Name: タイムラプス顕微鏡による 大腸菌 における生物学的ノイズの連続測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 学ぶタイムラプス顕微鏡法で大腸菌の合成遺伝子回路における生物学的ノイズを連続測定し、信号変動とS/N比を評価する手法。この方法は低コストで簡便に適用可能です。

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MATLABコードを支援してくれたギル・ゲルバート氏(電気工学部、テクニオン)に感謝します。この記事の校正を支援してくれたXiming Li博士(バイオメディカル工学部、テクニオン)に感謝します。この研究は、ノイバウアー家財団とイスラエル科学省が2027345を助成金として支えたものです。

1.メディアと文化の準備
<ol><li>1,000xカルベニシリン(50mg/mL)または関連する抗生物質のストック溶液を調製する。<ol>
<li>.カルベニシリンの重量を0.5g。滅菌H2 O.の10 mLを加える完全に溶解します。</li>
		<li>0.22 μmシリンジフィルターを使用してカルベニシリンストックを殺菌します。抗生物質溶液をアリコートし、-20°Cで貯蔵する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>リソゲニーブロス(LB)プレートを調製するには、トリプトン5g、NaCl5g、酵母エキス2.5g、バクト寒天7.5g、0.5Lの無菌H2O.オートクレーブで溶液を121°Cで20分間混ぜます。<ol>
<li>溶融ゲル混合を50°Cの水浴に部分的に浸す。カルベニシリン(50mg/mL)を1,000μL加えます。</li>
		<li>滅菌環境でペトリ皿を準備します。冷蔵庫に保管する前にプレートをセットしておきなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>M9の最小媒体の場合は、M9塩5x(56.4 g/L)、2Mグルコース、2%ビオチンフリーカザミノ酸の別々のストック溶液を調製してください。121°Cで20分間、ソリューションをオートクレーブします。</li>
	<li>5ペトリプレートを調製するには、低融解寒天の1125mgと寒天400mgを最小限の培地(1x M9)の89.2 mLと混合します。250 mL のエルレンマイヤーフラスコに2%カザミノ酸(2%[vol/vol])の10 mLを加えます。 注:フラスコの内側の唇にメディアを注ぐことを確認してください。</li>
	<li>3~4秒の短いバーストで溶液をマイクロ波します。解がクリアになるまで繰り返します。 注:沸点に達しないようにしてください。</li>
	<li>250 mL のエルレンマイヤーフラスコを温水浴(60°C)に入れて拡散してさらに混ぜ、温度が約45~50°Cになるまで冷まします。</li>
	<li>プレートを注ぐベンチで炎を点灯します。</li>
	<li>すべてのソリューションを次の順序ですばやく追加します。 800 μL の 50% グリセロール (0.4% [vol/vol]) チアミン(B1)の100 μL 1100 μL のグルコース (2M) カルベニシリン100μL(50mg/mL)。</li>
	<li>アーレンマイヤーフラスコを旋回して、寒天全体のすべての成分の均等な分布を確保します。</li>
	<li>炎の隣に一度に1枚のプレートを開け、注ぎ始めます。<ol>
<li>プレートを最初の固化するまで数分間ベンチに置いたままにしておきます。</li>
		<li>水の凝縮がゲルに滴り落ちないように、プレートを逆さまにします。</li>
		<li>プレートを室温で約2時間固化したままにしておきます。</li>
		<li>プレートが固まり乾燥したら、4°Cで約3ヶ月間保存することができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2.細菌株およびプラスミドの構造
注:遺伝的回路は、1つの部分が含まれています。Pテトオ プロモーターによって駆動される緑色蛍光タンパク質(GFP)で、構成的な発現を生じる。この研究における全てのプラスミドは、基本的な分子クローニング技術を用いて構築され、 エシェリヒア・コリ 10βに変換され、標準のヒートショックプロトコル24を用いた。最終的な構造はテストのために 大腸菌 MG1655野生型株に変換されました。
<ol><li>標準のヒートショックプロトコル24で、所望のプラスミドを大腸菌MG1655細胞に変換する。</li>
	<li>LB寒天プレート上の形質転換細胞を37°Cで一晩成長させます。 注:ペトリ皿はステップ2.2から顕微鏡使用のために3日まで保つことが可能です。</li>
	<li>単一コロニーを5 mLのLBスープに接種し、関連する抗生物質をガラス管に含める。</li>
	<li>液体が濁るまで2時間インキュベーターで250rpmの揺れの速度で37°Cで細胞を成長させます。</li>
	<li>次のように希釈液の1 mLを準備します。 最小メディアの892 μL(1x M9) グリセロール50%8 μL(0.4%[vol/vol]) 100 μL の 2% カザミノ酸 (0.2% [wt/vol]) チアミン(B1)の1 μL 11 μL のグルコース (2 M) 関連する抗生物質の1 μL<ol>
<li>ミックスしてスピンダウンします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ステップ2.4から2mLチューブに細胞培養液(1:30)を希釈し、30μLの 大腸菌 成長を希釈液1000μLに加えます(ステップ2.5)。</li>
	<li>37°Cで振る(250rpm)でチューブを1時間インキュベートします。</li>
	<li>ステップ1.10で調製したM9プレート上で40 μL - 60 μLを成長させます。プレートを一晩37°Cでインキュベートします。 注: めっきの光密度 (OD600nm)は 0.1 前後である必要があります。</li>
	<li>35mmのガラス底板を3枚までベンチに置きます。 メモ:プレートのガラスの厚さが、使用されている顕微鏡レンズに適していることを確認してください。</li>
	<li>ゲルプレートに播種するための培養を準備し、ステップ2.9顕微鏡測定で調製したプレートからコロニーについてステップ2.3〜2.6を繰り返す。</li>
	<li>3つの顕微鏡プレートを作るために、次の溶液を準備します。<ol>
<li>水浴を60°Cに予熱する。</li>
		<li>低融解寒天の112.5mgと寒天40mgを8.92mLの最小限の培地(1x M9)と混ぜ、25mLのエルレンマイヤーフラスコに2%のカザミノ酸(0.2%[vol/vol])の1 mLを加えます。 注:フラスコの内側の唇にメディアを注ぐことを確認してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2~3秒の短いバーストで溶液をマイクロ波します。解がクリアになるまで繰り返します。 メモ:沸点に達しないように注意してください。</li>
	<li>25 mL のエルレンマイヤーフラスコを温水浴(60°C)に入れて拡散してさらに混合し、温度が約45~50°Cになるまでベンチで冷却します。</li>
</ol>3.アガロースパッドの作成
<ol><li>70%エタノールのクリーンベンチ。クリーニングされたベンチの伸張テープ。テープが滑らかで、平らになっていることを確認します。</li>
	<li>テープに1つ、近くに2つカバーリップを用意します。カバーリッドを準備します。</li>
	<li>水浴からフラスコ(ステップ2.14で準備)を取り出し、フラスコの外側をきれいに拭き取り、温度が約45〜50°Cになるまで冷却します。</li>
	<li>ゲル溶液を作るために、次の順序ですべての溶液を素早く混ぜます: グリセロール50%80μL(0.4%[vol/vol]) 2%カザミノ酸の1 mL(0.2%[wt/vol]) チアミン(B1)の10 μL 110 μL のグルコース (2 M) 関連する抗生物質の10 μL。</li>
	<li>カバースリップにゲル1.5mLを注ぎ、2枚目の「サンドイッチ」で覆います。</li>
	<li>エルレンマイヤーを湯風呂に戻します。蓋でサンドイッチを覆い、タイマーを20分間セットします。</li>
	<li>同時に、37°Cでステップ2.11から1時間(250rpm)でチューブをインキュベートする</li>
	<li>20分後にサンドイッチをひっくり返し(ステップ3.5)、それを覆い、1時間休ませます。 注意:より良い結果のためにステップ3.8の間4 °Cで休むために「サンドイッチ」を残します。</li>
	<li>種子 エシェリヒア大腸菌 は、35ミリメートル皿にサンプルをピペットすることによってステップ3.7から培養します。 注:細胞の6 μLを別々の小さな滴としてピペット処理すると、最良の結果が得られます。</li>
	<li>滴を少なくとも15分間、最大30分間乾燥させます。</li>
	<li>ステップ3.8からサンドイッチの固化ゲルを、カバースリップを滑り落とすことによって露出させる。</li>
	<li>生検パンチまたはチップでサンドイッチを小さな個々のパッドにカットします。</li>
	<li>サンプルにやさしく傾きます(ステップ3.9)。皿をベンチに20分間置いておきなさい。</li>
</ol>4.顕微鏡イメージング用サンプルの準備
<ol><li>ステップ3.6から水浴からフラスコを取り除きます。フラスコの外側をきれいに拭き、室温(25°C)まで冷まします。 メモ:タイマーが終了する約3分前にステップ4.1でフラスコを取り外します。</li>
	<li>円運動でプレート周囲にゲルの3mLを絶えず注ぎます。数分間固めるために残します。</li>
	<li>テープでプレートをシールし、25 G針で穴を開けます。水の凝縮がゲルに滴り落ちるのを防ぐために、すべての皿を反転させます。</li>
	<li>4°Cで全ての料理を30分間インキュベートし、細胞の糸球菌を防ぎながら完全な固化を可能にします。 注:連続測定のために4°Cにサンプルを残し、1日以下。</li>
	<li>メーカーの指示に従って顕微鏡を起動します。</li>
	<li>最も低い増幅レンズを使用して初期フォーカスを見つけ、自動フォーカスシステム(AFS)をエンゲージします。</li>
	<li>必要に応じてオイルを使用し、オイルでレンズを溺れ、プラットフォームコントローラ(手動ではない)でプレートを移動することによって慎重に広げ、AFSは再び従事することができます。</li>
	<li>Z ステップ断面の既定の提案に従って、Z 方向の相対断面を使用します。 注:5分ごとに明るいフィールド画像と20分ごとに蛍光画像を撮影しました。場合によっては、最初の 30 分間にフォーカスを調整する必要があります。顕微鏡インキュベーターボックスとオイルを予熱しながら、サンプルを冷蔵しながら、焦点の初期損失を減らすのに役立つ傾向があります。</li>
</ol>5.データ分析
メモ:顕微鏡データを処理するために、MATLABでコンピュータベースのソフトウェアを設計しました。このソフトウェアは、明るいフィールドのtiff画像とセグメントからの細胞境界の識別を容易にし、領域によって細胞をソートします。この画像解析の出力は、蛍光TIFF画像のマスクとして使用して、細胞の強度レベルを導出し、顕微鏡の分解能限界による細胞ハローなどの蛍光領域のアーチファクトを取り消すことができます。開発されたソフトウェアは、同様の作品7、25、26、27、28、29、30からインスピレーションを得て、ラボに合わせたエレガントなソリューションを提供します。
<ol><li>まず 、main_code.mで次のパラメータを定義します。<ol>
<li>取得イメージのフォルダを定義します。</li>
		<li>イメージの時間の期間を定義する - 明るいフィールド チャネルの時間ステップ (分単位)。</li>
		<li>GFP イメージの取得速度 - GFP 周波数を定義します。</li>
		<li>顕微鏡の解像度を定義します(つまり、1 μmのピクセル数)。</li>
		<li>ヒストグラムビン範囲 - セル領域範囲を定義します。 注: 細胞領域に従ってデータを分類するプロセスは、フローサイトメトリーデータ分析における格数化の原理に似ています。ゲートは、通常は前方散乱し、側面が散乱し、関心のあるこれらの集団を分離して定量化するために、共通の特性を持つ細胞の集団の周りに配置されます。顕微鏡検査は、ゲート、調査、いくつかの細胞群を定量化することができます。</li>
		<li>畳み込みカーネル (3,3) を定義する - このパラメータは、グローバルなしきい値(count_cells.m)によってセル境界を検出します。 注: このセットアップは、ラボまたは顕微鏡を交換する場合にのみ必要です。ソフトウェアでは、入力明視野チャンネルにインデックスc1、c2とラベル付けされた蛍光チャネルが必要です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>main_code.m を実行すると、他のすべてのスクリプト (count_cells.m、 cell_growth_rate.m) が自動的に実行されます。<ol>
<li>プログラムは、明視野画像を自動的にセグメント化します( 補足図2-4を参照)。</li>
		<li>セグメンテーション画像と蛍光画像(GFP)を組み合わせて、細胞あたりの強度レベルを抽出します。</li>
		<li>時間によって細胞の量のグラフを計算し、指数的な成長に応じてフィットします。</li>
		<li>各セル領域の範囲の平均と標準偏差 (STD) を計算します。</li>
		<li>各セル領域の範囲に対する信号対雑音比(SNR)を計算します。</li>
		<li>強度別のセル量の分布をプロットして適合させます。</li>
		<li>分散係数 (CV) を計算し、フローアナライザデータと比較します。 注:ソフトウェアは、新しいフォルダ「あなたのフォルダ/セグメント化」でconv_kernelを調整するための最終的なセグメンテーション画像を出力として提供します。ソフトウェアは、新しいフォルダ「あなたのフォルダ/グラフ」内のグラフを出力として与えます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>実験を比較するには 、compare_experiments.mを使用します。<ol>
<li>保存されたグラフのディレクトリと \CompareResult ディレクトリのアドレスを定義します。</li>
		<li>ファイルを実行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

本研究では、エ シェリヒア・コリ 生細胞のコンピュータトレースを可能にするプロトコルを開発し、時間の経過に従って分裂および蛍光レベルを追った。このプロトコルは、我々はリアルタイムでCVとSNRを測定することにより 、大腸菌 の遺伝的回路の確率的ダイナミクスを定量化することができます。このプロトコルでは、 図 10に示すように、2 つの異なる回路の確率的な動作を比較しました。コピー数の少ないプラスミドは、確率的効果を起こしやすく、細胞分裂の影響を受けにくいことが示されています。第1回路は構成的にGFP(図10a)を構成的に発現し、第2回路は sfGFPをssrA分解タグに融合して構成的に表現した(図10b)。蛍光タンパク質の確率的挙動を定量化するため、明視野画像も記録しました。結果は、GFPの発現、特にその成熟39において、支配的なノイズ源であることを示している。 図10a で観察された周期的に鋸歯の挙動...

合成生物学は、過去10年間に出現した学際的な分野であり、工学設計原理を合理的な生物学的設計1、2、3に変換し、基本科学4、5、診断、治療およびバイオテクノロジーアプリケーション6、7、8、9、10を理解するために、生体細胞における多信号統合と処理を達成することを目指しています。合成遺伝子回路の入力出力応答を定量化する当社の能力は、自動タイムラプス顕微鏡11を用いたフローアナライザやライブセルイメージングを含む単細胞技術の最近の進歩によって革命化されている。フローアナライザは、定常状態1、12においてこれらの回路の応答を測定するためによく使用され、反転顕微鏡は、単一細胞3のレベルでの合成遺伝子回路の動的応答を測定するために使用される。例えば、合成生物学の初期の研究の1つは、遅延3を伴う負のフィードバックループを使用して生きている細胞における遺伝的発振器ネットワークの構築を含んでいた。その後、生細胞4の動的環境における代謝制御を理解するために、遺伝的発振回路を適用した。自動時間経過顕微鏡は、このような回路を特徴付ける方法の1つです。我々は、宿主細胞である大腸菌がマイクロコロニーを形成する際に同期し、正確な母娘関係を追跡することなく、信号の測定とノイズの計算を可能にすることを仮説とする。
ノイズは、多くの場合、複数のソースから生じる生物学的システムの基本的な、固有の側面です。例えば、タンパク質13の拡散のような離散的なランダムキャリアの輸送に由来するシグナルを含む生化学的反応を考えてみましょう。これらの信号はランダムな変動14で伝播する。その他のノイズ源としては、資源の利用可能性、細胞分裂、温度、湿度、圧力などの環境条件の変動があります。合成遺伝子回路で伝播する生体信号は、多くの場合、このような回路の性能を乱す非常に低い信号対雑音比(SNR)を有する。したがって、遺伝子回路設計は、遺伝子工学15の最も困難な側面の1つです。例えば、平均遺伝子発現のみを計算する(細胞全体の母集団にわたって測定される)ほとんどのアプローチとは対照的に、測定されたシグナルの分散は、合成遺伝子ネットワーク12を介して予測可能な行動を設計するために考慮される。したがって、タンパク質発現における変動性またはノイズのレベルは、アナログおよびデジタル遺伝子回路1、16、17の設計と性能において支配的な役割を果たす。
大腸菌3、7、18を含む細胞間変動を定量化するために多くのアプローチが開発されている。これらの方法は、遺伝子の活性化と代謝経路を研究するためによく使用されるが、特にこれが基本的な課題である生細胞における遺伝的回路に対して、特定のノイズ源の測定や分断のような確率的ノイズダイナミクスの研究にあまり焦点を当てずに使用される。いくつかの要因は、回路自体に継承され(組み込み)、宿主細胞(外因)から派生し、遺伝的回路の連続的な性能を乱す可能性があります。本論文では、固有および外因性ノイズ源6,22を含む大腸菌細胞の全雑音を定量化することを目的としたプロトコルを開発した。全ノイズを定量化し、SNR23を評価することで、遺伝子回路の設計を改善することができます。この方法は、いくつかの蛍光タンパク質6,20を監視することにより、独立したノイズ源を別々に測定するように改変することができる。ここで説明するプロトコルについては、環境条件を十分に制御し、外部要因の影響を受けることなく細胞の活性を継続的に測定します。一つの細胞内の蛍光タンパク質からのシグナルを時間の経過とともに測定し、同時にアガロース基板の下で画像化します。結果の画像は実験室のカスタムMATLABを使用して分析される。
理想的には、細胞内の蛍光タンパク質のリアルタイム活性を連続的に測定すると、細胞の増殖と分裂を通じて正確なデータが生成されます。しかし、そのようなデータを取得することは困難です。これは、励起プロセスで放射線にさらされたときの蛍光タンパク質(光漂白7)の分解によるものです。さらに、 大腸菌 細胞も興奮に敏感であり、光毒性7を引き起こしうる。どちらの問題でも、取得できるフォトフレームの量と取得までの時間が制限されます。イメージング中に細胞を増殖させるために使用される基質および培地タイプ(例えば、リソゲニーブロス)も重要な役割を有する。蛍光性を最小限に抑え、細胞分裂時間を延長する最小限の培地を使用することを強くお勧めします。
さらに、サンプルは、以下の要件を考慮して調製する必要があります(1)低細胞分割率は、分割サイクルを密接にイメージングし、光毒性および光漂白の確率を低減するためのより少ない頻度の露出を可能にします。(2)実験の初めに、取得時間を約半分のマイルス化時間(2)低い細胞密度に設定することで、分裂の均一性と追跡性を向上させます。細胞密度は、このプロトコルの成功のための重要なパラメータであり、すべてのラボのために決定する必要がある 大腸菌 細胞の希釈比の影響を受けます。比率を確立するために、新しい 大腸菌 株または使用される媒体のそれぞれは、成長率グラフを取り付ける必要があります(補足図1)。OD600nm = 0.1程度の初期密度から短いインキュベーション後に細胞が追加の揺れなしで成長できる場合、適切な比率が達成されました。この段階での細胞は、環境温度のみに応じて分裂する(3)細胞の動きの制限:細胞の動きは基質(アガロースパッド)の硬さに強く依存する。基材のハリは、総アガロースの量とゲル凝固時間に依存します。 エシェリヒア大腸菌 は有糸分裂を起じるように、ゲルを室温で一晩固化させることはできません。基板の安定性に影響を与える他の要因は、サンプルおよび湿度中の水の量を含む。その他の問題については、「代表結果」で詳しく説明します。このプロトコルは、多くの詳細を提供し、徐々に別のステップから移動します。このプロトコルは、イメージング実験に長い安定性を提供し、基本的な画像処理ツールを提供します。

<table><tbody><tr><td>35mmガラス皿</td><td>mattek</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td>厚さは顕微鏡レンズに対応しています。</td></tr><tr><td>アガロース&nbsp;</td><td>ロンザ</td><td>5004</td><td>LB準備</td></tr><tr><td>AHL&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3007</td><td>インデューサー</td></tr><tr><td>バクトトリプトン&nbsp;</td><td>BD - ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー&nbsp;</td><td>211705</td><td>LB準備</td></tr><tr><td>Carb</td><td>Invitrogen</td><td>10177-012</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>Carb</td><td>Formedium</td><td>CAR0025</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>カサミノ酸&nbsp;</td><td>BD - ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー&nbsp;</td><td>223050</td><td>最小媒体溶液</td></tr><tr><td>日食 Ti</td><td>ニコン</td><td></td><td>倒立顕微鏡</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>最小媒体溶液</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>バイオラボ</td><td>000712050100</td><td>最小媒体基板</td></tr><tr><td>イマーソール 518F</td><td>ツァイス</td><td>4449600000000</td><td>液浸油</td></tr><tr><td>M9 塩溶液&nbsp;</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>M6030</td><td>最小限のメディアソリューション</td></tr><tr><td>NaCl</td>バイオ<td>ラボ</td><td>214010</td><td>LB準備</td></tr>高<tr><td>貴な寒天</td>シ<td>グマ-アルドリッチ</td><td>A5431</td><td>最小限のメディア基板</td></tr><tr><td>パラフィルムテープ</td><td>ビーミス</td><td>PM-996</td>は<td>、テキスト</td></tr><tr><td>Seaplaque GTGアガロース</td><td>ロンザ</td><td>50111</td><td>最小限のメディア基板</td></tr><tr><td>thaymine B1</td><td>のテープとして参照シグマ・アルドリッチ</td><td>T0376&nbsp;</td><td>最小限のメディアソリューション</td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>BD - ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー&nbsp;</td><td>212750</td><td>LBの準備</td></tr></tbody></table>

タイムラプス顕微鏡による 大腸菌 における生物学的ノイズの連続測定

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

ここで開発されたプロトコルは、数時間にわたって 大腸菌 部門と蛍光レベルのコンピュータ追跡を可能にするツールを提供しています。このプロセスは、正しいプラスミドを抱える 大腸菌 だけが特定の条件で繁栄することができると仮定して、最小限の媒体で生き残るコロニーのスクリーニングから始まります。多くのDNA部品の組み立てを必要とする大規模な遺伝子回路を構築するプロセスは困難であるため、回路部品は、多くの場合、いくつかの抗生物質の使用を必要とする異なるコピー番号で複数のプラスミド間で分布しています。プラスミドの突然変異は、抗生物質耐性遺伝子の転写を破壊し、壊死につながる細胞内の資源管理と介入する可能性がある。選択されたコロニーはガラス底のペトリ皿にセットされ、明るい分野および蛍光領域の両方の顕微鏡追跡のためにいくつかの焦点面が選ばれる。このプロトコルは、規制できない初期条件下で 12 時間以上画像のフォーカスを維持し、いくつかの困難を生み出します。例えば、死んだ細胞は、数時間のイメージングの後にレンズの焦点分野に蓄積し始め、毒素が蓄積し、信号がぼやけて減衰する原因となります。栄養素の枯渇は、新しい代謝プロセスを導入し、回路の所望の応答を妨げます。実験の温度は、誘導剤および抗生物質の有効性を低下させ、信号の信頼性をさらに損なう可能性がある。最小のメディアゲルが収縮し、乾燥し、その結果、光学的焦点は時間の経過とともに変化します。我々は、他の微生物に対する類似法を開発した以前の作品と同様に、 大腸菌でこれらの課題を克服するためにこの方法を開発しました。さらに、この方法は、変化しない細胞および変化した細胞の総確率的ノイズを定量化するアルゴリズムを提供し、同様の変動係数(CV)で示されるように、結果がフローアナライザ予測と一致していることを発見する。

ソフトウェアは、オフホワイトとブラックの明るいフィールドドメイン画像を分析します。 大腸菌 は、オフホワイトの背景に黒い楕円形のように見え、輝度のダイナミックレンジは、その中心にスパイクを示す必要があります(図1)。蛍光画像では、細胞は小さなハローを有するが、楕円形の個々の細胞はまだ解決することができる。有糸分裂イベントは、最初に30分後に検出される必要があります。顕微鏡の焦点は時間の経過とともに安定している必要があり、細胞はこれらの30分間にゆっくりと動くかもしれませんが、視野を離れる可能性は低いです。このような実験は良いと考えられ、 図2で見ることができます。低倍率で明視野領域で細胞を検出するのは難しい場合があります。高いコピー数(HCN)プラスミドで平均焦点距離を確立することをお勧めします。低コピー数(LCN)プラスミドを高倍率で事前に測定しながら、平均距離を設定します。この焦点距離は、主にプレート、顕微鏡システムおよび油、ゲルまたは 大腸菌 株の厚さではないに依存します。</...

この研究は、合成遺伝子回路の確率的挙動の分析と定量化のために 、大腸菌 の単一細胞の生画像化を可能にする顕微鏡法を提示する。

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

このプロトコルは、大腸菌における遺伝回路の継続的な測定と、個々の細菌細胞における信号変動性および信号対雑音比の計算における回路性能を評価する。この技術の主な利点は、異なる株やラボに簡単に適応可能であり、最小限のトレーニングと特別な機器を必要とし、比較的安価であるということです。ノイズは、生物学的システムの機能を決定する上で重要な役割を果たします。現在、大規模な遺伝子回路の構築に関心があります。これらのシステムは、ノイズによって阻害することができますサンプルをよく乾燥させ、そのチルパッドをできるだけ長く摂氏4度に保ち、部品を辛抱強く穏やかに切断して分割してください。分析のために細菌を調製するために、トランスフェクトされた大腸菌培養物から単一コロニーを接種する。たとえば、GFP レポーターを含む回線です。LBスープの5ミリリットルを含むガラス管では、関連する抗生物質でそれを補う。スープが曇るまで2時間、揺れインキュベーターで摂氏37度と毎分250回転で細胞を成長させます。インキュベーションの終わりに、2ミリリットルのミニマイクロ遠心分離機で1ミリリットルの希釈液をスピンダウンし、30マイクロリットルの細菌と希釈液の全容を新しい2ミリリットルチューブに移します。次に、この懸濁液の40~60マイクロリットルをM9培養プレートに播種する前に、振盪して1時間培養します。分析のために細菌を調製するために、トランスフェクトされた大腸菌培養物から単一コロニーを接種する。例えば、関連する抗生物質を補ったLBスープの5ミリリットルを含むガラス管のGFPレポーターを有する回路。スープが曇るまで2時間、揺れインキュベーターで摂氏37度と毎分250回転で細胞を成長させます。インキュベーションの終わりに、2ミリリットルのミニマイクロ遠心チューブで希釈液を1ミリリットル回転させ、30マイクロリットルの細菌と希釈液の全容を新しい2ミリリットルチューブに移します。その後、シェイクで1時間培養します。顕微鏡プレートを準備するには、低融解寒天の112.5ミリグラムと40ミリグラムの寒天、25ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコに2%カザミノ酸1ミリリットルを混ぜます。次に、25ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコの内側の唇に8.92ミリリットルの最小限の培地を加え、得られた溶液を短く、2〜3秒のバーストでマイクロ波します。その後、水浴を摂氏55度に設定します。溶液がはっきりしたら、摂氏60度の水浴に25ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコを置き、寒天溶液が温度が摂氏約45〜50度に下がるまで冷却します。寒天冷却中、70%エタノールでラボベンチを清掃し、クリーニングされたベンチにラボテープを滑らかにします。1つのガラスカバースリップをテープの上に置き、2番目のカバースリップを近くに置きます。適切な抗生物質と溶液に冷却寒天溶液を追加します。テープの上に置かれたカバースリップに溶液をゲル化するために準備したての1.5ミリリットルを注ぎ、泡を避けるように注意して、2番目のカバースリップをゲルに置きます。エルレンマイヤーを温水浴場に戻し、カバースリップを20分間覆います。カバースリップを摂氏4度で1時間のインキュベーションで反転します。インキュベーションの終わりに、ドライゲルからカバースリップを取り出し、アガロースから小さなパッドを切ります。インキュベーション中に、調製した細菌懸濁液の6マイクロリットルの液滴を35ミリメートル皿に加え、滴を少なくとも15〜30分間乾燥させます。その後、慎重に細菌の1滴に一度にパッドを置き、サンプルが室温で20分間設定できるようにします。サンプルを塗らずに寒天ベッドを置くために、慎重に穏やかなタッピングで液滴の上にクールパッドを配置します。サンプルを画像化するには、フラスコを水から取り出し、ゲル溶液を体温まで冷却させます。サンプルプレートの周囲にゲルの3ミリメートルを注ぎます。アガロースが固まったら、テープでプレートを密封し、25ゲージの針を使用してテープにいくつかの穴を開けます。その後、細胞の有糸分裂を防ぎながら、アガロースが完全に固化できるように、プレートを摂氏4度で少なくとも30分間逆さまに置きます。24時間以内に、蛍光共焦点顕微鏡を使用して、最も低い倍率でサンプルを見つけ、顕微鏡の自動焦点システムに従事します。適切な目的にオイルを塗布し、慎重に油を広げるためにプレートを移動するためにプラットフォームコントローラを使用しています。次に、自動フォーカスを再び設定し、Z ステップの断面のデフォルトの提案に従ってサンプルをイメージします。大腸菌は、オフの白い背景に黒い楕円形として表示されるはずです。そして、輝度のダイナミックレンジは、その中心にスパイクを示す必要があります。三味のイベントは、最初に蛍光顕微鏡で30分後に検出することができます。個々の細胞は低倍率で検出するのが難しい場合がありますが。誤った希釈比で調製された細菌細胞培養物は、不変の数の細胞を示し、プレートシールなしで調製したサンプルは過度の収縮を示し、その結果、焦点が失われる可能性があります。細胞はまた、栄養素を求めてゲルをインデントし、細菌細胞を互いに積み重ねて細胞単層を損なう結果、細胞検出と信頼性の高い蛍光シグナル測定を効果的に防止することができます。これらのデータによって示されるように、面積の異なる範囲が同じ傾向を示すため、除算周期のセルステージはノイズレベルに影響を与えません。また、これらの代表データに示すように、GFPとスーパーフォールドGFPの間では、信号対雑音比の大きな変化は認められない。この手順を実行する場合、実験に使用する細菌株の正しい希釈比を決定するように注意してください。各規制回路の信号対雑音比をこの基準線と比較すると、最適な性能回路の選択が可能となり、興味深い現象を明らかにすることができます

continuous-measurement-biological-noise-escherichia-coli-using-time

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

で多細胞の動作を記録する Myxococcusザンザス</emタイムラプスMicrocinematographyを使用して>バイオフィルム

出典:バレンタイン、ME、他。Pseudomonas aeruginosaにおけるインフレーム遺伝子欠失変異株の作製と感染の単純なマウスモデルにおける病原性減衰の試験J. Vis. 経験。(2020年)このビデオでは、生物発光を使用して、マウスにおける毒性細菌株と弱毒菌株のin...

生物発光を用いたマウスにおける細菌感染動態の追跡

出典: Oms、T.、 et al。大 腸菌における抗生物質持続性の集団および単一細胞解析 J. Vis.

細菌における抗生物質の持続性を研究するためのマイクロ流体タイムラプス顕微鏡

出典:ケイビーン、M. T.らバチルス・サブティリスの単細胞マイクロ流体解析。J. Vis.

マイクロ流体システムにおける細菌増殖を単細胞分解能で追跡

出典: Chaimovitz, E. A., 他 タイムラプス顕微鏡を用いた大 腸菌 の生物学的ノイズの連続測定。 J. Vis. Exp.(2021年)このビデオは、タイムラプス顕微鏡を用いて細菌の成長と分裂中のGFP蛍光の変動を追跡することで、 大腸菌...

タイムラプス顕微鏡を用いた細菌の生物学的ノイズの連続モニタリング

出典: Schumacher, D.、Sogaard-Andersen, L. 成長遅い社会細菌 ミクソコッカス・ザンサスの 完全な栄養細胞周期の蛍光生細胞イメージング。ジャーナル・ヴィジョンズ Exp.

蛍光標識細菌における染色体分離のタイムラプスイメージング

出典: Makowski, Ł. ほか。タイムラプス蛍光顕微鏡を用いた細菌捕食者 Bdellovibrio bacteriovorus の生活環のライブ細胞イメージング。 J. Vis. Exp. (2020年)このビデオは、アガロースパッド下で固定された大腸菌を捕食するBdellovibrio...

Bdellovibrio bacteriovorusのライブ細胞タイムラプス画像診断 大腸菌に対する捕食

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Situハイブリダイゼーションにおける2色単分子蛍光を用いた 大腸菌 における空間と時間におけるmRNA運動学の探査

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成長と遺伝子発現の不均一性を測定するマイクロコロニーのハイスループットライブイメージング

抗生物質の持続性は、敏感な同質遺伝子集団内の小さな亜集団が高用量の殺菌性抗生物質に一時的に耐える能力を表します。.本プロトコルは、 大腸菌...

大腸菌における抗生物質持続性の集団および単一細胞解析

学ぶタイムラプス顕微鏡法で大腸菌の合成遺伝子回路における生物学的ノイズを連続測定し、信号変動とS/N比を評価する手法。この方法は低コストで簡便に適用可能です。

タイムラプス顕微鏡による大腸菌における生物学的ノイズの連続測定

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