Name: X線結晶学は 、熱利子マリティマ M42アミノペプチダーゼTmPepT050のオリゴマー状態推移を研究する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: 学ぶX線結晶学を用いたアミノペプチダーゼTmPep1050のオリゴマー状態推移の研究方法。不活性二量体と活性十二量体間の遷移を解析し、タンパク質機能解明に貢献する実験プロトコルです。

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この論文を校正し、建設的なコメントをしてくれたマーティン・ルーバーに感謝します。Proxima 2ビームライン(SOLEILシンクロトロン)へのアクセスは、ブロック割り当てグループ20151139内に含まれました。

著者らは開示するものは何もない。

本明細書に記載されたプロトコルは、構造レベルでのTmPep1050のダイマー・ドデカマー転移を理解することを可能にする。方法論は、両方のTmPep1050オリゴマー11の構造を決定するために以前に経験した。最も困難なステップは、安定したダイマーへのドーデカマーの解離を促進する条件を見つけることでした。このような条件は、金属イオン補因子が添加されたときにドーマーをドーデカマーに再関連付けできるように十分に軽度でなければならなかった。オリゴマーの分離は、構造研究およびさらなる生化学的特徴付けを条件とする重要なステップでもあった(例えば、種々の用量のCo2+におけるドーデカマー再結合の研究)。分子置換は、相決定のための実証済みの方法であり、TmPep1050オリゴマーおよびその変異体の構造を解くために使用された。提案されたプロトコルは、オリゴマー化状態が金属補因子の入手可能性に依存する他の金属酵素を研究するために適応され得る。
プロトコルを説明するために、研究の事例が提示された、TmPep1050H60A H...

オリゴマー化は、多くのタンパク質の生物学的機能を決定する主要なプロセスです。大腸菌では、タンパク質の35%だけが単量体1であると推定されている。モルフェインと呼ばれるいくつかのタンパク質は、各オリゴマー状態2に明確な構造を有するサブユニットを有するいくつかのオリゴマー状態を採用することさえできる。それらのオリゴマー状態間の移行は、各オリゴマー状態が異なる特異的活性または機能を有し得るタンパク質活性を調節する意味であることが多い。モルフェインのいくつかの例は、文献、特にポルフォビリノーゲン合成酵素3、HPrキナーゼ/ホスファターゼ4、ロンプロテアーゼ5、乳酸脱水素酵素6、グリセアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素7、ピルビン酸キナーゼ8、クエン酸シターゼ9、およびリブコンA10において十分に文書化されている。最近、我々は、M42アミノペプチダーゼTmPep1050、モルフェイン様な挙動を有する酵素の別の例を説明し、その活性はそのオリゴマー状態11に依存する。そのオリゴマー状態間の遷移は、サブユニットのいくつかの構造修飾を誘発する金属補因子によって媒介される。
M42アミノペプチダーゼファミリーはMH族12、13に属し、細菌と古細菌14の間で広く分布している。M42アミノペプチダーゼは、長さ15のアミノ酸残基を最大35個までペプチドを分解する本物の二核酵素である。彼らは、内側の空洞に向けられたアクティブな部位を持つ12のサブユニットで作られた独特の四面体型の構造を採用しています。このような配置は、制御されていないタンパク質分解を避けるために活性のナノ区画化としてしばしば記述される。M42アミノペプチダーゼの生理機能は、プロテアソームに関連付けてもよいし、タンパク質分解から生じるペプチドを加水分解する16、17。ピロコッカス堀越は4つのM42アミノペプチダーゼを持ち、それぞれが18、19、20、21の別個の、しかし相補的な特異性を提示する。単独では、2種類のサブユニットからなるヘテロ複合体がP.堀越しに記載されており、ペプチダソーム複合体22,23の存在を示唆している。
M42アミノペプチダーゼのいくつかの構造は、文献11、16、18、19、20、24、25、26に記載されている。サブユニットは、触媒ドメインと二量体化ドメインの2つの異なるドメインで構成されています。触媒ドメインは、MH族全体に保存された共通のα/βフォールドを採用し、ビブリオプロテオリチクス27のアミノペプチダーゼAp1である原型触媒ドメインである。二量体化ドメインはPDZ様の折り目16を採用し、オリゴマー化におけるその役割に加えて、内腔11における基板アクセスおよび結合を制御する役割を有し得る。基本的なビルディングブロックがダイマーであるため、ドーデカマーは、6つのダイマーの関連としてしばしば記述され、各ダイマーは四面体16の各縁に位置付けられている。M42アミノペプチダーゼのオリゴマー化は、その金属補因子の可用性に依存しています.二価金属イオンは、しばしばZn2+およびCo2+、ペプチド結合および加水分解に触媒的に関与している。これらは、M1 サイトと M2 サイトという 2 つの異なるバインド サイトに存在します。また、この2つの金属イオンは、PhTET2、PhTET3、PfTET3、およびTmPep105011、24、28、29に対して実証されているように、オリゴマー化を駆動し、細かく調整する。金属補因子が枯渇すると、ドーデカマーは、PhTET2、PhTET3、およびTmPep105011、16、28、あるいはPhTET2およびPfTET324、29のような単量体のようにダイマーに分解する。
ここで提示されるプロトコルは、TmPep1050オリゴマーの構造を研究するために使用されます。このプロトコルは、タンパク質精製、タンパク質分解活性スクリーニング、結晶化、X線回折、分子置換などの一般的な方法のセットです。メタロ酵素、タンパク質オリゴマー化、タンパク質の結晶化、分子置換に固有の機微が強調されています。研究のケースはまた、TmPep1050ドーデカマーがモノマーにさらに解離することができるかどうかを示すために提示されています。この質問に対処するために、TmPep1050変異体であるTmPep1050H60A H307Aは、His-60(M2部位)およびHis-307(M1部位)をアラ残基に変異させることによって金属結合部位が損なわれる研究を行った。このプロトコルは、他のM42アミノペプチダーゼまたはモルフェイン様の挙動を有する任意のメタロ酵素を研究するために収容されてもよい。

<table><tbody><tr><td>1,10-フェナントロリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13, 137-7</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 ml 遠心フィルター Ultracel 30K</td><td>メルク ミリポア</td><td>UFC503096</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 遠心フィルター ウルトラセル 30K</td><td>メルク ミリポア</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>ベンゾナーゼ ヌクレアーゼ</td><td>メルク ミリポア</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>CCP4</td><td>N/A</td><td></td><td>訪問 http://www.ccp4.ac.uk/</td></tr> <tr><td>cOmplete EDTAフリー</td><td>ロシュ</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>クート</td><td>N/A</td><td></td><td>訪問 https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td></tr> <tr><td>クリスタルスクリーン I</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR2-110</td><td></td></tr><tr><td>クリスタルスクリーンII</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR2-112</td><td></td></tr><tr><td>ドリームタック グリーン PCR マスターミックス</td><td>サーモフィッシャーScientific</td><td>K1082</td><td></td></tr><tr><td>EasyXtal 15ウェルツール</td><td>NeXtal</td><td>132007</td><td></td></tr><tr><td>大腸菌 PPY株</td><td>N/A</td><td></td><td>参考文献31を参照</td></tr><tr><td>大腸菌 XL1 青色株</td><td>Agilent</td><td>200249</td><td></td></tr><tr><td>Gel Filtration Calibration Kit HMW</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-4038-42</td><td></td></tr><tr><td>Gel Filtration Calibration Kit LMW</td><td>GEヘルスケア ライフサイエンス</td><td>28-4038-41</td><td></td></tr><tr><td>ゲルろ過 スタンダード</td><td>Biorad</td><td>1511901</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET プラスミド ミニプレップキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>インデックス</td><td>ハンプトンリサーチ</td><td>HR2-144</td><td></td></tr><tr><td>リソループス</td><td>分子寸法</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-ロイシン-p-ニトロアニリド</td><td>バケムAG</td><td></td><td></td>40010720025</tr><tr><td>Natrix 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-116</td><td></td></tr><tr><td>Natrix 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-117</td><td></td></tr><tr><td>Neggia plugin</td><td>Dectris</td><td>N/A</td><td>訪問</td></tr> <tr><td>https://www.dectris.com/ NeXtal Tubes JCSG Core Suite I</td><td>NeXtal</td><td>130724</td><td></td></tr><tr><td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite II</td><td>NeXtal</td><td>130725</td><td></td></tr><tr><td>NeXtal チューブ JCSG Core Suite III</td><td>NeXtal</td><td>130726</td><td></td></tr><tr><td>NeXtal チューブ JCSG Core Suite IV</td><td>NeXtal</td><td>130727</td><td></td></tr><tr><td>pBAD-TOPO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K430001</td><td></td></tr><tr><td>Phenix</td><td>N/A</td><td></td><td>訪問</td></tr> <tr><td>https://www.phenix-online.org/ Phusion High-Fidelity DNA ポリメラーゼ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F-530L</td><td></td></tr><tr><td>塩RX 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-107</td><td></td></tr><tr><td>Salt RX 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-109</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88242</td><td></td></tr><tr><td>Source 15Phe</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17014702</td><td></td></tr><tr><td>Source 15Q</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17094705</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 prep grade</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス17104301</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermotoga maritima MSB8株</td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション</td><td>ATCC 43589</td><td></td></tr><tr><td>TmCD00089984</td><td>DNASU プラスミドリポジトリ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>XDS</td><td>N/A</td><td></td><td>訪問 http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/</td></tr> <tr><td>xdsme</td><td>N/A</td><td></td><td>訪問 https://github.com/legrandp/xdsme</td></tr></tbody></table>

x線結晶学は 、熱利子マリティマ m42アミノペプチダーゼtmpept050のオリゴマー状態推移を研究する

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

M42アミノペプチダーゼは、12個のサブユニットからなる機能的に活性な複合体を形成する。彼らの組み立てプロセスは、二量体ドーデカメア転移を引き起こす金属イオン補因子によって調節されているようだ。金属イオン結合の際に、アクティブ部位および相互作用界面で、自己集合を促進するためにダイマーを形成するいくつかの構造修飾が起こる。このような修飾を観察するには、構造研究の前に安定したオリゴマーを単離する必要があります。ここで報告されているのは、TmPep1050の安定したドーデカマーおよびダイマーの精製 、T.マリティマのM42アミノペプチダーゼ、およびX線結晶学によるそれらの構造決定を可能にする方法である。ダイマーは、キレート剤で金属イオンを除去することによってドーデカマーから調製した。彼らの補因子がなければ、ドデカメルは安定性が低くなり、加熱時に完全に解解化された。オリゴマー構造は、単純な分子置換アプローチによって解明された。方法論を例示するために、金属イオン結合において完全に障害を受けたTmPep1050変異体の構造は、単量体に対するダイマーのさらなる分解を示さない提示される。

TmPep1050で単量体へのドーデカマー解離の可能性を研究するために、His-60およびHis-307コドンは合成遺伝子を使用してアラニンコドンに置き換えられました。この遺伝子は、次に、TmPep1050変異体の発現および精製のためにpBADベクターでクローン化された後、TmPep1050H6050 H307Aと名付けた。サイズ排除クロマトグラフィー(図3B)は、精製タンパク質が56kDa(モノマーの分子量が36.0kDaである)の見かけの分子量を示した。同様の見かけの分子量である52 kDaが、TmPep1050ダイマー11について報告されている。したがって、TmPep1050H60A H307Aのオリゴマー状態は、二量体として推論され得る。その特異的な活性に関しては、TmPep1050H60A H307Aは、コバルトイオンの存在下でも、基質としてL-Leu-p NA上で完全に不活性であった。この結果は、バリアントが金属イオンを結合できないこと...

このプロトコルは、構造レベルでTmPep1050、M42アミノペプチダーゼのダイマー-ドデカマー転移を研究するために開発されました。タンパク質精製からX線データ処理まで、簡単なパイプラインです。結晶生成、データセットインデックス化、および分子置換は、研究の場合、TmPep1050H60A H307A 変異体を通じて強調されてきた。

X線結晶学は 、熱利子マリティマ M42アミノペプチダーゼTmPepT050のオリゴマー状態推移を研究する

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

このプロトコルは、不活性二量体と活性ドーデカマーのバランスが取れた異なるオリゴマー状態およびオリゴマー化依存性活性を有するアミノペプチダーゼの研究を促進する。この従来の技術は、任意のラボで簡単に行うことができます。ビームラインやX線結晶学の設備へのアクセスを必要とすることには別として、特別な装置を必要としない。何らかの適応によって、この方法は、そのオリゴマー化の程度に依存する活性または機能を有する他のタンパク質に適用され得る。X線データを処理するには、結晶学の理解を最小限に抑える必要があります。トレーニングを受講し、XDS Wikiにアクセスし、Phenixチュートリアルを見るようにユーザーを招待します。活性アッセイを行うために、100mM L-ロイシンp-ニトロアニリドの25マイクロリットルを50ミリモルMOPSの965マイクロリットル、250マイクロモルコバルト2塩化物および10%メタノールプレインキュベートし、酵素を1マイクロモラの最終濃度に浸漬してから、さらに1マイクロモラ濃度に酵素を希釈する次に、1マイクロモル酵素10マイクロリットルを反応ミックスに加え、得られた溶液をボルテックスしてから、反応を摂氏75度の乾燥浴に1時間以下で戻します。溶液が黄色になったら、室温まで冷却する前に、20%の酸性酸と渦の1ミリリットルで反応を停止します。次に、反応ミックスのアリコートを分光光度計細胞に移し、酵素を含まないインキュベート反応ミックスに対して410ナノメートルの吸収剤を陰性対照として読み取る。アポ酵素調製のために、10マイクロリットル、10フェナントロリンストック溶液を50ミリモルMOPSの890マイクロリットル、0.5モル硫酸アンモニウム、精製TmPep1050の100マイクロリットルに加えます。塩化コバルト2を添加することなく実証した活性アッセイを用いて活性損失を確認する。アッセイ後、サンプルを透析管に移し、サンプルを摂氏4度で50ミリモルMOPSと0.5モル硫酸アンモニウムの200ミリリットルに対して透析します。48時間の透析中に3回新鮮なバッファーと透析液を交換し、透析管からサンプルを収集します。30キロダルトンカットオフの超濾過ユニットを使用して、サンプルを100マイクロリットルに濃縮し、280ナノメートルのナノボリューム分光光度計の濃度を確認します。ダイマーを調製するには、50ミリモルMOPSおよび0.5モル硫酸アンモニウムで1マイクロモル濃度にアポホンを希釈し、75°C乾燥浴中に2時間の反応をインキュベートする。次に酵素試料を50マイクロリットル濃度以上の場合に濃縮し、サイズ排除クロマトグラフィーにより分子量を確認する。タンパク質結晶の形状、大きさ、結晶性を改善するために、結晶の滴に最適化された結晶化溶液の適切な量を追加し、結晶液量を10マイクロリットルにします。液滴を1.5ミリリットルのマイクロチューブに移し、さらに90マイクロリットルの結晶化溶液を播種によく加えます。各種子希釈に対して、結晶化プレートの適切な数のウェルにウェルあたり500マイクロリットルの結晶化試薬を加え、2マイクロリットルのタンパク質サンプルを2マイクロリットルの結晶化試薬と0.2マイクロリットルの種子を井戸当たり1つの結晶化支持体で混合します。次に、結晶化試薬の各ウェルに支持体を固定します。水晶摘みのために、液体窒素で浴を満たし、窒素にサンプル処理に使用される任意のバイアルまたはバスケットを突っ込む。液体窒素の取り扱いは、重度の凍傷を引き起こす可能性がある危険です。極低温手袋や保護眼ゴーグルのような適切な個々の保護を着用してください。結晶サイズに応じて異なるサイズのサンプルピッキングループを設定し、双眼鏡を使用して結晶を含むドロップを選択します。その後、ループを使用して1つのウェルから孤立した結晶を穏やかに選択し、ループを適切なバイアルに入れる前に液体窒素ですぐにループを突き落とします。回折スポットの強度を測定するには、XDS を実行するフォルダーを作成し、画像へのパスを見つけます。xdsme を実行するには、ターミナル ウィンドウにコマンドを入力します。XDS が終了した後、正しい lp ファイルをチェックし、スペース グループの決定、データの完全性、最高解像度、結晶のモザイク性とデータ品質の確率を確認します。XDS の無意味なログをチェックしてスペース グループの可能性を取得した後、前のプロセスを上書きしないように、XDS が提案する別のスペース グループ ソリューションを使用して xdsme を再実行します。データ統計に基づいて最適なソリューションを選択した後、XSCALE および XDSCONV を実行するコマンドを入力します。異常散乱項目を含まない位相を決定するには、4P X、Y座標を使用し、分子置換の開始モデルを用意する。PDB ファイルから、Phenix PDB ファイル エディタを使用して A モノマーを抽出し、アラニン内のアミノ酸を切り捨てます。XDSCONV によって生成されたリフレクション ファイルと入力としてシーケンスを使用して X トリアージを実行します。Xtriage からログ ファイルを確認します。完全性、非対称単位のサブユニット数、異方性、氷のリングの存在、およびツイニング発生に注意してください。分子置換のためにフェニックスでPhaser-MRを実行するには、ポリアラニンで切り捨てられた反射ファイル、シーケンスおよび開始4P 6 Yモデルを選択し、[実行]をクリックします。完成したら、モデルが見つかったかどうかを確認し、分子置換のスコアを確認します。変換係数 Z スコアが 8 以上の場合、解が決定的に正しいことを示します。分子置換によってフェーズを決定した後、[自動構築を実行]を選択して[実行]をクリックします。必要なファイルはすべて自動的に追加されます。完了したら、COOT でモデルを確認し、COOT の電子密度マップに従ってモデルを手動で構築および調整します。このモデルを使用して、シーケンスと回折データを入力として、正しい戦略を選択するためにPhenixを参照して、Phenixで手動でキュレーションされたモデルを洗練します。結果を絞り込んだ後、絞り込み無料および絞り込み作業を減らす必要があります。MolProbity指標は尊重され、実際の空間相関が低い外れ値は制限されなければならない。最適な洗練されたモデルが生成されたら、サーバー上でMolProbityを実行し、プログラムによって識別された外れ値を確認します。サイズ排除クロマトグラフィーは、精製タンパク質の見かけの分子量を決定するために使用することができる。ペプチドの結晶化条件は、ダイマーの条件の周りのPEG濃度に対してpHを変化させることによって最適化することができる。例えば、最高のTmPep1050 H60A H307A結晶を、5.2および20%PEG3350濃度のpHを有する0.1モルクエン酸ナトリウムで得た、マイクロシーディングの1サイクル後にマイクロ結晶性を改善した。この分析では、データインデックス化は、TmPep1050 H60A H307A結晶の空間群がC2221であることを示したが、XDSは別の溶液、MP空間群を提案した。TmPep1050 H60A H307Aの構造は、自動化され、手動の洗練のいくつかのサイクルの後に完了することができます。モノマー間の界面1,710平方オングストロームと、1モル当たりマイナス16.2キロカロリーの界面形成の自由エネルギーを有するオリゴマー状態を確認する。ここで、TmPep1050 H60A H307A活性部位のクローズアップは、TmPep1050ダイマーおよびドデカマーの活性部位と比較して観察することができる。モデルを構築する場合は、電子密度に見えるものだけを構築して、過度の解釈やデータを避け、時間をかけてモデルを磨くように注意してください。ダイマーおよびドーデカメの分子量は、天然の質量分析法によっても決定することができる。そして、この方法は、遷移オリゴマーを検出するのに有用であり得る。

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