大腸癌細胞の3次元スフェロイド培養におけるプロバイオティクスの細胞遊離上清を用いた細胞死の評価
2020年6月13日
ここでは、ラクトバチルス細胞遊離上清(LCFS)の抗癌効果を理解する方法が提示されている。大腸癌細胞株は、3D培養でLCFSで治療した場合の細胞死を示す。スキャフォールドの生成過程はスキャフォールドに応じて最適化でき、提示される解析方法は、関係するシグナル伝達経路を評価するのに有用である。
このプロトコールは、複数のタイプの結腸がん細胞スフェロイドにおけるラクトバチルス無細胞上清の抗がん効果の調査を容易にするために最適化されています。この手法は、in vivo模倣条件下で結腸がんスフェロイドに対するLCFSの抗がん効果を調査する最初のアプローチです。まず、オートクレーブ滅菌したMRS寒天プレートを、酸素が20ppmの摂氏37度の水素嫌気性チャンバーに入れ、解凍したばかりのラクトバチルス菌ストックをプレートに接種します。
l-システインを添加したMRSブロスを2〜3ミリリットル追加し、チューブをブチルゴムストッパーとチューブキャップで密封します。次に、ループを使用して単一のコロニーを収集し、コロニーを500マイクロリットルのPBSを含む1.5ミリリットルの培養チューブに入れます。コロニーを生理食塩水内で均一に再懸濁し、細菌懸濁液全体を1ミリリットルのシリンジにロードします。
培養チューブの蓋の中央に針を挿入し、コロニーを培地に送達します。培養物を摂氏37度、二酸化炭素5%、毎分200回転の振盪器に入れます。2日後、分光光度計で培養物のOD620を測定します。
OD620が2に等しい場合は、遠心分離によってバクテリアを沈殿させ、バクテリアペレットをPBSで洗浄します。2回目の遠心分離後、抗生物質を含まない10%ウシ胎児血清を添加したRPMI 1640の4ミリリットルに細菌を再懸濁し、毎分100回転で4時間振とうインキュベーターに細菌を置きます。インキュベーションの最後に、遠心分離によって細菌をペレット化し、回収した上清を0.22ミクロンのストレーナーで滅菌ろ過し、摂氏マイナス80度で保存します。
スフェロイド形成のための結腸直腸癌細胞株を調製するには、細胞培養インキュベーター内の100ミリメートルペトリ皿で目的の細胞を単層として培養します。細胞が70〜80%のコンフルエントに達したら、1回の洗浄につき4ミリリットルのPBSで培養物を2回洗浄し、その後、ディッシュごとに1ミリリットルの0.25%トリプシン-EDTAで細胞を剥離します。2分後、光学顕微鏡で解離を確認します。
細胞が分離した場合は、5ミリリットルの増殖培地で酵素反応を中和します。細胞培養物あたり1本の15ミリリットルの円錐形チューブに遠心分離して細胞を回収し、チューブあたり3ミリリットルの成長培地でペレットを穏やかに再懸濁します。次に、トリパンブルー排除によって生細胞の数をカウントします。
カウント後、細胞を新鮮な培地でミリリットルあたり5番目の細胞濃度の1〜2倍に希釈し、メチルセルロースを細胞に添加して最終的な0.6%濃度にします。細胞を滅菌リザーバーに移し、マルチチャンネルピペットを使用して、超低アタッチメントの96ウェル丸底マイクロプレートの各ウェルに200マイクロリットルの細胞を分注します。次に、プレートを細胞培養インキュベーターに24〜36時間置いてから、光学顕微鏡でスフェロイドの形成を確認します。
LCFS処理では、調製した解凍LCFSストック溶液を新鮮な増殖培地で25、12.5、および6%の濃度に連続希釈し、200マイクロリットルのピペットを使用して、めっきした結腸直腸癌細胞株培養の各ウェルからできるだけ多くの上清を慎重に除去します。次に、200マイクロリットルのLCFS添加増殖培地をがん細胞の各セットに3倍に静かに加え、プレートをインキュベーターにさらに24〜48時間戻します。0.6%のメチルセルロース濃度は、試験された癌細胞株細胞をコンパクトなスフェロイドに変換し、このプロトコルを使用していくつかのタイプの結腸直腸癌からスフェロイドを生成できることを示しています。
25%LCFSで培養したスフェロイドは、表面が破壊され、用量依存的に細胞生存率が低下します。実際、LCFS共培養細胞は、生存可能なコントロール細胞と比較して、ヨウ化プロピジウムの発現レベルが高いことを示しています。逆転写酵素PCR分析、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリーアネキシンV/7-AAD分析も実施して、がん細胞のアポトーシスに対するLCFSの影響を評価することができます。
増殖培地を取り外す際は、スフェロイドが壊れやすく、LCFS処理の効果を観察できなくなるため、スフェロイドを優しく扱ってください。この手順に続いて、細胞生存率アッセイ、定量的リアルタイムPCR、ウェスタンブロッティング、およびFACS分析を実施して、LCFSの抗がん効果をより詳細に特徴付けることができます。
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概要
本記事では、大腸がんスフェロイドに対するラクトバチルス細胞遊離上清（LCFS）の抗がん効果を調べるためのプロトコルを提示します。本研究では、スフェロイド形成の最適化を行い、細胞死に関与するシグナル伝達経路を評価します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- がん研究
背景
- Lactobacillusは、健康への潜在的な有益性で知られています。
- 無細胞上清には生物活性化合物が含まれている可能性があります。
- 大腸がんは、依然として重大な健康課題となっています。
- 3D細胞培養は、in vivoの条件をより適切に模倣できます。
研究目的
- 大腸がんスフェロイドに対するLCFSの抗がん効果を検討する。
- スフェロイド作製技術を最適化する。
- 観察された効果に関与するシグナル伝達経路を解析する。
使用方法
- 嫌気チャンバー内でのMRS寒天プレートの調製。
- Lactobacillus菌株によるプレートへの接種。
- l-システインを添加したMRSブロス中での細菌の培養。
- 処理のための細菌コロニーの回収および再懸濁。
主な結果
- 大腸がん細胞株は、LCFS処理により細胞死を示した。
- 最適化されたスフェロイド形成法により、実験結果が改善された。
- 細胞死に関与するシグナル伝達経路が効果的に解析された。
- 本研究は、がん治療研究に対する新たなアプローチを提供する。
結論
- LCFSは抗がん剤としての可能性を示している。
- 正確なモデリングには3D培養技術が不可欠である。
- 関与するメカニズムを完全に理解するためには、さらなる研究が必要である。
よくある質問
産業上の重要性
本プロトコールにより、バイオ医薬品の研究開発チームは、生理学的に適切な3D大腸がんモデルを用いて、プロバイオティクス由来の上清の抗がん活性を評価することが可能になります。安定したスフェロイド培養にLactobacillus fermentum細胞遊離上清（LCFS）を用いることで、天然物候補物質のメカニズム的なリスク低減を支援し、ターゲット検証における予測の信頼性を向上させます。このアプローチは、がん細胞の生存能に影響を与える腸内微小環境の相互作用をモデル化することで、探索段階のスクリーニングとトランスレーショナルな関連性を結びつけます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 微生物代謝産物およびそれが大腸がん細胞の死滅経路に及ぼす影響に関する治療仮説を検証します。
- 運用の価値： 3Dスフェロイドモデルにおける用量依存的な生存率の読み取りにより、機能的なターゲット検証を可能にします。
- 予測的価値： qRT-PCR、Western blot、およびFACSを介して、LCFS誘発性アポトーシスを測定可能な分子マーカーに結びつけることで、ポートフォリオの優先順位付けを支援します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備： 超低接着プレートを用いた再現性のあるスフェロイド形成により、下流の化合物スクリーニングに供する検証済み生物学的システムを調製します。
- 定量的アウトプット： 用量反応データ（25%、12.5%、6% LCFS）を生成し、IC50の推定および構造活性相関モデリングを可能にします。
- スケールアップ： 自動液体ハンドリングおよびハイスループットな生存率スクリーニングに対応した96ウェルフォーマットを使用します。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 疾患との関連性：in vivoの腫瘍構造を反映する患者由来または確立された細胞株のスフェロイドを用い、大腸がんの病態生理をモデル化します。
- トランスレーショナルな連続性：アッセイの各段階で一貫した3D培養条件を維持することで、創薬研究の知見を前臨床評価へと繋げます。
- リスク調整後の意思決定：スフェロイド共培養で観察されるアポトーシス誘導および生存率の閾値に基づき、Go/No-Go判定を容易にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲット同定後かつリード最適化前の初期探索ワークフローに組み込まれ、微生物由来の生物活性上清を評価するための疾患関連システムを提供します。
- 探索生物学：微生物の抗がんメカニズムの仮説検証および、in vivoでの反応をより正確に予測する3Dモデルにおける経路の解明をサポートします。
- スクリーニング：標準化されたスフェロイド形成およびLCFS処理プロトコルにより、アッセイの標準化と再現性を実現します。
- 分析：定量的な従属変数（生存率、アポトーシスマーカー）の測定を可能にし、処理条件間および細胞株間での統計的比較をサポートします。
- トランスレーショナルリサーチ：3D培養の忠実性を維持することで、スフェロイドベースのスクリーニングから前臨床検証までの連続性を保持します。
- エンタープライズでの再利用：複数のがん種にわたるプロバイオティクス上清、発酵食品抽出物、またはマイクロバイオーム由来治療薬のスクリーニングに利用可能なプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：2Dモデルによる偽陽性を減らし、微小環境依存的な影響を捉えることで、ターゲット検証における予測信頼性を向上させます。
- 運用的価値：スフェロイドの作製および処理のワークフローを標準化し、施設間の再現性を向上させ、アッセイのばらつきを低減します。
- 戦略的価値：コストのかかるin vivo試験の前に、マイクロバイオーム標的介入の早期リスク低減を可能にし、資本効率を向上させます。
- ポートフォリオへの影響：臨床的に関連のあるモデルにおけるアポトーシス誘導および用量反応に基づき、天然物リード化合物のリスク調整済み優先順位付けを支援します。
実施上の留意点
- 嫌気性細菌培養、3Dスフェロイドの取り扱い、およびアポトーシスアッセイ技術（qPCR、WB、FACS）の専門知識が必要です。
- 嫌気チャンバー、振盪インキュベーター、分光光度計、フローサイトメーターなどの機器に依存します。
- 一貫したLCFSの調製およびスフェロイドの品質管理を行うため、微生物学チームとがん生物学チーム間のチーム横断的な標準化が必要です。
- 大腸がんモデル以外の細菌株やがん種に拡張する場合、適応に関する検討が必要となります。
- 培地交換時のスフェロイドの脆弱性が制限要因となるため、正確な測定結果を得るために構造的完全性を維持する慎重な取り扱いが求められます。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:34
Bacterial Cell Culture and Lactobacillus Cell-Free Supernatant (LCFS) Preparation
2:18
Colorectal Cancer Cell Line Preparation
3:12
Spheroid Formation
3:49
3D colorectal Cancer Cell LCFS Treatment
4:26
Results: Representative Effects of LCFS Co-Culture on Spheroid Formation and Viability
5:22
Conclusion
