Name: 海馬の腹側テグメンタル領域グルタミン酸末端のインビボ解剖学的および機能的なトレース (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 学ぶ海馬への腹側テグメンタル領域グルタミン酸投射のインビボ解剖学的・機能的トレース法。光刺激と電気生理学的記録を用いて、VTAグルタミン酸末端がCA1錐体細胞の発火率を調節するメカニズムを解明します。

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この作品は、OOMに授与されたCBSブリッジンググラントによって資金提供されています。OOM、PAA、およびASは、研究を設計し、実験を行いました。ASとPAAは結果を分析した。OOMとPAAは原稿を準備しました。AAVを利用できるようにしてくれたカール・ディスセロス博士(スタンフォード大学)に感謝します。

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<li>Zingg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+anterograde+transsynaptic+tagging%3A+mapping+corticocollicular+input-defined+neural+pathways+for+defense+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocollicular input-defined neural pathways for defense behaviors.</a> Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).</li>
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<li>Ahlgrim, N. S., Manns, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+Stimulation+of+the+Basolateral+Amygdala+Increased+Theta-Modulated+Gamma+Oscillations+in+the+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optogenetic Stimulation of the Basolateral Amygdala Increased Theta-Modulated Gamma Oscillations in the Hippocampus.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 87(2019).</li>
<li>Buzsaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+probing+local+circuits%3A+high-density+silicon+probes+combined+with+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Tools for probing local circuits: high-density silicon probes combined with optogenetics.</a> Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).</li>
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<li>Luo, A. H., Tahsili-Fahadan, P., Wise, R. A., Lupica, C. R., Aston-Jones, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+context+with+reward%3A+a+functional+circuit+from+hippocampal+CA3+to+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Linking context with reward: a functional circuit from hippocampal CA3 to ventral tegmental area.</a> Science. 333 (6040), 353-357 (2011).</li>
<li>McNamara, C. G., Dupret, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+sources+of+dopamine+for+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Two sources of dopamine for the hippocampus.</a> Trends in Neurosciences. 40 (7), 383-384 (2017).</li>
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<li>Cardin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nature Protocols. 5 (2), 247-254 (2010).</li>
<li>Mei, Y., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tools+and+approaches+for+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Molecular tools and approaches for optogenetics.</a> Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).</li>
<li>Zingg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-Mediated+Anterograde+Transsynaptic+Tagging%3A+Mapping+Corticocollicular+Input-Defined+Neural+Pathways+for+Defense+Behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors.</a> Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbial+opsin+family+of+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The microbial opsin family of optogenetic tools.</a> Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).</li>
<li>Aravanis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+neural+interface%3A+in+vivo+control+of+rodent+motor+cortex+with+integrated+fiberoptic+and+optogenetic+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology.</a> Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).</li>
<li>Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Two-photon optogenetics.</a> Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

過去10年間で、AAV構造の設計は大幅に進歩しました。このように、より多くのニューロン特異的プロモーターが、改善されたトランスフェクション特異性14のためのAAV血清型の配列に組み込まれている。蛍光タンパク質、トランスポーター、受容体、イオンチャネルの遺伝子を組み合わせることで、イメージング、神経変調、シナプス活性検出用のAAVライブラリが存在するようになりました。市販のAAV構築物において、遺伝的にコードされたフルオロフォアとイオンチャネル(オプシン)の組み合わせは、神経回路14、18、19の神経解剖学的および電気生理学的トレースを組み合わせることができる。同様に、プロモーター(またはcre-lox再結合法)の選択は、回路内のニューロン型特異的突起のトレースを可能にすることができる。現在の研究では、このプロトコルは、海馬(CA1領域)へのVTAグルタミン酸神経投影の解剖学的および電気生...

過去10年間で、ニューロン型変調の特異性を高めるための遺伝的ツールの配列が開発され、複雑なニューラルネットワーク1のマッピングが行われました。特に、神経細胞に感染し、複製する固有の能力を持つ神経刺激性ウイルスは、ニューロンサブタイプの特定のタンパク質を発現またはアブレートするために展開されています。蛍光タンパク質または遺伝的にコードされたシナプス活性指標を収容する場合、トランスフェクトされたAAVベクターは脳領域を横切るニューラルネットワークを標識および線引きする2,3。AAV構築物におけるプロモーターの選択は、ある程度の特異性(プロモーター依存性発現)を有するニューロン型におけるベクターの発現を指示する。しかし、Cre-loxの組換えを通じて、AAV構築物は、ニューロン標識4、5、6、7に対するより大きな特異性で展開される。注目すべきは、AAVベクターにパッケージ化された光活性化された微生物オプシンおよび蛍光タンパク質は、各種ニューロンサブタイプ8で発現することができ、かつ、イメージング、ニューロン型回路トレース、および光変調9,10に最適である。
AAVは、脳領域(または核)に立体的に注入され、ソーマ、樹状突起、軸索末端におけるレポータータンパク質の発現を駆動する。レポーター遺伝子(eYFP)を収容するAAVの神経発現は、ニューロン細胞体の標識化を促進し、他の脳領域11、12、13、14との間の突起の細胞細胞体および解剖学的トレースを促進する。光制御されたオプシン(例えば、hChR2)を担うAAV-eYFP構築物は、ビボ16における脳領域を標的とする神経投影の画像6、15および刺激ベースの生理学的トレース用のツールとして展開することができる。AAV血清型に応じて、ニューロン標識の方向は、前向きまたは逆行性11、12であってもよい。これまでの研究では、AAV5がニューロン12で前向きに移動することを確立しています。このように、hChR2を発現する細胞体の光刺激は、脳内の他の場所でシナプス前効果を生じる(標的)17。
ここで、AAV(血清型5)を用いて、CaMKIIαプロモーターを用いて、VTAグルタミン酸ニューロンおよび軸索突起においてeYFP(レポーター)およびhChR2(オプシン)を発現させた。この研究の結果は、CA1、CA3、およびDG海馬領域におけるVTA-グルタミン酸シナプス前末端の層依存分布を示す。また、VTAグルタミン酸ニューロンの光刺激は、ベースライン値と比較した場合に、生体内でのCA1マルチユニットおよび単一ユニットの発火率を増加させた。このプロトコルは、ニューラル回路トレース実験から得られるデータの品質を向上させることができる、手頃な価格のツールと市販のソフトウェアを利用しています。

<table><tbody><tr><td>3% 過酸化水素</td><td>フィッシャー化学</td><td>H312</td><td></td></tr><tr><td>AAV-CaMKII&alpha;-ChR2-eGYP</td><td>Addgene</td><td>プラスミド #26969</td><td></td></tr><tr><td>BNC ケーブル</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BNC スプリッター</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>セラミック スプリット メイティング スリーブ &Oslash;1.25mmフェルール。</td><td>Thorlabs</td><td>ADAL1-5</td><td></td></tr><tr><td>ドリル</td><td>ドレメル</td><td>LR 39098</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチンコーティングスライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>OBSLD01CS</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトンの注射器 (Neuros)</td><td>WPI Inc.</td><td>06H</td><td></td></tr><tr><td>ヘッド ステージ アダプター</td><td>ニューロネクサス</td><td>Adpt-Q4-OM32</td><td></td></tr><tr><td>高インピーダンス シリコン プローブ</td><td>ニューロネクサス</td><td>Q1x1-tet-5mm-121-CQ4</td><td></td></tr><tr><td>INTAN 512ch レコーディング コントローラー</td><td>INTAN</td><td>RHD2000</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ素溶液</td><td>Dynarex</td><td>1425</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ピラマル</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>スペクトラム</td><td>K1068</td><td></td></tr><tr><td>LEDドライバー</td><td>Thorlabs</td><td>LEDD1B</td><td></td></tr><tr><td>LED光源(470 nm)-青色光</td><td>Thorlabs</td><td>M470F3</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>成重</td><td>M0-203</td><td></td></tr><tr><td>光ファイバー</td><td>Thorlabs</td><td>CFMLC14L05</td><td></td></tr><tr><td>なべ頭フィリップスネジ (M0.6 X 2mm)</td><td>Amazon</td><td>M0.6 X 2mm</td><td></td></tr><tr><td>プリアンプヘッドステージ(32チャンネル)</td><td>INTAN</td><td>C3314</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic frame</td><td>Kopf</td><td>1530</td><td></td></tr><tr><td>TTL pulser</td><td>Prizmatix</td><td>4031</td><td></td></tr><tr><td>Urethane</td><td>Sigma</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61430</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Company</td><td>バージョン</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad プリズム</td><td>GraphPad</td><td>ソフトウェア バージョン 8</td><td></td></tr><tr><td>Intan レコーディング コントローラー</td><td>Intantech</td><td>バージョン 2.07</td><td></td></tr><tr><td>Neuroexplorer</td><td>Nex Technologies</td><td>バージョン 5.215</td><td></td></tr><tr><td>Plexon オフライン スパイク ソーター</td><td>Plexon Inc</td><td>バージョン 4.5</td><td></td></tr><tr><td>ACSF 構成:</</td> ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 23, 3 KCl, 1.25 NaH2</>sub<sub<>>sub, 1 MgCl2</sub, 1 MgClsub2/sub>>,<><><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 CaCl<サブ>2</サブ>および25グルコース)。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

海馬の腹側テグメンタル領域グルタミン酸末端のインビボ解剖学的および機能的なトレース

Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus

脳内のニューロン亜集団の光遺伝学的調節は、研究者が生体内およびex vivoで神経回路を解剖することを可能にした。これは、神経回路内のニューロンタイプの役割と、学習に対する情報符号化におけるその重要性を決定するための前提となる。同様に、この方法は、目覚めおよび麻酔動物における2つ以上の接続された脳領域の生理学的意義を試験するために使用することができる。現在の研究は、VTAグルタミン酸ニューロンが麻酔をかけマウスのCA1(海馬)における推定ピラミッド型ニューロンの発火率をどのように調節するかを示している。このプロトコルは、海馬の層内のVTAシナプス前グルタミン酸末端のトレースのためのVTAグルタミン酸ニューロンのアデノ関連ウイルス(AAV)依存的標識を採用する。AAVベクターに収容された光制御オプシン(チャネロドプシン;hChR2)および蛍光タンパク質(eYFP)の発現は、VTAグルタミン酸末端の前向きのトレースを許可し、VTAグルタミン酸ニューロン細胞体(VTA)の光刺激を認めた。高インピーダンスの急性シリコン電極をCA1に配置し、生体内でのVTA光刺激に対するマルチユニットおよび単一ユニットの応答を検出した。この研究の結果は、海馬(CA1、CA3、およびDG)におけるシナプス前VTAグルタミン酸末端の層依存分布を示す。また、VTAグルタミン酸ニューロンの光刺激は、生体内の推定CA1錐体単位の発火およびバースト速度を増加させた。

順次トレース
AAV発現は、注射後21日目のC57BL/6マウスのVTAにおけるレポータータンパク質(eYFP)の免疫蛍光イメージング(eYFP)によって検証された(図2)。海馬におけるシナプス前VTAグルタミン酸突起の前向き標識化に成功したDG、CA3、CA1の層におけるeYFP検出によっても検証された(図6a–d;ムービー 2 と 3.
海馬調節CA1活性へのVTAグルタミン酸予測
VTAグルタミン酸ニューロンの光刺激は、推定錐型CA1ニューロンの活性を増加させた。これは、ライトオフフェーズ(図5a–b)と比較した場合、ライトオンフェーズ(M...

現在のプロトコルは、海馬への腹側テグメンタル領域(VTA)グルタミン酸突起をトレースするための簡単な方法を示しています。VTAグルタミン酸ニューロンの光刺激をCA1記録と組み合わせて、VTAグルタミン酸末端が生体内での推定ピラミッド発火率を調節する方法を示した。

Optogenetic modulation of neuron sub-populations in the brain has allowed researchers to dissect neural circuits in vivo and ex vivo. This provides a ...

現在のプロトコルは、in vivo での神経回路の神経解剖学的および電気生理学的トレースを組み合わせるための手頃な価格で簡単な方法を分析します。この技術により、特定のニューロン集団から標的部位への補助末端のマッピングが可能になります。同様に、これらの終末の解剖学的マップは、標的部位での細胞外記録中の光遺伝学的刺激によって検証できます。このプロトコルは、感覚機能、運動機能、認知機能に関連する複数の神経回路の研究に適用できます。この手順を実行するには、げっ歯類の定位固定手術と繊細な神経電極の取り扱いに関するある程度の知識が必要です。録音中のノイズを防ぐための録音システム接続。視覚的なデモンストレーションでは、in vivoオプトジェネティクス用の手頃な価格のLEDシステムをセットアップするための基本的な手順に焦点を当てています。また、アンプをLEDドライバーに接続して、麻酔をかけたマウスで記録と刺激を同期させる方法も示しています。マウスの本体が定位固定装置フレームに横たわるように加熱パッドを置き、手術中ずっと体温を維持するのに役立ち、頭を脳定位固定装置に優しく固定します。手術部位は、まずヨウ素溶液で洗浄し、次にアルコールで洗浄してヨウ素を除去して準備します。次に、頭皮の感覚をブロックするために局所リドカインを塗布します。次に、メスを使用して、前頭部から後頭部まで伸びる正中線を切開します。腹側被蓋領域またはVTA注射の場合、超微細鈍いポイントニードルシリンジを、ブレグマに対して前方3.08ミリメートル後方および内側0.5ミリメートルの負の横方向座標に配置します。.穴あけ工具を使用して、マークされた座標で頭蓋骨に1ミリメートルの穴を開けます。製造元の指示に従って、シリンジホルダーをマイクロマニピュレーターに固定し、シリンジに二重蒸留水を入れて、液体の流れを洗浄およびテストします。次に、シリンジの流れをテストするために水を分配します。アデノ随伴ウイルスまたはAAVカクテルのアリコートを氷の上で解凍します。取り付けられたシリンジに 1, 000 ナノリットルの AAV 溶液を充填し、10 ナノリットルの溶液を分注して液体の流れを確認します。マイクロマニピュレーターを使用して針を注射部位まで下げ、600〜800ナノリットルのAAVをVTAに注入し、毎分60ナノリットルで溶液を送達します。AAV注射の3週間後、前述のように動物の頭部を定位フレームに固定し、開頭術を行って硬膜を露出させます。穴あけツールを使用して、頭頂骨の一部を取り除きます。解剖顕微鏡下で、曲がった27ゲージの針先を使用して露出した硬膜を切除し、この領域の繊細な剥離カバーと皮質組織を引き離さないように注意します。人工脳脊髄液を開頭術領域に滴下して、乾燥を防ぎます。後頭骨に穴を開けてアースネジを保持し、ステンレス製のアース線を接続します。カニューレを下げる前に、光ファイバーケーブルをファイバー結合LEDソースに接続してください。直径 400 マイクロメートルの光ファイバーを AP 負 3.08 ミリメートルと ML 0.5 ミリメートルの座標で VTA に下げます。マイクロマニピュレータを使用して、CA1の錐体細胞層に電極接触部位を配置します。光パルスをニューラル記録と同期させるには、LED ドライバーと録音コントローラーのデジタル インポートを BNC スプリッターを備えたトランジスタ トランジスタ ロジック パルサーに接続します。ノブを調整して、光電アーチファクトを発生せずに応答を生成できる有効強度を決定し、頭蓋骨の地面をアダプターの地面に接続します。プレを接続しますampシリアル周辺機器インターフェースケーブルを介して録音コントローラーにヘッドステージを録音し、録音コントローラーポートのLEDカラーライトを確認します。緑と黄色のLEDは適切なボリュームを示しますtag接続された上の amplifierボード、赤いLEDは動作しているソフトウェアヘッドステージ制御を示します。ソフトウェアを起動したら、データファイル形式を選択し、ファイル名を変更してください。接続されたヘッドステージのポートに切り替え、電極のチャネルがヘッドステージよりも少ない場合は、[ポートですべて無効にする]をクリックします。画面に表示するチャンネル数を適宜選択します。同期されたニューラルレコーディングとライトパルストリガータイムスタンプのTTLタイムスタンプをキャプチャするには、デジタルインポートをクリックして、ゼロワンでデジタルを有効にします。これは、アンプのデジタルインポートのBNC接続に対応している必要があります。適切な波形表示のためにタイムスケールと電圧スケールを調整し、サンプリングレートを選択しますが、サンプリングレートとチャンネル数が多いとファイルサイズが大きくなることに注意してください。次に、シングルユニット録音用のアンプ帯域幅を設定します。ここでは、300〜5,000ヘルツのカットオフ周波数が使用されました。スパイクサウンドの場合は、アナログ出力オーディオをクリックし、アナログポートを有効にします。次に、ゲインとサイレンサーを調整して、最適なサウンドを実現します。アンプの記録と光パルス列を同期させるには、ディスプレイタブをクリックして、マーカーの表示を有効にします。BNC接続に対応する適切なチャネルに切り替え、ポートを再検査して、録音チャネルとデジタル入力チャネルがニューラルスパイクとライトパルスタイムスタンプをキャプチャできることを確認します。スパイク・オシロスコープをクリックすると、連続的に記録されたスパイク・トレインを構成する波形が表示されます。マウスを使用して、表示する波形のしきい値を設定します。次に、RMSを検査して、録音のノイズレベルを判断します。アデノ随伴ウイルスの発現は、注射後21日でマウスの腹側被蓋領域におけるEYFPの免疫蛍光イメージングによって検証されました。蛍光イメージングは、海馬層DG、CA3、およびCA1のシナプス前VTAグルタミン酸突起を検出するためにも使用されました。細胞外電圧活動が検出されると、ベースライン活動を約10分間記録した後、目的の周波数で光パルスをトリガーしました。これにより、VTAグルタミン酸光刺激の前後でCA1推定ニューロンの発火率またはバースト速度を比較することが可能になりました。この結果を裏付けるために、光刺激の前後のCA1ネットワークの発火率を統計的に比較したところ、刺激後の期間で有意な増加が明らかになりました。その後、バーストを検出するためのラスタートレインの解析では、光刺激後のCA1推定錐体ニューロンのバースト率の増加が示されました。光シミュレーションへの応答は、刺激部位でのAAVレポーター発現の蛍光によって同定されました。また、の説明は、応答性推定単位の記録部位と関連付けられるべきです。この方法は、行動課題を引き受ける覚醒マウスでも実行できます。この場合、慢性埋め込み型プローブと光ファイバーカニューレを使用する必要があります。この技術により、標的部位のシナプス前末端分布とシナプス前末端の調節を組み合わせて神経回路を頑健に追跡し、in vivoで標的部位の応答を検出することができます。

combined-vivo-anatomical-functional-tracing-ventral-tegmental-area

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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