Name: 大腸癌細胞の3次元スフェロイド培養におけるプロバイオティクスの細胞遊離上清を用いた細胞死の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: 学ぶ Lactobacillus細胞遊離上清を用いた大腸癌スフェロイドの細胞死誘導評価法。3次元培養技術とシグナル伝達解析により、抗腫瘍効果を詳細に検証する革新的アプローチを習得できます。

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本研究は、韓国規格研究所が出資する「化学・放射線測定基準の確立」、助成番号KRISS-2020-GP2020-0003、「生物材料と医療収束のための測定基準と技術の開発」によって支援されました。また、科学・ICT省、韓国国立研究財団(NRF-2019M3A9F3065868)、厚生省(MOHW)、韓国保健産業開発研究所(KHIDI、HI20C0558)、貿易産業エネルギー省(MOTIE)、韓国工業技術研究所(KEIT)、韓国評価研究所20009350も支援しました。ORCID ID(ヒーミンユー:0000-0002-5951-2137;ドゥッジンカン:0000-0002-5924-9674;Seilキム: 0000-0003-3465-7118;ジュウン・リー: 0000-0002-2495-1439;ジナ・リー:0000-0002-3661-3701)。チャン・ウー・パークの実験支援に感謝します。

1. 細菌細胞培養と ラクトバチルス 細胞フリー上清(LCFS)の調製
注:ステップ1.2 - 1.9は嫌気性の部屋で行われます。
<ol><li>L-システインを含むMRS寒天プレートとブロスを準備し、オートクレーブで殺菌します。</li>
	<li>20 ppm酸素で37 °Cで維持されたH2 嫌気性チャンバーにMRS寒天プレートをプレインキュベートします。</li>
	<li>乳酸菌の細菌ストックを解凍し、細菌培養物で寒天板を接種する(図1A(i))。 </li>
	<li>細菌を37°CでH2 嫌気室で2~3日間培養し、単一の細菌コロニーが得られるまで20ppmの酸素をインキュベートする。</li>
	<li>ハンガト型の無神経培養チューブを洗浄し、乾燥させます。121°Cで15分間培養管をオートクレーブします。</li>
	<li>その後、37°CでH2 嫌気性チャンバーにチューブをインキュベートし、酸素を除去するために20ppmの酸素を除去します。</li>
	<li>MRSスープの2〜3mLをチューブに入れる。ブチルゴム栓でチューブを密封し、キャップをねじ込みます。</li>
	<li>ループを持つ単一コロニーを取得し、1x PBSの500 μLで1.5 mL培養チューブに入れ.(図1A(ii) )</li>
	<li>1 mL シリンジを使用してコロニーを中断します (図 1A (iii))。これを行うには、チューブ蓋の中央に1mLシリンジの針を挿入し、浮遊コロニーを吸引し、それをMRSブロス培地に再懸濁させる。(図1A(iv))</li>
	<li>MRSブロス培地を2日間(37°C、5%CO2、200rpm)のシェーカーインキュベーターでインキュベートします。</li>
	<li>分光光度計を使用して光学密度(OD)を測定し、OD620 の吸光度が2.0に達するまで細菌の成長曲線を監視します。</li>
	<li>15分間1,000 x g で遠心分離して、細菌ペレットと調整された培地を分離します。1x PBSで採取した細菌ペレットを洗浄し、10%の胎児ウシ血清を補充したRPMI 1640の4mLで再懸濁します。培地に抗生物質を含まないでください。</li>
	<li>細菌ペレットをRPMIに保持し、37°Cで4時間、100rpmの速度で5%CO2でシェーカーインキュベーターでインキュベートします。</li>
	<li>プロバイオティクス上清の調製のために、4°Cで15分間、1000 x gで遠心分離を介して細菌ペレットを除去する。 0.22 μmフィルターを使用して回収した上清を滅菌フィルターし、使用するまで−80°Cで保存します。</li>
</ol>2. スフェロイドの生成
<ol><li>
大腸癌細胞株の準備
	<ol>
<li>DLD-1、HT-29、及びWiDr細胞株を70〜80%の合流まで単層として増殖させ、5%CO2インキュベーターで37°Cでプレートをインキュベートする(成長培地:10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリンストレプマイシンを含むRPMI。</li>
		<li>100mmペトリ皿で増殖した細胞の場合は、4 mLの1x PBSでプレートを2回洗浄します。0.25%トリプシン-EDTAの1 mLを加え、5%CO2インキュベーターで37°Cで2分間ペトリ皿をインキュベートし、細胞を解体します。</li>
		<li>インキュベーション後、顕微鏡下で細胞解離を確認し、5 mLの成長培地でトリプシン-EDTAを中和します。</li>
		<li>解約した細胞を15 mLの円錐形チューブに移し、遠心分離機を300xgで3分間移動します。</li>
		<li>上清を捨て、3 mLの成長培地で穏やかに再び再び停止します。</li>
		<li>トリパンブルーで細胞を数え、ヘモサイトメーターを使用して生存可能な細胞を決定します。(図1B(i)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
スフェロイド形成
	<ol>
<li>15 mL円錐形チューブで、2.1.5から細胞を希釈して1〜2 x 105細胞/mLを得る(図1B(ii) </li>
		<li>細胞懸濁液に0.6%メチルセルロースの最終濃度を加え、希釈した細胞を滅菌貯蔵所に移します。 注:細胞株ごとに、必要なメチルセルロースの量を滴定し、それに応じて決定する必要があります。</li>
		<li>マルチチャンネルピペットを使用して、超低い取り付け96ウェルの丸底マイクロプレートの各ウェルに200 μLの細胞を分配します。(図1B(iii)</li>
		<li>プレートを37°Cで24〜36時間5%CO2 インキュベーターでインキュベートします。</li>
		<li>24~36時間後、プレートを光学顕微鏡で観察し、回転楕円体形成を確実に行います。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. LCFSによる3次元大腸癌細胞の治療
<ol><li>手順 2 および 3 で説明されているように、回転楕円体を生成します。</li>
	<li>LCFS処理を行う前に、凍結したLCFSを室温(RT)で10〜20分間解凍します。</li>
	<li>LCFSストックソリューションを成長培地に接種します。成長培地で25%、12.5%、6%に連続希釈(すなわち、LCFSは25%=150μLの成長培地+LCFSの50 μL)。</li>
	<li>インキュベーターからスフェロイドを含む細胞培養プレートを取り出し、200 μLピペットを使用して各ウェルからできるだけ多くの成長培地を取り出します。</li>
	<li>細胞にLCFSを含む成長培地を加え、24〜48時間5%CO2インキュベーターで37°Cでインキュベートします。 注:使用されるボリュームは、プレートサイズによって次のように異なります: 6ウェル細胞培養プレートの場合は2 mL;96ウェル細胞培養プレート用200μL。</li>
</ol>4. スフェロイドの細胞生存率
<ol><li>8 - 10 LCFS治療大腸癌スフェロイドを不透明壁のマルチウェルプレートに準備する(細胞生存アッセイはLCFS治療後48時間実施される)。</li>
	<li>細胞生存率試薬( 材料表を参照)を一晩4°Cで解凍します。</li>
	<li>細胞生存率試薬を使用前に室温に平衡化する。</li>
	<li>アッセイを行う前に、スフェロイドから成長培地の50%を取り除く。</li>
	<li>各ウェルに100μLの細胞生存率試薬を加えます。 注:使用する容積は、プレートサイズによって次のように異なります: 96ウェル細胞培養プレートの場合は100 μLです。</li>
	<li>試薬を5分間激しく混ぜて細胞のリシスを促進する。</li>
	<li>30分間のインキュベート – 37 °Cで2時間。</li>
	<li>発光を記録します。</li>
</ol>5. スフェロイドの定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応解析
<ol><li>各条件に対して、2 mLチューブに10~15個のスフェロイドを用意し、遠心分離機を400 x gで3分間用意します。</li>
	<li>上清を捨て、氷冷1x PBSの1mLでスフェロイドを2回洗います。 注:遠心分離を避け、回転楕円体を落ち着かせてください。</li>
	<li>1x PBSをできるだけ吸引し、市販のキットを用いてRNAを分離した。</li>
	<li>メーカーのプロトコルに従って市販のキットを使用して、1 μgのRNAからcDNAを合成します。</li>
	<li>マスター ミックスを準備して、すべてのサンプルを三重で実行します ( 表 1 および 表 2を参照)。</li>
	<li>テンプレートマスターミックスの20 μLで各qPCRプレートウェルに増幅を行います。</li>
	<li>反応をよく混ぜて、必要に応じてスピンします。</li>
	<li>機器メーカーの推奨事項に従ってサンプルを実行します (表 3)。</li>
</ol>6. スフェロイドからのウェスタンブロッティング
注:スフェロイドを収集する場合は、200 μLピペットを使用し、その構造を乱さないように先端の端をカットします。
<ol><li>各条件に対して、2 mL チューブに 30 ~ 40 個のスフェロイドを用意します。</li>
	<li>チューブを氷の上に置き、回転楕円体を2 mLチューブの底まで下ろします。</li>
	<li>上清を捨て、1 mL氷冷1x PBSでスフェロイドを2回洗う 注:遠心分離を避け、回転楕円体を落ち着かせてください。</li>
	<li>1x PBSをできるだけ吸い込み、プロテアーゼ阻害剤カクテル(10スフェロイド=30μLのRIPAバッファー)でRIPAバッファーを追加します。</li>
	<li>上下にピペットを使用して細胞をライセし、30 sの30 sで10サイクル氷の上で超音波処理を行います。</li>
	<li>タンパク質を遠心分離して、15000xgで4°Cで15分間にリセートする。</li>
	<li>各細胞のリセートに対するタンパク質濃度を決定します。</li>
	<li>積み込む前に、各細胞のライセートを100°Cのサンプルバッファーで10分間沸騰させます。</li>
	<li>SDS-PAGEゲルのウェルに等量のタンパク質をロードし、100 Vで1〜2時間ゲルを実行します。</li>
	<li>ゲルからPVDF膜にタンパク質を移します。</li>
	<li>転写後、ブロックバッファー(5%スキムミルク+Tween-20でTBS)を使用して、室温で1時間膜をブロックします。</li>
	<li>一次抗体の1:1,000希釈液で膜をインキュベートする (表4)1x TBSTで、一晩で5%BSAバッファーを一晩で5%BSAバッファーで。</li>
	<li>膜をTBSTで3回洗浄し、洗浄ごとに15分ずつ洗浄します。</li>
	<li>2時間の室温でブロッキングバッファーに二次抗体の1:2,500希釈を用いて膜をインキュベートする( 材料表を参照)。</li>
	<li>膜をTBSTで3回洗浄し、洗浄ごとに15分ずつ洗浄します。</li>
	<li>化学発光基質を用いてHRP検出用膜を準備します。</li>
	<li>化学発光画像を取得します。</li>
</ol>7. ヨウ化プロピジウム(PI)は、スフェロイドの染色
<ol><li>ステップ4.1で説明したように5-10スフェロイドを準備し、37°Cおよび5%CO2でインキュベーターにスフェロイドを置く。</li>
	<li>1mg/mLのPI 1:100を1x PBSで希釈します。</li>
	<li>96ウェルプレートの各ウェルから培地の50%を取り除きます。</li>
	<li>各ウェルに100 μLのPI溶液を加え、37°Cのインキュベーターに井戸を、10~15分間5%CO2 に入れる。</li>
	<li>1x PBS で PI 溶液を洗い流します。</li>
	<li>200 μL の成長培地を加え、蛍光顕微鏡を用いて画像を撮ります。イメージJを用いて蛍光強度を解析し、回転楕円体の生存率カウントを取得します。</li>
</ol>8. スフェロイドのFACS分析
<ol><li>前述のとおり、回転楕円体を生成します。</li>
	<li>各条件について、FACSチューブに30~40個のスフェロイドを用意し、遠心分離機を400xgおよびRTで3分間用意します。</li>
	<li>上清を吸引し、スフェロイドを1x PBSの3mLで洗浄し、400xgで遠心分離機を4°Cで3分間洗浄する。</li>
	<li>上清を吸引し、0.25%トリプシン-EDTAの200 μLを加え、RTで2-3分間インキュベートします。 メモ:インキュベーション時間は、スフェロイドサイズとセルタイプに依存します。</li>
	<li>FACSバッファーを1 mL追加し、200 μLピペットを使用してスフェロイドを優しく解約します。</li>
	<li>解約細胞を400xgで遠心分離し、4°Cで3分間遠心する。 注: FACS バッファ = 1x PBS + 2.5% FBS、0.22 μm のトップ フィルタを使用してフィルタリング。</li>
	<li>上清を捨て、7-AAD/アネキシンV試薬(7AAD(5 μL)、アネキシンV(5 μL)/サンプルを加えます。</li>
	<li>細胞を穏やかに渦を起させ、暗闇の中でRTで13〜30分間インキュベートする。</li>
	<li>500 μL の FACS バッファーを追加し、円錐ポリスチレン試験管を使用して細胞をフィルター処理して、凝集細胞を除去します。</li>
	<li>遠心分離機は400xgで、4°Cで3分間。</li>
	<li>各チューブに500 μLのアネキシンV結合バッファーを追加し、再中断します。</li>
	<li>フローサイトメーターを使用して分析します。</li>
</ol>

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<li>Ansaldo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akkermansia+muciniphila+induces+intestinal+adaptive+immune+responses+during+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Akkermansia muciniphila induces intestinal adaptive immune responses during homeostasis.</a> Science. 364 (6446), 1179-1184 (2019).</li>
</ol>

著者らは関連する財務上の開示を持っていません。

隣接する細胞および細胞外マトリックス(ECM)を含む組織微小環境は、組織発生の基本であり、細胞増殖および組織発達13の制御において極めて重要である。しかし、2D培養物には、細胞間相互作用の中断、細胞形態の変化、細胞外環境、および分割14のアプローチなど、いくつかの欠点がある。3D細胞培養システムは、生体内の効果をより良く再現するために厳密に研究されており、15,16のインビトロがん検査のためのより精密なシステムとして証明されている。化学療法に対するパーソナライズされた応答をより正確に予測するモデルシステムが必要です17.
3D足場はティッシュ工学のために開発された。これは、ECMの代理損失として機能し、腫瘍細胞の利用可能な空間を表す。さらに、足場は、細胞接着および増殖に対する物理的相互作用を提供し、細胞が適切な空間分布および...

プロバイオティクスは、免疫恒常性および宿主エネルギー代謝を改善する腸内で最も有利な微生物である1.乳酸菌およびビフィズス菌からのプロバイオティクスは腸内で見つかったその種の最も先進的な 2,3.これまでの調査では、ラクトバチルスは大腸癌を含むいくつかの癌に対して阻害および抗増殖効果を有することが示されている。また、プロバイオティクスは炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎5,6を予防する。しかし, プロバイオティクスを用いたほとんどの研究は、2 次元で行われました (2D) 固体表面上で成長している単層.
人工培養システムは、がん細胞にとって自然ではない環境特性を欠いています。この制限を克服するために、3次元(3D)培養システムが7,8に開発されている。3Dにおける癌細胞は、細胞生存率、増殖、形態、細胞細胞通信、薬物感受性、および生体内関連性9,10などの基本的な生物学的機構の点で改善を示す。さらに、スフェロイドは、多細胞型の大腸癌から作製され、細胞間相互作用および細胞外マトリックス(ECM)11に依存する。我々の以前の研究は、ラクトバチルス発酵を用いて産生されたプロバイオティクス無細胞上清(CFS)が大腸癌(CRC)細胞12の3D培養に抗癌効果を示したことを報告した。我々は、CFSが3Dスフェロイド12に対するプロバイオティクス効果をテストするための適切な代替戦略であることを提案した。
ここでは、プロバイオティクス無細胞上清(CFS)の治療効果を複数の3D大腸癌模倣システムに対する分析のために、多細胞型の3D大腸癌に対応できるアプローチを提示する。この方法は、インビトロで関連プロバイオティクスと抗癌効果の分析のための手段を提供します。.

<table><tbody><tr><td> 10% Mini-PROTEAN TGX プレキャストタンパク質ゲル、15 ウェル、15 &micro;l</td><td>Biorad</td><td>4561036</td><td>Pkg of 10</td></tr><tr><td>Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4311971</td><td>100 カバー</td></tr><tr><td>10x トランスファーバッファー</td><td>Intron</td><td>IBS-BT031A</td><td>1 L</td></tr><tr><td>10X Tris-Glycine (w/SDS)</td><td>Intron</td><td>IBS-BT014</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, ポリプロピレン, 透明, 非滅菌, 500 チューブ/パック,10パック/ケース</td><td>Corning</td><td>SCT-200-C</td><td>500 チューブ/パック, 10 パック/ケース</td></tr><tr><td>BD Difco Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>500 g</td></tr><tr><td>BD Difco Lactobacilli MRS Broth</td><td>BD</td><td>DF0881-17-5</td><td>500 g</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D 細胞生存率アッセイ</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td>100&mu;96ウェルプレートのl / assay</td></tr><tr><td>完全なプロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11697498001</td><td>20錠のバイアル</td></tr><tr><td>コーニングリン酸緩衝生理食塩水、カルシウムとマグネシウムを含まない1倍、PH 7.4 &plusmn; 0.1</td><td>コーニング</td><td>21-040-CV</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>EMD ミリポア イモビロン-P PVDF トランスファーメンブレン</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>IPVH00010</td><td>26.5cm x 3.75m ロール;細孔サイズ:0.45um</td></tr><tr><td>Falcon 5 mL丸底ポリスチレン試験管、セルストレーナースナップキャップ</td><td>付き Corning</td><td>352235</td><td>25/Pack、500/Case</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum、認定、米国原産</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit、25 x 20 &micro;l rxns #1708890</td><td>Biorad</td><td>1708890</td><td>25 x 20 & マイクロ;L rxns</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Biorad</td><td>1725121</td><td>5 x 1 mL</td></tr><tr><td>Lactobacillus fermentum</td><td>Korean Collection for Type Cultures</td><td>KCTC 3112</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6852-25G</td><td>25 g</td></tr><tr><td>メチルセルロース (3500-5600mPa&middot;s、20°Cで水中の2%。C)</td><td>TCI</td><td>M0185</td><td>500 g</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td>20 plates</td></tr><tr><td>Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 & micro;m、混合セルロースエステル、33 mm、エチレンオキシド滅菌ミリ</td><td>ポア</td><td></td><td>SLGS033SB 250</td></tr><tr><td>PE アネキシン V アポトーシス検出キット、7-AAD</td><td>Biolegend</td><td>640934</td><td>100 検査</td></tr>付き <tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15140122</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>イントロゲン</td><td>P1304MP</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>RIPA 溶解および抽出バッファー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>89901</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>RNeasy ミニキット (250)</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>250</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-119</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.25%)、フェノールレッド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25200056</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>材料名/機器名/ソフトウェア</td><td>会社名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント/説明</td></tr><tr><td>anti - p-I&kappa;B&アルファ;(B-9)</td><td>サンタクルーズ</td><td>sc-8404</td><td>200 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>抗 BclxL (H-5)</td><td>サンタクルーズ</td><td>sc-8392</td><td>200 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>抗 PARP 1 (C2-10)</td><td>サンタクルーズ</td><td>sc-53643</td><td>50 &micro;l腹水</td></tr><tr><td>抗-&β;-アクチン(C4)</td><td>サンタクルーズ</td><td>sc-47778</td><td>200 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>BD FACSVerse</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>サンディエゴ、カリフォルニア州、米国</td></tr><tr><td>Synergy HTX マルチモードマイクロプレートリーダー</td><td>BioT</td><td>S1LFA</td><td></td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター</td><td>サーモフィッシャー</td><td>HERAcell 150i</td><td></td></tr><tr><td>コニカルチューブ 15 ml</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>コニカルチューブ 50 ml</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 超低アタッチメントマルチウェルプレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS7007</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 超低アタッチメント マルチウェルプレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3471</td><td></td></tr><tr><td>Costar 50 mL 試薬リザーバー、5/袋、滅菌済み</td><td>Costar</td><td>4870</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counting Chamber スライド</td><td>サーモフィッシャー</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Automated Cell Counter</td><td>invitrogen</td><td></td><td></td>AMQAF1000</tr><tr><td>EnSpire マルチモードリーダー</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Enspire 2300</td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel</td><td>Eppendorf</td><td>3122000051</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo software</td><td>TreeStar</td><td></td><td>Ashland, OR, USA</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG (H+L)</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>115-035-062</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG (H+L)</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>111-035-144</td><td>2.0 mL</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td>Inc., San Diego, CA, USA</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000 mini</td><td>富士フイルム</td><td></td><td>東京, 日本</td></tr><tr><td>インキュベートシェーカー</td><td>ラボ コンパニオン</td><td>SIF-6000R</td><td></td></tr><tr><td>Multi Gauge Ver. 3.0,</td><td>富士フイルム</td><td></td><td>東京、日本</td></tr><tr><td>光学密度(OD)LAMBDA UV/Vis分光光度計</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Waltham, MA, USA</td></tr><tr><td>位相差顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td></td><td>東京</td></tr><tr><td>SPL 微量遠心チューブ 1.5mL</td><td>SPL</td><td>60015</td><td></td></tr><tr><td>SPL マルチチャンネルリザーバー、12-Chs、PS、滅菌済み</td><td>SPL</td><td>21012</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR system</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>ウォルサム、マサチューセッツ州、米国</td></tr><tr><td>バイブレーションセル超音波液体プロセッサ</td><td>SONICS-ビブラセル</td><td>VC 505</td><td>500ワット 超音波プロセッサ</td></tr><tr><td>ビニール嫌気性チャンバー</td><td>COY LAB製品</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

大腸癌細胞の3次元スフェロイド培養におけるプロバイオティクスの細胞遊離上清を用いた細胞死の評価

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

本稿は、 乳酸菌 発酵細胞培養物 の上清を用いた多細胞型癌細胞の三次元(3D)スフェロイドにおける癌細胞死亡を評価するプロトコルを、プロバイオティクス培養物と考える。 ラクトバチルス 細胞遊離上清(LCFS)をテストするための3D培養物の使用は、特に L.発酵 が腸内で抗癌効果を生み出すことができるため、2D単層での試験よりも優れた選択肢です。 L.発酵 物上清は、3D培養条件で複数の大腸癌(CRC)細胞に対する抗増殖効果の増加を有することを同定した。興味深いことに、これらの効果は培養モデルと強く関連し 、L.発酵 が癌細胞死を誘導する顕著な能力を示した。安定したスフェロイドは、以下に示すプロトコルを用いて多様なCRC(大腸癌細胞)から生成された。3Dスフェロイドを生成するこのプロトコルは、時間の節約とコスト効率が高いです。このシステムは、複数のタイプのCRCスフェロイドにおけるLCFSの抗癌効果を容易に調べる開発された。予想通り、LCFSで処理されたCRCスフェロイドは、実験中に細胞死を強く誘導し、qRT-PCR、ウェスタンブロッティング、およびFACS分析によって分析された特定のアポトーシス分子マーカーを発現した。したがって、この方法は、細胞の生存率を探索し、抗癌薬の有効性を評価するために有用である。

多様な大腸癌細胞株からスフェロイドを得るプロトコルについて述べています。メチルセルロースによる補充は、スフェロイドを生成するために必要とされた。また、LCFS調製の方法を提示し、プロバイオティクスと大腸癌の相関関係を研究するモデルを提示する。スフェロイド形成およびLCFS調製プロトコルは、図1A,Bに概略的に示される。図2Aに示すように、メチルセルロース濃度0.6%は癌細胞をコンパクトなスフェロイドに変換する。この結果は、メチルセルロースプロトコルを使用して、いくつかのタイプの大腸癌からスフェロイドを生成できることを示しています。次に、スフェロイドを25%LCFSで処理し、48時間後に光顕微鏡を用いてモルフォロジーを研究した。図3Aに示すように、LCFSで処理された群の回転楕円体は、破壊された表面を示した。適切な濃度でのLCFSの抗癌効果を調査するために、スフェロイドはLCFSの様々な用量で48時間治療した:0(対照)、6%、...

ここでは、ラクトバチルス細胞遊離上清(LCFS)の抗癌効果を理解する方法が提示されている。大腸癌細胞株は、3D培養でLCFSで治療した場合の細胞死を示す。スキャフォールドの生成過程はスキャフォールドに応じて最適化でき、提示される解析方法は、関係するシグナル伝達経路を評価するのに有用である。

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

このプロトコールは、複数のタイプの結腸がん細胞スフェロイドにおけるラクトバチルス無細胞上清の抗がん効果の調査を容易にするために最適化されています。この手法は、in vivo模倣条件下で結腸がんスフェロイドに対するLCFSの抗がん効果を調査する最初のアプローチです。まず、オートクレーブ滅菌したMRS寒天プレートを、酸素が20ppmの摂氏37度の水素嫌気性チャンバーに入れ、解凍したばかりのラクトバチルス菌ストックをプレートに接種します。l-システインを添加したMRSブロスを2〜3ミリリットル追加し、チューブをブチルゴムストッパーとチューブキャップで密封します。次に、ループを使用して単一のコロニーを収集し、コロニーを500マイクロリットルのPBSを含む1.5ミリリットルの培養チューブに入れます。コロニーを生理食塩水内で均一に再懸濁し、細菌懸濁液全体を1ミリリットルのシリンジにロードします。培養チューブの蓋の中央に針を挿入し、コロニーを培地に送達します。培養物を摂氏37度、二酸化炭素5%、毎分200回転の振盪器に入れます。2日後、分光光度計で培養物のOD620を測定します。OD620が2に等しい場合は、遠心分離によってバクテリアを沈殿させ、バクテリアペレットをPBSで洗浄します。2回目の遠心分離後、抗生物質を含まない10%ウシ胎児血清を添加したRPMI 1640の4ミリリットルに細菌を再懸濁し、毎分100回転で4時間振とうインキュベーターに細菌を置きます。インキュベーションの最後に、遠心分離によって細菌をペレット化し、回収した上清を0.22ミクロンのストレーナーで滅菌ろ過し、摂氏マイナス80度で保存します。スフェロイド形成のための結腸直腸癌細胞株を調製するには、細胞培養インキュベーター内の100ミリメートルペトリ皿で目的の細胞を単層として培養します。細胞が70〜80%のコンフルエントに達したら、1回の洗浄につき4ミリリットルのPBSで培養物を2回洗浄し、その後、ディッシュごとに1ミリリットルの0.25%トリプシン-EDTAで細胞を剥離します。2分後、光学顕微鏡で解離を確認します。細胞が分離した場合は、5ミリリットルの増殖培地で酵素反応を中和します。細胞培養物あたり1本の15ミリリットルの円錐形チューブに遠心分離して細胞を回収し、チューブあたり3ミリリットルの成長培地でペレットを穏やかに再懸濁します。次に、トリパンブルー排除によって生細胞の数をカウントします。カウント後、細胞を新鮮な培地でミリリットルあたり5番目の細胞濃度の1〜2倍に希釈し、メチルセルロースを細胞に添加して最終的な0.6%濃度にします。細胞を滅菌リザーバーに移し、マルチチャンネルピペットを使用して、超低アタッチメントの96ウェル丸底マイクロプレートの各ウェルに200マイクロリットルの細胞を分注します。次に、プレートを細胞培養インキュベーターに24〜36時間置いてから、光学顕微鏡でスフェロイドの形成を確認します。LCFS処理では、調製した解凍LCFSストック溶液を新鮮な増殖培地で25、12.5、および6%の濃度に連続希釈し、200マイクロリットルのピペットを使用して、めっきした結腸直腸癌細胞株培養の各ウェルからできるだけ多くの上清を慎重に除去します。次に、200マイクロリットルのLCFS添加増殖培地をがん細胞の各セットに3倍に静かに加え、プレートをインキュベーターにさらに24〜48時間戻します。0.6%のメチルセルロース濃度は、試験された癌細胞株細胞をコンパクトなスフェロイドに変換し、このプロトコルを使用していくつかのタイプの結腸直腸癌からスフェロイドを生成できることを示しています。25%LCFSで培養したスフェロイドは、表面が破壊され、用量依存的に細胞生存率が低下します。実際、LCFS共培養細胞は、生存可能なコントロール細胞と比較して、ヨウ化プロピジウムの発現レベルが高いことを示しています。逆転写酵素PCR分析、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリーアネキシンV/7-AAD分析も実施して、がん細胞のアポトーシスに対するLCFSの影響を評価することができます。増殖培地を取り外す際は、スフェロイドが壊れやすく、LCFS処理の効果を観察できなくなるため、スフェロイドを優しく扱ってください。この手順に続いて、細胞生存率アッセイ、定量的リアルタイムPCR、ウェスタンブロッティング、およびFACS分析を実施して、LCFSの抗がん効果をより詳細に特徴付けることができます。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

スフェロイドは、2D細胞培養単層モデルと比較して、細胞の環境をより正確に表現するために使用される3D細胞培養モデルの一種です。このプロトコル例では、科学者が結腸直腸がん細胞株からスフェロイドを作製し、生細胞イメージングを適用してスフェロイドの成長を追跡します。...

細胞株からのスフェロイド作製:三次元(3D)細胞培養法

このビデオは、ラクトバチルス無細胞上清(LCFS)の抗がん効果を研究するためのin...

乳酸桿菌無細胞上清の抗がん効果評価法

ここでは、メソッドは、膵臓がん細胞と線維芽細胞、細胞外フラックス アナライザーを使用して代謝機能の測定に続いての 3 次元 (3 D)...

準備と膵臓癌細胞と線維芽細胞の共培養を 3 次元回転楕円体の代謝アッセイ

このプロトコルは、リアルタイムで 3 D 構造化癌細胞 (スフェロイド) に対する免疫療法のリダイレクトされた T 細胞 (T 細胞車)...

車 T 細胞スフェロイド殺害アッセイ

ここでは、生体内腫瘍の物理化学勾配を2D培養よりもはるかに優れた3D癌細胞スフェロイドで生存率と死亡を評価するためのいくつかの簡単な方法を紹介する。したがって、スフェロイドモデルは、生体内条件への翻訳を改善した癌薬効の評価を可能にする。...

癌細胞の3Dスフェロイド培養における細胞生存率と死の評価

このプロトコルは、Caco2結腸腺癌細胞から3次元スフェロイドを生成し、増殖させる新規、堅牢、再現性培養システムを提示する。この結果は、化学療法への応答を含む癌幹細胞生物学を研究するためのこのアプローチの適切性に関する最初の概念実証を提供する。...

大腸癌幹細胞を研究するスフェロイドの3次元モデル

乳腺上皮細胞と内皮細胞との間のクロストークは、乳癌の進行、腫瘍の増殖、転移に重要な貢献をする。本研究では、スフェロイドは、血管および/またはリンパ内皮細胞と共に乳癌細胞から作られ、乳癌研究のための インビトロ...

乳がん研究のための潜在的機能 インビトロ モデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド

本プロトコルは、初代がん細胞から3D腫瘍培養モデルを生成し、細胞生存率アッセイおよび顕微鏡検査を使用して薬物に対するそれらの感受性を評価することを記載しています。...

患者由来の腫瘍サンプルから3次元スフェロイドを樹立し、薬物に対する感受性を評価

本稿では、抗腫瘍抗体の重要ながん細胞死滅機構であるADCC機構を調節する化合物を同定する方法について紹介する。NK細胞の細胞毒性効果は、トラスツズマブの存在下で乳がん細胞スフェロイドで測定されます。画像解析により、スフェロイドの生細胞と死細胞、および標的細胞が同定されます。...

腫瘍スフェロイドモデルにおける抗体依存性細胞傷害性の定量化:創薬への応用

このプロトコールは、サイトカインなどの細胞傷害性摂動に応答してヒト結腸オルガノイドの細胞死を調査および定量するためのシンプルで費用対効果の高い方法について説明しています。このアプローチでは、蛍光細胞死色素(SYTOX Green Nucleic Acid...

生蛍光顕微鏡を用いたヒト結腸オルガノイドにおけるサイトカイン誘発性細胞死の定量化(英語)

学ぶ Lactobacillus細胞遊離上清を用いた大腸癌スフェロイドの細胞死誘導評価法。3次元培養技術とシグナル伝達解析により、抗腫瘍効果を詳細に検証する革新的アプローチを習得できます。

大腸癌細胞の3次元スフェロイド培養におけるプロバイオティクスの細胞遊離上清を用いた細胞死の評価

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