Name: ライブ熱ストレスショ ウジョウバエ 胚における核内アクチンロッドのイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 学ぶライブ熱ストレス下におけるショウジョウバエ胚の核内アクチンロッドイメージング法。マイクロインジェクション技術を用いてアクチン応答を可視化し、細胞応答メカニズムの研究に活用できます。

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著者らは、ソカック研究所でこの技術のパイオニアを助けたリリウ・ジェンとゼングイ・シューと、分析を支援したハサン・シーデの作品を感謝して認めている。この研究のための仕事はNIHからの助成金によって資金を提供される(R01 GM115111)。

<ol><li>Figard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin-mediated+Actin+Stress+Response+is+maladaptive+in+heat-stressed+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos.</a> Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).</li>
<li>Ashworth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2Fcofilin+mediates+actin+cytoskeletal+alterations+in+LLC-PK+cells+during+ATP+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).</li>
<li>Vandebrouck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+analysis+of+rod+composition+and+actin+dynamics+in+inherited+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).</li>
<li>Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+stimuli+induce+persistent+ADF%2Fcofilin-actin+rods+that+disrupt+distal+neurite+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).</li>
<li>Bamburg, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2FCofilin-actin+rods+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Alzheimer+Research%22%5BJournal%5D)">ADF/Cofilin-actin rods in neurodegenerative diseases.</a> Current Alzheimer Research. 7 (3), 241-250 (2010).</li>
<li>Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+and+cofilin-actin+rods+in+alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease.</a> Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).</li>
<li>Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+actin-ADF%2Fcofilin+rods+transiently+retards+decline+of+mitochondrial+potential+and+ATP+in+stressed+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22AJP%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons.</a> AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).</li>
<li>Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+nuclear-cytoplasmic+shuttling+affects+cofilin-actin+rod+formation+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress.</a> Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).</li>
<li>Iida, K., Iida, H., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+induction+of+intranuclear+actin+rods+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells.</a> Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).</li>
<li>Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+cofilin+accompanies+heat+shock-induced+nuclear+accumulation+of+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).</li>
<li>Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+KKRKK+sequence+is+involved+in+heat+shock-induced+nuclear+translocation+of+the+18-kDa+actin-binding+protein%2C+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin.</a> Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).</li>
<li>Minamide, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+cofilin-actin+rods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).</li>
<li>Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin%2C+development%2C+and+nature+of+intranuclear+rodlets+and+associated+bodies+in+chicken+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons.</a> The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).</li>
<li>Feldman, M. L., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranuclear+rods+and+sheets+in+rat+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus.</a> Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).</li>
<li>Nishida, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+is+a+component+of+intranuclear+and+cytoplasmic+actin+rods+induced+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells.</a> Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).</li>
<li>Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+ADF+and+cofilin+in+intranuclear+actin+rods+of+cultured+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cell+Motility%22%5BJournal%5D)">Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).</li>
<li>Xue, Z., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back-to-back+mechanisms+drive+actomyosin+ring+closure+during+Drosophila+embryo+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage.</a> The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).</li>
<li>Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuf%2C+a+Rab11+effector%2C+maintains+cytokinetic+furrow+integrity+by+promoting+local+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization.</a> Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).</li>
<li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).</li>
<li>Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formins+filter+modified+actin+subunits+during+processive+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Formins filter modified actin subunits during processive elongation.</a> Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).</li>
<li>Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+interference+by+dsRNA+injection+into+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2477(2011).</li>
<li>Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+wound+assay+and+in+vivo+localization+of+epidermal+wound+response+reporters+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. 81, 50750(2013).</li>
<li>Carreira-Rosario, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering+homologous+recombination+constructs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), 50346(2013).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+techniques+for+studying+mitosis+in+the+Drosophila+melanogaster+syncytial+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (31), 1382(2009).</li>
<li>Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+tracking+endogenous+mRNAs+in+live+Drosophila+melanogaster+egg+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), 58545(2019).</li>
<li>Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+properties+of+early+Drosophila+embryos+measured+by+high-speed+video+microrheology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology.</a> Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).</li>
<li>Mollinari, C., González, Microinjection and transgenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMollinari%2C+C+%22Microinjection+and+Transgenesis%3A+Strategies+and+Protocols%22">Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols</a>. Cid-Arregui, A., García-Carrancá, A. , Springer. Berlin. 587-603 (1998).</li>
<li>Figard, L., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cell+shape+change+in+living+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging cell shape change in living Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), 2503(2011).</li>
<li>Oesterle, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOesterle%2C+A+%22Pipette+Cookbook+2018%3A+P-97+and+P-1000+Micropipette+Pullers%22">Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers</a>. , Sutter Instruments. Novato, CA. (2018).</li>
<li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photographic+study+of+development+in+the+living+embryo+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).</li>
<li>Powsner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+temperature+on+the+durations+of+the+developmental+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Zoology%22%5BJournal%5D)">The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster.</a> Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).</li>
<li>Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+Stress+Orchestrates+Cell+Polarity+to+Promote+Embryonic+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing.</a> Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).</li>
</ol>

利益相反は宣言されていません。

この方法の意義は、ショウジョウバエ胚21、22、23、24、25、26、27におけるマイクロインジェクションの確立されたプロトコルを利用して、ASRおよび付随するアクチンロッドアセンブリに関する新しい研究を可能にすることです。生きた胚にG-アクチンレッドを注入する主な利点は、ASRが様々な文脈下で研究できることである。将来の研究のために、これらの文脈は、変異型スクリーンの一部として他の遺伝子型の胚を注入するか、酸化ストレス4、32</...

このプロトコルは、誘導アクチンストレス応答(ASR)1を受けている熱ストレス胚における核内アクチン棒の集合体を可視化するためにG-アクチンレッドを注入する方法を説明する。我々は、胚において形態形成の破壊および生存率の低下をもたらすASRの研究を支援するためにこのプロトコルを開発し、成人のヒト細胞型は腎不全2、筋筋筋症3、アルツハイマー病およびハンチントン病4、5、6、7、8を含む病理に関連している。このASRは、ヒートショック9、10、11、酸化ストレス4、6、および異常ハンチンチンまたはβアミロイドオリゴマー化4、5、6、7、9、13、14、15、16を含む多数の細胞ストレスによって誘発される。ASRの特徴は、アクチン相互作用タンパク質のストレス誘発過活性化によって駆動される細胞質または影響を受ける細胞の核のいずれかに異常なアクチン棒の組み立てであり、Cofilin1、5、6、10。残念ながら、ASRに関する重要な知識のギャップは残っています。例えば、アクチン棒の機能は知られていない。私たちは、いくつかの細胞型の細胞質にロッドが形成される理由を理解していないが、他の人の核。また、ASRがストレスを受けている細胞や胚に対して保護的または不適応であるかどうかも明らかではない。最後に、コフィリンの過剰活性化やアクチンロッドアセンブリの根底にある詳細なメカニズムはまだ分かりません。したがって、このプロトコルは、生きたフルーツフライ胚の非常に難しい実験システムにおけるアクチンロッド形成およびダイナミクスを視覚化することによってASRを探査するための迅速かつ汎用性の高いアッセイを提供する。
生きているショウジョウバエ胚にG-アクチンレッドをマイクロインジェクトするプロトコルは、組織構築イベント中に正常な細胞質アクチン構造17のダイナミクスを研究するために最初に開発された。これらの研究では、G-アクチンレッド注射は、サイトカネシスまたは胃の17、18を含む胚の初期の発達過程に悪影響を及ぼさないことを発見した。その後、プロトコルを変更し、ASR1を受けている熱ストレス胚のアクチンロッドのイメージングを可能にするために、胚処理およびG-アクチンレッド注入を適応させる。G-アクチン赤注射以外の他の方法は、胚中のアクチンを視覚化するために使用することができる。これらの方法は、アクチンまたはウトロフィン-mCherry、ライフアクト、F-トラチンGFP、およびモージンGFPなどのアクチン結合タンパク質のドメインにタグ付けされた蛍光タンパク質(FP)を発現させることに依存している(19でレビュー)。しかし、これらのFPプローブを使用すると、いくつかのアクチン構造を安定または破壊する可能性があるため注意が必要であり、すべてのアクチン構造20に等しくラベルを付け、アクチンGFPの場合は、応力依存だけでなくアクチン濃度依存性のロッドアセンブリの分析に問題がある。したがって、G-アクチンレッドは、フライ胚のロッド研究のための好ましいプローブであり、胚の大きなサイズは、その容易な注射を可能にする。
このプロトコルのワークフローは、ショウジョウバエ胚21、22、23、24、25、26、27にタンパク質、核酸、薬物、および蛍光指標を注入するために使用されてきた他の確立されたマイクロインジェクション技術に似ています。しかし、ここでのG-アクチンレッドのマイクロインジェクションに続いて、胚は、ASRおよび核内アクチン棒集合体を誘導するために軽度の熱ストレスにさらされる。ハエや注入リグにアクセスできるラボでは、異なるストレスによる誘導や、異なる遺伝的背景での変調など、ASRに関する特定の研究ラインに対して、この方法を容易に実装し、適応可能にする必要があります。

<table><tbody><tr><td>アデノシン三リン酸(ATP)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>A23835G</td><td>G緩衝</td></tr>液<tr><td>の成分 リンゴジュース、モッツ、64液量オン</td>ス <td>モッツ</td><td>014800000344</td><td>リンゴジュースプレートの成分</td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td>BD</td><td>214010</td><td>リンゴジュースプレートの成分</td></tr><tr><td>漂白剤、ピュアブライト殺菌剤、6.0%次亜塩素酸ナトリウム</td><td>KIKインターナショナル</td><td>059647210020</td><td>胚の脱角化用</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>ミリポアシグマ</td><td>C1016500G</td><td>Gバッファー</td></tr><tr><td>細胞ストレーナーの成分, 70 &mu;m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>デコレーション胚の収集用</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡、LSM 880 34チャンネル、Airyscan</td><td>Zeiss</td><td>0000001994956</td>付き <td>核内アクチンロッドのイメージング用</td></tr><tr><td>乾燥剤</td><td>Drierite</td><td>24001</td> 乾燥<td>胚用</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡、Stemi 508 8:1ズーム付きステレオスコープ</td><td>ツァイス</td><td>4350649000000</td><td>寒天ウェッジ上に胚を配置するため</td></tr><tr><td>解剖針、</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08965A</td>の5 寒<td>天ウェッジ</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール(DTT)</td>上の胚を配置するためフィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1725</td><td>Gバッファーの成分</td></tr><tr><td>両面テープ、スコッチパーマネント、0.5インチx 250インチ</td><td>3M</td><td>021200010323</td><td>胚の接着剤を作るため</td></tr><tr><td>胚収集ケージ</td><td>ジェネッシーサイエンティフィック</td><td>59100</td><td>成虫のハエの飼育と胚の収集用</td></tr><tr><td>細い先端ピンセット、デュモントピンセット、スタイル5</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>72701D</td><td>寒天ウェッジ上の胚の配置用</td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー、ホウケイ酸ガラス、薄い1mm×0.75mm</td><td>ワールド・プレシジョンズ・インク</td><td>TW1004</td><td>マイクロニードル用</td></tr><tr><td>ハロカーボンオイル 27</td><td>ミリポアシグ</td><td>マH8773100ML</td><td>胚の水分補給用</td></tr><tr><td>加熱ステージインキュベーター</td><td>ツァイス</td><td>4118579020000、4118609020000、4118609010000</td><td>共焦点イメージング用</td></tr><tr><td>ラボ組織ワイパー、キムワイプ</td><td>キンバリー・クラーク</td><td>34155</td><td>ラボティッシュワイパー</td></tr><tr><td>光学顕微鏡、インボトスコップ 40C 逆位相コントラスト顕微鏡、再生品</td><td>ツァイス</td><td>製造中止</td><td>注射顕微鏡</td></tr><tr><td>メチル-4-ヒドロキシ安息香酸</td><td>ミリポアシグマ</td><td>H36471KG</td><td>リンゴジュースプレートの成分</td></tr><tr><td>マイクロインジェクター、FemtoJet4x</td><td>エッペンドルフ</td><td>5253000025</td><td>マイクロインジェクター</td></tr><tr><td>マイクロローダーチップ、epT.I.P.S. 20 &mu;L</td><td>エッペンドルフ</td><td>5242956003</td><td>マイクロニードルの装填用</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーターと注射ステージ x,y,zダイヤル付き 針調整用</td><td>Bernard Instruments, Inc (ヒューストン、テキサス州)</td><td>カスタム</td><td>マイクロインジェクションを行うため</td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー、モデルP-97、フレーミング/ブラウン</td><td>サッター インスツルメンツ</td><td>P97</td><td>毛細管を引っ張ってマイクロニードルを作るため</td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス 24x50-1.5</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>12544E</td><td>胚のマウント用</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド、ライラックカラーフロスト、洗浄済み、25 x 75 x 1mm</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>22037081</td><td>注射用胚のマウント用</td></tr><tr><td>n-ヘプタン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>H3601</td><td>胚接着剤のコンポーネント</td></tr><tr><td>対物レンズ、10x</td><td>ツァイス</td><td>製造中止</td><td>注射顕微鏡</td></tr><tr><td>用10倍対物レンズ対物レンズ、C-アポクロマート 40x/1,2 W Korr.FCS</td><td>Zeiss</td><td></td><td>4217679971711 40x 水対物レンズ 共焦点</td></tr><tr><td>対物レンズ用, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27 油、水、シリコーンオイル、またはグリセリン浸漬用 (D=0-0.17mm) (WD=0.57mm at D=0.17mm)</td><td>Zeiss</td><td>4208529871000</td><td>25x 混合液浸対物レンズ 共焦点</td></tr><tr><td>対物レンズ, Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA</td><td>Zeiss</td><td>4207829900799</td><td>63x 共焦点用油対物レンズ</td></tr><tr><td>絵筆、ロバート・シモンズ 表現 E85 尖った ラウンドサイズ 2</td><td>Daler-Rowney</td><td>038372016954</td><td>胚移植用</td></tr><tr><td>ペーパータオル、クリネックス Cフォールドペーパータオル、白</td><td>キンバリークラーク</td><td>884266344845</td><td>吸い取り細胞ストレーナー用</td></tr><tr><td>パスツールピペット、5 3/4 in</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820A</td><td>胚をオイルで覆うため</td></tr><tr><td>ペトリ皿、ガラス、100 x 20 mm</td><td>コーニング</td><td>3160102</td><td>湿潤インキュベーションチャンバー用</td></tr><tr><td>ペトリ皿、プラスチック、60 x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25384092</td><td>リンゴジュースプレート用</td></tr><tr><td>ピペット、エッペンドルフ リファレンス 0.5-10 &mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>2231000604</td><td>マイクロニードルピペットチップのローディング用</td></tr><tr><td>、xTIP4 250 &mu;L</td><td>Biotix</td><td>63300006</td><td>カバースリップに胚接着剤を加えるため</td></tr><tr><td>カミソリ刃</td><td>VWR</td><td>55411050</td><td>寒天ウェッジ、テープ、ピペットチップの切断用</td></tr><tr><td>ローダミン結合球状アクチン、ヒト血小板(非筋肉; 4x10 &mu;g)</td><td>サイトスケルトン株式会社</td><td>APHR-A</td><td>G-actin^Red</td></tr><tr><td>シンチレーションバイアル、20mL ガラスホウケイ酸、ポリエチレンライナーと尿素キャップ付き</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>033377</td><td>胚接着剤を作るため</td></tr><tr><td>スクリュートップジャー、16オン</td>ス <td>ナルゲン</td><td>000194414195</td><td>胚の乾燥用</td></tr><tr><td>ステージマイクロメーター</td><td>電子顕微鏡科学 602104PG</td><td></td><td>G-アクチン注射の量を校正するため</td></tr><tr><td>スクロース</td><td>ミリポアシグマ</td><td>840971KG</td><td>リンゴジュースプレートの成分</td></tr>トリ<tr><td>ズマベース</td><td>ミリポアシグマ</td><td>T15031KG</td><td>Gバッファー</td></tr><tr><td>酵母の成分、レサフレ酵母コーポレーション酵母、レッドスターアクティブドライ、32オン</td>ス<td>レサフレ酵母コーポレーション</td><td>117929157002</td><td>酵母ペーストの成分</td></tr></tbody></table>

ライブ熱ストレスショ ウジョウバエ 胚における核内アクチンロッドのイメージング

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

このプロトコルの目的は、熱ストレスに続く生きたショウジョウバエメラノガスター胚に集まり、核内アクチン棒を可視化することです。アクチンロッドは、神経変性疾患を含むヒト病理に付随する保存された誘導アクチンストレス応答(ASR)の特徴である。以前は、ASRが形態形成の失敗と胚の発達の生存率の低下に寄与することを示した。このプロトコルは、イメージング、遺伝学および生化学に非常に適したモデルシステムにおけるアクチンロッドアセンブリおよびASRの基礎となるメカニズムの継続的な研究を可能にする。胚は回収され、注入のためにそれらを準備するためにカバースリップに取り付けられる。ローダミン共役球状アクチン(G-アクチンレッド)を希釈し、マイクロニードルに装填する。各胚の中心に1回の注射が行われる。注射後、胚は高温でインキュベートされ、核内アクチン棒は共焦点顕微鏡で視覚化される。光漂白(FRAP)実験後の蛍光回復はアクチン棒に対して行われ得る。細胞質中のアクチンが豊富なその他の構造も画像化することができる。我々は、G-アクチンレッドが内因性G-アクチンのように重合し、単独では正常な胚の発達を妨げないことを発見した。このプロトコルの1つの制限は、胚への重大な傷害を避けるために注射中に注意を払わなければならないということです。しかし、練習では、ショウジョウバエ胚にG-actinRedを注入することは、アクチンロッドを視覚化するための迅速かつ信頼性の高い方法であり、任意の遺伝子型のハエや低酸素症や酸化ストレスを含む他の細胞ストレスの導入で簡単に使用することができます。

胚処理の概略的なワークフローを 図 1に示し、代表的な実験のタイムテーブルを 表 1に示します。良好な実験結果の推定は、注入された10個の胚ごとに、見られる胚の少なくとも半分が正しい発達段階にあり、損傷を受けておらず、32°Cの熱ストレスを伴う堅牢なASRを示すということです。 このASRは、 図2A( 右パネル)の胚の代表的な表面図像に示すように、核内アクチン棒の組み立てによって証明される。アクチンロッドは、核内のいくつかの向き(画像平面に平行または垂直)で現れ、いくつかの焦点面を通して画像化することができます。それに比べて、18°Cでインキュベートされたコントロール胚はアクチン棒を表示しない(図2A、左パネル)。 図2Bに示すように、ロッドを含む原子核のパーセントを定量化できます。また、FRAP実験はロッド(図2C)</s...

このプロトコルの目的は、熱ストレスに続いて、ショ ウジョウバエ 胚および画像核内アクチン棒集合体にローダミン共役球状アクチンを注入することです。

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

私たちのプロトコルは、ショウジョウバエの胚にマイクロインジェクションという確立された技術を使用して、アクチンストレス応答とそれに伴うアクチンロッドの組み立てに関する新しい研究を可能にするため、重要です。この手法の主な利点は、変異体スクリーニングやさまざまなストレス条件下でのアクチンストレス応答を研究できることです。この技術をこれまで行ったことのない人は、胚の取り扱いやマイクロインジェクションの実施に苦労するかもしれません。これらの手順は、ユーザーが快適に感じるまで練習することをお勧めします。マイクロインジェクションとイメージングの両方で胚の取り扱い、位置決め、およびマウントのステップは、書面による指示だけでは明確でない場合があるため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。原稿の指示に従って、胚採取カップとリンゴジュース寒天プレートを準備します。最も寛大な産卵を促進するために、実験の2日前にハエでコレクションカップを設置します。各コレクションカップに少なくとも100匹のメスと50匹のオスのハエを追加し、リンゴジュースプレートで覆います。G-アクチンレッドの作業溶液を調製し、マイクロニードルにロードされるまで氷上に保存します。ハエが摂氏18度のイーストペーストでリンゴジュースプレートに30分間胚を産むのを許します。ハエが産卵している間に、かみそりの刃でリンゴジュース寒天の4 x 1センチメートルの長方形のくさびを切り取り、25 x 75ミリメートルのスライドガラスの上に置きます。コレクションからプレートを採取し、新鮮な漂白剤溶液をプレートに注ぎ、1分間渦巻いて胚をデコリオネートします。絵筆の毛を蒸留水で湿らせ、それを使用して、脱毛および洗浄した胚をコレクションバスケットからスライドガラス上に準備したリンゴジュース寒天ウェッジに移します。細い先端ピンセットまたは解剖針を使用して、長方形の寒天ウェッジの長軸に沿って10個の胚を直線上に配置します。胚の背側が研究者に向くように、胚の頭から尾まで配置します。P200ピペットチップの端をカミソリの刃で半センチ切り取り、胚の接着剤に浸します。24 x 50 mmの長方形のカバースリップの長辺に沿って5mmの領域をたっぷりとコーティングし、接着剤面を上にして乾かします。胚のりが乾いたら、寒天上の整列した胚の列の上にカバースリップの接着剤を下にしてそっと置き、カバースリップの端と胚の列との間に2〜3ミリメートルのスペースを残します。胚が上を向くようにカバースリップを裏返します。それらは、カバーガラスの一方の長い端に沿って一列に引っ張り、腹側領域が最も近い端を向くようにする必要があります。150オンスのスクリュートップジャーに入った16グラムの新鮮な青色の乾燥剤の上にカバーガラスを置き、蓋をしっかりとねじ込みま

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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ライブ熱ストレスショウジョウバエ胚における核内アクチンロッドのイメージング

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