは、in vivoオプトジェネティクス用の手頃な価格のLEDシステムをセットアップするための基本的な手順に焦点を当てています。また、アンプをLEDドライバーに接続して、麻酔をかけたマウスで記録と刺激を同期させる方法も示しています。マウスの本体が定位固定装置フレームに横たわるように加熱パッドを置き、手術中ずっと体温を維持するのに役立ち、頭を脳定位固定装置に優しく固定します。

手術部位は、まずヨウ素溶液で洗浄し、次にアルコールで洗浄してヨウ素を除去して準備します。次に、頭皮の感覚をブロックするために局所リドカインを塗布します。次に、メスを使用して、前頭部から後頭部まで伸びる正中線を切開します。

腹側被蓋領域またはVTA注射の場合、超微細鈍いポイントニードルシリンジを、ブレグマに対して前方3.08ミリメートル後方および内側0.5ミリメートルの負の横方向座標に配置します。.穴あけ工具を使用して、マークされた座標で頭蓋骨に1ミリメートルの穴を開けます。製造元の指示に従って、シリンジホルダーをマイクロマニピュレーターに固定し、シリンジに二重蒸留水を入れて、液体の流れを洗浄およびテストします。

次に、シリンジの流れをテストするために水を分配します。アデノ随伴ウイルスまたはAAVカクテルのアリコートを氷の上で解凍します。取り付けられたシリンジに 1, 000 ナノリットルの AAV 溶液を充填し、10 ナノリットルの溶液を分注して液体の流れを確認します。

マイクロマニピュレーターを使用して針を注射部位まで下げ、600〜800ナノリットルのAAVをVTAに注入し、毎分60ナノリットルで溶液を送達します。AAV注射の3週間後、前述のように動物の頭部を定位フレームに固定し、開頭術を行って硬膜を露出させます。穴あけツールを使用して、頭頂骨の一部を取り除きます。

解剖顕微鏡下で、曲がった27ゲージの針先を使用して露出した硬膜を切除し、この領域の繊細な剥離カバーと皮質組織を引き離さないように注意します。人工脳脊髄液を開頭術領域に滴下して、乾燥を防ぎます。後頭骨に穴を開けてアースネジを保持し、ステンレス製のアース線を接続します。

カニューレを下げる前に、光ファイバーケーブルをファイバー結合LEDソースに接続してください。直径 400 マイクロメートルの光ファイバーを AP 負 3.08 ミリメートルと ML 0.5 ミリメートルの座標で VTA に下げます。マイクロマニピュレータを使用して、CA1の錐体細胞層に電極接触部位を配置します。

光パルスをニューラル記録と同期させるには、LED ドライバーと録音コントローラーのデジタル インポートを BNC スプリッターを備えたトランジスタ トランジスタ ロジック パルサーに接続します。ノブを調整して、光電アーチファクトを発生せずに応答を生成できる有効強度を決定し、頭蓋骨の地面をアダプターの地面に接続します。プレを接続しますampシリアル周辺機器インターフェースケーブルを介して録音コントローラーにヘッドステージを録音し、録音コントローラーポートのLEDカラーライトを確認します。

緑と黄色のLEDは適切なボリュームを示しますtag接続された上の amplifierボード、赤いLEDは動作しているソフトウェアヘッドステージ制御を示します。ソフトウェアを起動したら、データファイル形式を選択し、ファイル名を変更してください。接続されたヘッドステージのポートに切り替え、電極のチャネルがヘッドステージよりも少ない場合は、[ポートですべて無効にする]をクリックします。

画面に表示するチャンネル数を適宜選択します。同期されたニューラルレコーディングとライトパルストリガータイムスタンプのTTLタイムスタンプをキャプチャするには、デジタルインポートをクリックして、ゼロワンでデジタルを有効にします。これは、アンプのデジタルインポートのBNC接続に対応している必要があります。

適切な波形表示のためにタイムスケールと電圧スケールを調整し、サンプリングレートを選択しますが、サンプリングレートとチャンネル数が多いとファイルサイズが大きくなることに注意してください。次に、シングルユニット録音用のアンプ帯域幅を設定します。ここでは、300〜5,000ヘルツのカットオフ周波数が使用されました。

スパイクサウンドの場合は、アナログ出力オーディオをクリックし、アナログポートを有効にします。次に、ゲインとサイレンサーを調整して、最適なサウンドを実現します。アンプの記録と光パルス列を同期させるには、ディスプレイタブをクリックして、マーカーの表示を有効にします。

BNC接続に対応する適切なチャネルに切り替え、ポートを再検査して、録音チャネルとデジタル入力チャネルがニューラルスパイクとライトパルスタイムスタンプをキャプチャできることを確認します。スパイク・オシロスコープをクリックすると、連続的に記録されたスパイク・トレインを構成する波形が表示されます。マウスを使用して、表示する波形のしきい値を設定します。

次に、RMSを検査して、録音のノイズレベルを判断します。アデノ随伴ウイルスの発現は、注射後21日でマウスの腹側被蓋領域におけるEYFPの免疫蛍光イメージングによって検証されました。蛍光イメージングは、海馬層DG、CA3、およびCA1のシナプス前VTAグルタミン酸突起を検出するためにも使用されました。

細胞外電圧活動が検出されると、ベースライン活動を約10分間記録した後、目的の周波数で光パルスをトリガーしました。これにより、VTAグルタミン酸光刺激の前後でCA1推定ニューロンの発火率またはバースト速度を比較することが可能になりました。この結果を裏付けるために、光刺激の前後のCA1ネットワークの発火率を統計的に比較したところ、刺激後の期間で有意な増加が明らかになりました。

その後、バーストを検出するためのラスタートレインの解析では、光刺激後のCA1推定錐体ニューロンのバースト率の増加が示されました。光シミュレーションへの応答は、刺激部位でのAAVレポーター発現の蛍光によって同定されました。また、の説明は、応答性推定単位の記録部位と関連付けられるべきです。

この方法は、行動課題を引き受ける覚醒マウスでも実行できます。この場合、慢性埋め込み型プローブと光ファイバーカニューレを使用する必要があります。この技術により、標的部位のシナプス前末端分布とシナプス前末端の調節を組み合わせて神経回路を頑健に追跡し、in vivoで標的部位の応答を検出することができます。