マイクロベシクルとエキソソームのペーパーベースの事前濃縮と分離
2020年4月29日
提示は、マイクロベシクルおよびエキソソームの効果的な濃縮および分離のための紙ベースのデバイスを製造するためのプロトコルです。
このプロトコルでは、細胞外小胞を分離して効果的な濃縮のために設計されたXO Padと呼ばれる紙ベースのデバイスを製造する簡単な方法を説明する。XO Padは、従来の方法よりも高い回収率を示しながら、化学物質や作業機械を使用せずに細胞外小胞を事前濃縮し、単離することができるシンプルなデバイスです。まず、印刷する領域をプリンタ ソフトウェアで定義します。
設計は、円形のサンプル領域の直径が徐々に5ミリメートルから2ミリメートルに狭い12のワックスパターンの層を持っている必要があります。次に、セルロース紙の両側の指定領域に疎水性ワックスを印刷する。ワックスプリント紙を120°Cで80秒間実験室のオーブンに入れ、ワックスプリント紙をカッターで切って個々のXOパッドデバイスを作ります。
5マイクロリットルと2マイクロリットルのパーマ選択的膜を、最も左と右のほとんどの層のサンプル領域にそれぞれ落とします。パーマ選択膜でコード化された層をホットプレートの上に摂氏70度で30分間置き、溶媒を蒸発させます。次に、緩衝液に面したコーティングされた層の最表面を感圧テープで密封し、小さな穴を残します。
XO Pad デバイスを白線に沿って前後に折り、すべてのサンプル領域を収束的に接続します。収束サンプル領域のミクロベシクルおよびエキソソームサンプルのピペット15マイクロリットルを、完全な湿潤を確実にするために数秒待ちます。XOパッドの両端に2つのアクリルチャンバーを置き、展開を防ぐために小さなバインダークリップでしっかりとクランプします。
0.1X PBSの110マイクロリットルでチャンバーを充填し、2つの銀電極を挿入します。次に、電流電圧源測定システムを使用して、30ボルトを電極に20分間塗布します。濃縮されたマイクロベシクルとエキソソームを分離するには、折り畳まれたXOパッドをアクリルチャンバーから分離し、デバイスを展開して濃縮された粒子を他の層から分離します。
マイクロベシクルとエキソソームが下流解析のために濃縮されるレイヤー 8 と 9 のサンプル領域をパンチアウトします。蛍光標識されたマイクロベシクルおよびエキソソームのタイムラプス移行アッセイを実施し、濃縮粒子の最大回収のための動作時間を最適化した。全てのサンプル領域の蛍光強度をImageJソフトウェアで定量化した。
濃縮プロセスの前に、マイクロベシクルおよびエキソソームは、強度の緩やかな減少を伴うすべてのサンプル領域に分散した。10分間の処理の後、粒子は電気キネテニックに移動し、即刻の事前濃度プラグが層7に現れた。20分に達すると、マイクロベシクルとエキソソームは8層と9層に強く焦点を当て、蛍光強度に基づいて5倍に濃縮された。
8層の濃縮された微小胞およびエキソソームの完全性をSEMで調べた。濃縮された微小胞およびエキソソームのサイズ分布も分析した。
続いて、6層、8層、10層のサンプル領域上の濃縮された微小胞およびエキソソームの実際の濃度を分析した。層8では、ミクロベシクルとエキソソームは5.58倍の予め濃縮されたが、他の層では顕著な前濃度は認められなかった。この手順の再現性を確保するために、デバイス検証時およびデバイスの動作時間が最適化された条件であるため、オーブンインキュベーション時間と温度のプロトコルに正確に従った。
XOパッドは、炭酸塩バッファーを使用して、血清や血漿などのタンパク質が豊富なサンプルから細胞外小胞を分離および分離するためにも使用できます。このプロトコルは、診断、薬物送達、免疫療法、および他の治療などの臨床研究に必要な濃縮および分離機能を備えた効率的で簡単な準備ツールを提供することができます。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
この記事では、細胞外小胞の効果的な濃縮と分離のために設計されたXO Padと呼ばれる紙ベースのデバイスを製造するためのプロトコルについて説明します。XO Padは、化学物質や機械を使用せずに事前濃縮と分離を可能にし、従来の方法よりも高い回収率を実証しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- バイオテクノロジー
- 細胞外小胞
背景
- 細胞外小胞は細胞間コミュニケーションにおいて重要な役割を果たしています。
- これらの小胞を分離するための従来の方法は、複雑な手順を含むことが多いです。
- XO Padは研究者にとってより簡単な代替案を提供します。
- 高い回収率は細胞外小胞の研究を向上させることができます。
研究の目的
- マイクロベシクルとエクソソームを分離するための簡単な方法を提供すること。
- 既存の技術と比較して回収率を向上させること。
- 細胞外小胞生物学の研究を促進すること。
使用された方法
- 12のワックスパターン層を持つXO Padの設計。
- セルロース紙に疎水性ワックスを印刷すること。
- 印刷した紙をラボ用オーブンで加熱すること。
- ワックス印刷紙を個々のXO Padデバイスにカットすること。
主な結果
- XO Padは細胞外小胞を効果的に濃縮し、分離します。
- 従来の方法よりも高い回収率を実証しました。
- 化学物質を必要とせずに簡単な製造プロセス。
- 研究における広範な応用への可能性。
結論
- XO Padは細胞外小胞を研究する研究者にとって価値あるツールです。
- 効率を向上させながら分離プロセスを簡素化します。
- この方法は細胞外小胞の機能の理解を進めることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Isolation of extracellular vesicles remains a bottleneck in biomarker discovery due to low yield and sample damage from conventional methods. The paper-based Exo-PAD enables chemical-free, fivefold enrichment of microvesicles and exosomes, improving recovery while preserving vesicle integrity. This supports early-stage target validation and assay development by providing a scalable, reproducible workflow for downstream omics and functional analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through enriched vesicle cargo analysis.
- Operational Value: Reduces sample loss and damage compared to ultracentrifugation, increasing usable material for target de-risking.
- Predictive Value: Fivefold enrichment improves signal detection in low-abundance biomarkers, supporting portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, concentrated vesicle preparations suitable for assay standardization.
- Operational Value: Eliminates need for centrifuges or chemicals, simplifying workflow and reducing operational complexity.
- Scalability: Paper-based design allows parallel processing and platform reuse across multiple sample types.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enriched vesicles maintain integrity for downstream functional assays and biomarker profiling.
- Disease-Relevant Systems: Compatible with biofluids like serum or plasma when used with carbonate buffer, supporting clinical relevance.
- Mechanistic De-risking: Reliable isolation enables consistent evaluation of vesicle-mediated mechanisms in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The Exo-PAD fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, enabling reliable vesicle preparation for analytical and functional downstream applications.
- Discovery Biology: Supports functional target validation by providing intact vesicles for cargo analysis and pathway interrogation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs essential for assay readiness and compound screening campaigns.
- Analytics: Enables fluorescence-based quantification and size distribution analysis for comparative condition evaluation.
- Translational Research: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation through preserved vesicle structure and function.
- Enterprise Reuse: Simple fabrication and operation allow adoption as a reusable platform across teams and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence through higher recovery and intact vesicle isolation.
- Operational Value: Standardizes enrichment process, reduces reagent waste, and eliminates equipment dependency.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision quality by reducing false negatives in biomarker detection.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement through reliable, scalable vesicle preparation for diagnostic and therapeutic applications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in wax patterning and ion concentration polarization principles for device fabrication.
- Needs access to laboratory oven, hot plate, cutter, and voltage source for operation.
- Demands standardization of sample volume, buffer composition, and processing time across users.
- Adaptation to viscous biofluids may require buffer optimization, such as carbonate serum/plasma compatibility.
- Practical limitation: Enrichment is layer-specific (layers 8–9), requiring precise puning for downstream analysis.
